王文鳳，張麗娜，朱啟法，汪文杰，周本國，檀根甲*，許大鳳*

1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，合肥市長江西路130 號 230036

2. 中國煙草總公司安徽省公司，合肥市政務(wù)區(qū)潛山南路666 號 230071

3. 安徽皖南煙葉有限責(zé)任公司，安徽省宣城市鰲峰中路72 號 242000

4. 安徽省煙草公司池州市公司，安徽省池州市清風(fēng)東路89 號 247000

5. 安徽省農(nóng)科院煙草研究所，合肥市農(nóng)科南路40 號 230031

枯草芽孢桿菌是一類好氧性革蘭氏陽性細(xì)菌[1-2]。在自然界分布廣泛，對環(huán)境友好，是土壤和植物微生態(tài)中的優(yōu)勢微生物種群?？莶菅挎邨U菌抗逆性較強(qiáng)，具有很好的抗菌防病作用[3-4]，可防治多種植物病害[5-6]。喬俊卿等[7]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌BS916 可以在番茄根部有效定殖，是其在田間防治番茄青枯病的重要保障。劉慶豐等[8]利用枯草芽孢桿菌XF-1 來抑制白菜根腫病菌的侵染和繁殖。顧真榮等[9]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌G3 不僅能較好的防治菜豆和茄子苗期的炭疽病和菌核病，同時(shí)還能防治番茄的葉霉病，防效達(dá)78.8%。黎起秦等[10]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生枯草芽孢桿菌B47對番茄青枯病的防效可達(dá)79.79%。易龍等[11]利用內(nèi)生枯草芽孢桿菌T295 較好的控制了煙草根黑腐病的發(fā)生。由于枯草芽孢桿菌具有穩(wěn)定的定殖能力和適應(yīng)能力，使其具有巨大生存空間的競爭優(yōu)勢，從而能有效發(fā)揮其抗菌防病作用。但由于在引入新拮抗枯草芽孢桿菌時(shí)，需要打破原來的生態(tài)平衡，且拮抗枯草芽孢桿菌的定殖較為復(fù)雜和困難，這就使很多拮抗菌的生防效果不穩(wěn)定。枯草芽孢桿菌BC80-6（Bacillus subtilis，BC80-6）是低能離子束注入誘變獲得的拮抗菌，具有較強(qiáng)的廣譜性，對煙草根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）具有一定的生防作用。為此，探究了3 種BC80-6 菌株處理液對煙草根黑腐病菌菌絲生長、孢子萌發(fā)的抑制作用，再以菌株BC80-6 活菌含量為指標(biāo)，優(yōu)化菌株BC80-6的發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件，并開展田間控病防效試驗(yàn)，旨在為建立煙草根黑腐病的綠色防控體系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 材料

烤煙品種為云煙97，由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。枯草芽孢桿菌BC80-6（Bacillus subtilis，BC80-6）和煙草根黑腐病菌[Thielaviopsis basicola（Berk.et br.）Fer.]均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院病理研究室分離、鑒定與保存。

1.1.2 試劑

葡萄糖、乳糖、淀粉、甘油、麥芽糖、酵母浸出物、牛肉膏、尿素、氯化銨、大豆蛋白胨、蛋白胨、葡萄 糖、瓊 脂 粉、NaCl、K2HPO4、NaH2PO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、MnCl2（合肥沐辰生物技術(shù)有限公司），70%甲基托布津可濕性粉劑（河北冠龍農(nóng)化有限公司），80%多菌靈可濕性粉劑（江蘇泰倉農(nóng)化有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)液制備

將枯草芽孢桿菌BC80-6 在NA 培養(yǎng)基上活化48 h后，接入50 mL的NB培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，進(jìn)行活菌液、過濾液和高溫滅菌液的制備[12]。①活菌液：將培養(yǎng)液4 000 r/min 離心15 min 后棄上清液，沉淀中加入無菌水混勻后，4 000 r/min 離心15 min 后棄上清液，重復(fù)上述步驟1 次，獲得濃度為1×108cfu/mL 的活菌液。②過濾液：將培養(yǎng)液先用0.22 μm 的微孔濾膜過濾，將過濾后的溶液8 000 r/min 離心30 min，離心后獲得的上清液即為過濾液。③高溫滅菌液：將過濾液經(jīng)121 ℃滅菌20 min，獲得高溫滅菌液。

NA 培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂粉20 g，水1 L。

NB 培養(yǎng)基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，水1 L。

1.2.2 生長抑制率的測定

病原菌菌碟的制備：挑取一小塊病原菌接入PDA 平板中，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d。用直徑為4 mm 的打孔器沿菌落邊緣打取菌碟，將菌碟接入PDA 平板中央，25 ℃培養(yǎng)9 d，再用直徑為4 mm 的打孔器沿菌落邊緣打取菌碟，備用。

將活菌液、過濾液、高溫滅菌液分別按1∶10、1∶100、1∶500 進(jìn)行稀釋，制備成3 種PDA 培養(yǎng)基。在3 種培養(yǎng)基中分別接入病原菌菌碟，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d 觀察一次。不加任何處理液的培養(yǎng)基為對照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。9 d后用十字交叉法測量菌落直徑，計(jì)算不同培養(yǎng)液對菌絲生長的抑制率。

菌絲生長抑制率=（對照組菌落平均直徑-處理組菌落平均直徑）/對照組菌落平均直徑×100%

1.2.3 孢子萌發(fā)抑制率的測定

將煙草根黑腐病病原菌接入PDA 平板中，在25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)9 d 后，配制孢子懸浮液（濃度為2×105個(gè)/mL）。將活菌液、過濾液、高溫滅菌液分別按1∶20、1∶200、1∶1 000 進(jìn)行稀釋，再分別與孢子懸浮液按1∶1 的比例進(jìn)行混合。取150 μL的混合液滴于凹玻片中，置于培養(yǎng)皿內(nèi)保濕，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。無菌水處理為對照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。6 h 后觀察孢子的萌發(fā)情況，每個(gè)處理鏡檢300 個(gè)孢子，并計(jì)算不同處理液濃度對煙草根黑腐病菌分生孢子萌發(fā)的抑制率。

孢子萌發(fā)抑制率=（對照組孢子萌發(fā)平均數(shù)-處理組孢子萌發(fā)平均數(shù)）/對照組孢子萌發(fā)平均數(shù)×100%

1.2.4 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

種子液的配制。將枯草芽孢桿菌BC80-6 接種在NA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h 后，用接種環(huán)蘸取活化后的菌種，接入裝有25 mL 種子培養(yǎng)基（蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，氯化鈉10 g，水1 L，pH 7.0）的三角瓶中，28 ℃、180 r/min 黑暗振蕩培養(yǎng)36 h。

碳源的優(yōu)化。分別用1%葡萄糖、1%乳糖、1%淀粉、1%甘油和1%麥芽糖（W/V）等量替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蔗糖，制成不同碳源培養(yǎng)基?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基（蔗糖10 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水1 L，pH 7.0）為對照。按5%的接種量分別接入裝有25 mL 不同碳源培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，160 r/min、28 ℃下黑暗振蕩培養(yǎng)。24 h 后測定不同碳源培養(yǎng)基中活菌含量（活菌含量即1 mL 培養(yǎng)基中所含枯草芽孢桿菌的數(shù)量，cfu/mL），每個(gè)處理重復(fù)3 次。根據(jù)不同碳源培養(yǎng)基中的活菌含量確定最佳碳源。

氮源的優(yōu)化。分別用1%酵母浸出物、1%牛肉膏、1%尿素、1%氯化銨、1%大豆蛋白胨（質(zhì)量體積比）替代基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白胨，以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。按5%的接種量接入分別裝有25 mL 不同氮源培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，160 r/min、28 ℃條件下黑暗振蕩培養(yǎng)，24 h 后測定不同氮源培養(yǎng)基中的活菌含量，每個(gè)處理重復(fù)3 次。根據(jù)不同氮源培養(yǎng)基中的活菌含量確定最佳氮源。

無機(jī)鹽的優(yōu)化。根據(jù)微生物對大量元素與微量元素不同的利用情況[13]，在不同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基 中 分 別 加 入0.5% NaCl、0.5% K2HPO4、0.5%NaH2PO4、0.05% MgSO4、0.05% CaCl2、0.005‰FeSO4、0.005‰MnCl2（質(zhì)量體積比），基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為對照。按5%的接種量接入裝有25 mL 不同無機(jī)鹽培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，160 r/min、28 ℃條件下黑暗振蕩培養(yǎng)，24 h 后測定不同無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的活菌含量，每個(gè)處理重復(fù)3 次。根據(jù)不同無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的活菌含量確定最佳無機(jī)鹽種類。

通過氮源、碳源、無機(jī)鹽3 個(gè)單因素試驗(yàn)，篩選出最佳氮源、碳源、無機(jī)鹽的種類。設(shè)置最佳氮源含量（A）、最佳碳源含量（B）、最佳無機(jī)鹽含量（C）3 個(gè)因素處理，每個(gè)因素分別設(shè)置3 個(gè)水平，按L9（33）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.5 發(fā)酵條件的優(yōu)化

生長曲線的測定。將活化的枯草芽孢桿菌BC80-6 接入1.2.4 節(jié)中確定的最優(yōu)培養(yǎng)基中，25 ℃發(fā)酵培養(yǎng)，每3 h 取1 次菌液，測定菌液OD600，共培養(yǎng)48 h。未接菌的培養(yǎng)基為空白對照。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌體OD600為縱坐標(biāo)，繪制枯草芽孢桿菌的生長曲線。

培養(yǎng)溫度的優(yōu)化。搖床溫度設(shè)定為25、28、30、33、35、37、40 ℃，將BC80-6 接到50 mL 優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)24 h 后，測定活菌含量并繪制圖表。

培養(yǎng)液初始pH 值的優(yōu)化。優(yōu)化培養(yǎng)基的初始pH 設(shè)為5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0，將BC80-6接入不同pH、50 mL 優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，在最適生長溫度下培養(yǎng)24 h 后，測定活菌含量并繪制圖表。

接種量的優(yōu)化。按1%、3%、5%、7%、9%（體積比）的接種量將BC80-6 分別接入到50 mL 優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，在最適生長溫度下培養(yǎng)24 h 后，測定活菌含量并繪制圖表。

轉(zhuǎn)速的優(yōu)化。搖床轉(zhuǎn)速分別調(diào)節(jié)為120、140、160、180、200、220 r/min，將BC80-6 接入到50 mL優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，在最適生長溫度下培養(yǎng)24 h后，測定活菌含量并繪制圖表。

裝液量的優(yōu)化。在5 個(gè)250 mL 三角瓶中，分別裝入20、40、60、80 和100 mL 優(yōu)化后的培養(yǎng)基，按照最適接種量將BC80-6 接入到培養(yǎng)基中，在最適生長溫度下培養(yǎng)24 h 后，測定活菌含量并繪制圖表。

1.2.6 田間防控效果調(diào)查

BC80-6 發(fā)酵液和病原菌孢子懸浮液的制備。根據(jù)搖瓶培養(yǎng)優(yōu)化的發(fā)酵條件，用40 L 發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)BC80-6 至菌液濃度為1×108cfu/mL，用于灌根施藥。將煙草根黑腐病原菌接入PDA 培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)9 d。用無菌水沖洗PDA 平板上的病原菌，制備濃度為106～107個(gè)/mL 的孢子懸浮液。

在安徽省宣城市黃渡鄉(xiāng)選擇土壤肥力較好的地塊作為試驗(yàn)田。于2017 年3 月14 日進(jìn)行大田移栽，煙苗移栽兩周后進(jìn)行接種。用滅菌的剪刀斜切煙草根部造成傷口，取20 mL 孢子懸浮液灌于煙株根部。接種后10 d 進(jìn)行灌根施藥，每株煙苗200 mL 發(fā)酵液。同時(shí)設(shè)70%甲基托布津可濕性粉劑、80%多菌靈可濕性粉劑和清水為對照。每個(gè)處理20 株煙草，共3 次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。施藥后第20 天，按照GB/T 23222—2008[14]進(jìn)行病害調(diào)查及分級，并計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)及防治效果，用DPS 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 處理液對煙草根黑腐病菌菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響

由表1 可知，3 種枯草芽孢桿菌BC80-6 處理液對煙草根黑腐病菌菌絲的生長均具有抑制作用。隨著處理液稀釋倍數(shù)的增加，其對BC80-6 菌絲生長的抑制率逐漸減小。其中，活菌液的抑制效果最好，10-1倍的活菌液對BC80-6 菌絲生長的抑制率為93.20%。10-1倍的過濾液和高溫滅菌液對BC80-6 菌絲生長的抑制率分別為74.9%、7.4%，高溫滅菌液抑制效果最差。

表1 不同處理液對煙草根黑腐病菌的抑制作用Tab.1 Inhibitory effects of different treatment solutions on T. basicola

3 種枯草芽孢桿菌BC80-6 處理液對煙草根黑腐病菌孢子的萌發(fā)均具有抑制作用（表1）。其中，活菌液和過濾液對煙草根黑腐病菌孢子的萌發(fā)均具有較好的抑制作用，10-1倍的活菌液和過濾液對孢子萌發(fā)的抑制率分別為95.3%、93.4%。隨稀釋倍數(shù)的增加，活菌液和過濾液對孢子萌發(fā)的抑制率逐漸降低，且不同稀釋倍數(shù)之間差異顯著。滅菌液的抑制效果最差，10-1、10-2、5×10-2倍的滅菌液對孢子萌發(fā)的抑制率為30.3%、3.8%和2.4%。

2.2 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

2.2.1 碳源的優(yōu)化

由圖1 可知，菌株BC80-6 在不同碳源培養(yǎng)基中均可生長。其中，在蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中，菌株BC80-6 的活菌含量最高，為1.58×109cfu·mL-1；葡萄糖和乳糖次之，其活菌含量分別為1.42×109和1.39×109cfu·mL-1。因此，菌株BC80-6 生長的最佳碳源是蔗糖，其次是葡萄糖。

圖1 碳源對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.1 Effects of carbon sources on growth of B. subtilis

2.2.2 氮源的優(yōu)化

由圖2 可知，氮源為有機(jī)氮時(shí)菌株BC80-6 的生長明顯優(yōu)于無機(jī)氮。以無機(jī)氮（尿素、氯化銨）為氮源，菌株BC80-6 的活菌含量較少（＜0.28×109cfu·mL-1），說明菌株BC80-6 不能很好地利用這兩種氮源。以有機(jī)氮（酵母浸出物、牛肉膏、蛋白胨和大豆蛋白胨）為氮源，菌株BC80-6 的活菌含量均高于1.2×109cfu·mL-1。菌株BC80-6 生長的最適氮源是酵母浸出物，活菌含量為1.95×109cfu·mL-1。

圖2 氮源對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on growth of B. subtilis

2.2.3 無機(jī)鹽的優(yōu)化

由圖3 可知，菌株BC80-6 在無機(jī)鹽為MgSO4、CaCl2、NaCl2的培養(yǎng)基中生長較好，活菌含量較多，分別為1.98×109、1.54×109和1.52×109cfu·mL-1。菌株BC80-6 不適合在含F(xiàn)eSO4的培養(yǎng)基中生長，活菌含量僅為0.62×109cfu·mL-1，遠(yuǎn)小于CK（1.4×109cfu·mL-1）的活菌含量。因此，菌株BC80-6 在無機(jī)鹽為MgSO4的培養(yǎng)基中生長最好。

圖3 無機(jī)鹽對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.3 Effects of inorganic salts on growth of B. subtilis

2.3 碳源、氮源、無機(jī)鹽3 因素的正交優(yōu)化

由2.2 節(jié)結(jié)果可知，最佳碳源、氮源、無機(jī)鹽的種類分別是：蔗糖、酵母浸出物、MgSO4。蔗糖、酵母浸出物、MgSO4各設(shè)3 個(gè)含量水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)（表2）。

表2 正交試驗(yàn)因素和水平編碼Tab.2 Factors and levels of orthogonal experiment（%）

正交試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明：當(dāng)培養(yǎng)基中的酵母浸出物、蔗糖、MgSO4含量分別為0.5%、1.5%、0.06%時(shí)，菌株BC80-6 的活菌含量最高，即最適合菌株BC80-6 的生長。R 值能反應(yīng)3 種因子對活菌含量影響的大小，R 值越大，則該因子的影響越大。RA＞RB＞RC，即酵母浸出物含量對菌株BC80-6生長的影響最大，為主要因子，蔗糖含量其次，MgSO4影響最小。

F 檢驗(yàn)結(jié)果（表4）表明：酵母浸出物的F 值最大，為110.789（＞F0.01），呈極顯著差異，是主要影響因素。蔗糖的F 值介于F0.01與F0.05之間，呈顯著差異。硫酸鎂的F 值＜F0.05，對菌株BC80-6 生長的影響較小。

表3 L9（33）正交試驗(yàn)結(jié)果①Tab.3 Results of L9（33）orthogonal experiment

表4 正交試驗(yàn)的方差分析Tab.4 Variance analysis of orthogonal experiment result

2.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.4.1 生長曲線的測定

由圖4 可知，0～3 h 為菌株BC80-6 的生長停滯期，活菌含量增長較少。3 h 后菌株BC80-6 生長較快，活菌含量大幅增加。9～24 h，菌株BC80-6 生長穩(wěn)定，活菌含量增長緩慢。24 h 活菌含量達(dá)到最大，為2.5×109cfu/mL。24 h 后活菌含量開始減少，菌株BC80-6 進(jìn)入生長衰亡期。因此，選用培養(yǎng)9～24 h 的菌液為菌種較合適，此時(shí)菌株BC80-6在對數(shù)生長末期，既有較高的細(xì)胞活力，又可獲得較多的細(xì)胞數(shù)。2.4.2 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化

圖4 枯草芽孢桿菌BC80-6 的生長曲線Fig.4 Growth curve of B. subtilis BC80-6

由圖5 可知，菌株BC80-6 適宜在25～28 ℃生長。在28 ℃時(shí)，其發(fā)酵液里活菌含量最多，為2.52×109cfu/mL。因此，28 ℃是菌株BC80-6 的最適培養(yǎng)溫度。

圖5 溫度對枯草芽孢桿菌BC80-6 生長的影響Fig.5 Effects of temperature on growth of B. subtilis BC80-6

2.4.3 培養(yǎng)液初始pH 的優(yōu)化

由 圖6 可 知，當(dāng)pH 在5.5～6.5 之 間，菌 株BC80-6 的活菌含量隨pH 的增大而增大。當(dāng)pH 為6.5 時(shí)，活菌含量達(dá)到最大，為2.44×109cfu/mL。當(dāng)pH 在6.5～8.0 之間，隨著pH 的增大，菌株BC80-6的活菌含量明顯下降。因此，培養(yǎng)液的pH 應(yīng)控制在6.5 左右。

圖6 pH 對枯草芽孢桿菌BC80-6 生長的影響Fig.6 Effects of pH on growth of B. subtilis BC80-6

2.4.4 接種量的優(yōu)化

由圖7 可知，當(dāng)接種量為5%時(shí)，菌株BC80-6的活菌含量最多，為2.48×109cfu/mL。因此，5%的接種量為最適接種量。

圖7 接種量對枯草芽孢桿菌的影響Fig.7 Effects of inoculation amount on B. subtilis

2.4.5 轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

由圖8 可知，轉(zhuǎn)速從120 r/min 增加至180 r/min時(shí)，菌株BC80-6 的活菌含量逐漸增加，轉(zhuǎn)速從180 r/min 增加至220 r/min 時(shí)，活菌含量逐漸減少。轉(zhuǎn)速為180 r/min 時(shí)，菌株BC80-6 的活菌含量最多，為2.48×109cfu/mL，表明轉(zhuǎn)速影響菌株BC80-6 的生長。因此，菌株BC80-6 的最佳轉(zhuǎn)速為180 r/min。

圖8 轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.8 Effects of rotational speed on growth of B. subtilis

2.4.6 裝液量的優(yōu)化

由圖9 可知，裝液量不同，菌株BC80-6 的活性不同。當(dāng)250 mL 三角瓶的裝液量在20～40 mL 之間時(shí)，菌株BC80-6 的活菌含量隨裝液量的增加而增加。當(dāng)250 mL 三角瓶的裝液量大于40 mL 時(shí)，活菌含量隨裝液量的增加而下降。裝液量為40 mL 時(shí)，菌株BC80-6 的活菌含量最多，為2.46×109cfu/mL。因此，搖床培養(yǎng)時(shí)，250 mL 三角瓶的最佳裝液量為40 mL。

圖9 裝液量對枯草芽孢桿菌BC80-6 生長的影響Fig.9 Effects of loading solution on growth of B. subtilis BC80-6

2.5 枯草芽孢桿菌BC80-6 對煙草根黑腐病的田間防控效果

結(jié)果（圖10）表明，大多數(shù)對照組煙苗出現(xiàn)明顯的根黑腐病癥狀，煙苗根系出現(xiàn)黑色腐爛，植株明顯矮化，葉片萎蔫，長勢較差。菌株BC80-6 處理的煙苗地上部分較少出現(xiàn)萎蔫癥狀，長勢較好，根部正常。由表5 可知，菌株BC80-6 處理的煙株發(fā)病率和病情指數(shù)顯著低于對照組，大田防治效果達(dá)88.19%。與生產(chǎn)上使用的化學(xué)藥劑（多菌靈和甲基托布津）防治效果差異不大。

圖10 枯草芽孢桿菌大田防治煙草根黑腐病的效果Fig.10 Control effects of B. subtilis on tobacco black root rot in fields

表5 枯草芽孢桿菌對煙草根黑腐病的控病效果Tab.5 Control effects of B. subtilis on tobacco black root rot

3 討論

枯草芽孢桿菌可通過產(chǎn)生抗菌物質(zhì)來抑制病原菌的生長[15-18]。本研究中，枯草芽孢桿菌BC80-6 的過濾液和滅菌液對煙草根黑腐病菌的菌絲和孢子有一定抑制作用，表明菌株BC80-6 可產(chǎn)生某些抗菌物質(zhì)來抑制煙草根黑腐病菌的生長。菌株BC80-6 活菌液對煙草根黑腐病菌菌絲和孢子的抑制效果最好，可能是由于菌株BC80-6 不斷繁殖產(chǎn)生更多抗菌物質(zhì)，或與病原菌不斷爭奪營養(yǎng)，從而有效地抑制病原真菌生長。

通過發(fā)酵試驗(yàn)對菌株BC80-6 培養(yǎng)基的配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明培養(yǎng)條件的不同，碳氮無機(jī)鹽及其含量的不同對菌株BC80-6 的活菌含量影響很大。優(yōu)化后的菌株BC80-6 培養(yǎng)基成分及其含量與已報(bào)道的培養(yǎng)基成分具有差異[19-22]，可能跟不同菌株的生活環(huán)境不同、所需要的營養(yǎng)成分也不同有關(guān)。優(yōu)化后的菌株BC80-6 培養(yǎng)條件與葉云峰等[13]、秦艷等[19]、孫莎莎[23]等的研究結(jié)果有所不同。不同細(xì)菌的寄居環(huán)境不同，因而其最佳發(fā)酵條件也不同。優(yōu)化后的培養(yǎng)基成分較少、價(jià)格相對較低，而且是生產(chǎn)上較容易獲得的化工原料，因而在工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)中有一定的優(yōu)勢。

易龍等[24]在溫室中測定了芽孢桿菌對煙草根黑腐病菌的控病試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌的防效為80.2%，與對照藥劑多菌靈和甲基托布津的處理效果無明顯差異。本試驗(yàn)中，菌株BC80-6 對煙草根黑腐病的大田防效為88.19%，接近生產(chǎn)上使用的多菌靈和甲基托布津（分別為92.21%、89.66%）的防效。表明芽孢桿菌具有較好的生物防治能力，可用于煙草根黑腐病的生物防治。

4 結(jié)論

①在3 種枯草芽孢桿菌BC80-6 處理液對煙草根黑腐病菌菌絲生長、孢子萌發(fā)的抑制試驗(yàn)中，抑制效果最好的是10-1倍活菌液。②1.5%蔗糖、0.5%酵母浸出物、0.06%硫酸鎂（質(zhì)量體積比）是培養(yǎng)菌株BC80-6的最佳培養(yǎng)基配方。③在時(shí)間24 h、溫度28 ℃、初始pH 6.5、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、接種量5%、250 mL 三角瓶裝液量40 mL 的條件下，最有利于菌株BC80-6 的發(fā)酵。④菌株BC80-6 活菌液對煙草根黑腐病的大田防效達(dá)88.19%。