陳 莉,宋同清,,*,王 華,,曾馥平,,彭晚霞,,杜 虎,,蘇 樑

1 中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過(guò)程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,長(zhǎng)沙 410125 2 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,長(zhǎng)沙 410128 3 中國(guó)科學(xué)院環(huán)江喀斯特生態(tài)系統(tǒng)觀測(cè)研究站,環(huán)江 547100

微生物是地球上現(xiàn)存多樣性最多的生命形式,其分布也最為廣泛,幾乎涉及到地球上的所有生境[1-2]。土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的成分,是退化生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)的“先鋒者”,它推動(dòng)著生態(tài)系統(tǒng)的能量和物質(zhì)循環(huán),被公認(rèn)為土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的預(yù)警及敏感指標(biāo)[3-4]。而細(xì)菌在土壤微生物中占居絕對(duì)優(yōu)勢(shì)[5-8],有時(shí)甚至高達(dá)95%以上[3],其所占比例受土層深度、土壤理化性質(zhì)等諸多因素的影響。以往的學(xué)者大多注重于農(nóng)田和草地生態(tài)系統(tǒng)的研究,而對(duì)森林生態(tài)系統(tǒng)中的土壤細(xì)菌報(bào)道研究較少[9]。大量研究發(fā)現(xiàn),森林生態(tài)系統(tǒng)具有極其豐富的微生物資源,其中變形菌是溫帶森林土壤細(xì)菌中含量最豐富的類(lèi)群[10],而酸桿菌是溫帶森林土壤細(xì)菌中相對(duì)豐度最高的類(lèi)群[8]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,土壤微生物多樣性的研究手段也在不斷地改進(jìn),以往對(duì)于土壤微生物的研究方法有平板培養(yǎng)法、Biolog微平板法、磷脂脂肪酸譜圖分析法(PLFA)、基于PCR技術(shù)的方法[11]等,但這些方法手段的微生物通量和分辨率均不高,檢測(cè)的靈敏度也不夠。而高通量測(cè)序技術(shù)(第二代測(cè)序技術(shù))無(wú)需構(gòu)建克隆,耗時(shí)少,通量高,錯(cuò)誤率低[12],使得簡(jiǎn)單、快速、較準(zhǔn)確地獲取土壤微生物信息成為可能,為準(zhǔn)確揭示微生物種群結(jié)構(gòu)方面的研究提供了強(qiáng)有力的手段[13-15]。

森林土壤細(xì)菌或微生物群落調(diào)查的第一步是獲得一定數(shù)量的森林土壤樣品,且這些樣品能夠代表它們所在的群落。目前的研究中每樣地或樣方并沒(méi)有統(tǒng)一的土壤樣品的采集數(shù)量。那么究竟多少個(gè)土壤樣品才能充分反映森林土壤微生物群落的信息呢？這是一個(gè)基本且重要的問(wèn)題,同時(shí)也是一個(gè)需要進(jìn)一步研究的問(wèn)題。

廣西木論喀斯特常綠落葉闊葉混交林是目前世界上保存最好、面積最大、代表性最強(qiáng)的喀斯特森林集中連片區(qū),生物環(huán)境類(lèi)型特殊,物種組成豐富,群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜,是研究喀斯特地質(zhì)背景下生態(tài)學(xué)問(wèn)題的理想場(chǎng)所。本文基于Illumina HiSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)位于木論國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)典型森林(常綠落葉闊葉混交林)內(nèi)的25 hm2大樣地土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行了初步研究,分析了木論大樣地土壤細(xì)菌多樣性水平以及土壤細(xì)菌的門(mén)、綱、目、科、屬等不同分類(lèi)水平的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群和各類(lèi)群相對(duì)豐度,以揭示取樣數(shù)量對(duì)土壤細(xì)菌多樣性檢測(cè)結(jié)果的影響,其結(jié)果結(jié)果為認(rèn)識(shí)生態(tài)功能提供理論知識(shí),將有助于土壤細(xì)菌多樣性及其與植物多樣性的關(guān)系等進(jìn)一步研究,對(duì)指導(dǎo)喀斯特退化生態(tài)系統(tǒng)植被的迅速恢復(fù)和生態(tài)重建具有重要意義,同時(shí)也可為土壤微生物生物地理學(xué)的發(fā)展提供科學(xué)理論支持和參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況與土壤樣品采集

木論國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于廣西環(huán)江毛南族自治縣西北部,地理坐標(biāo)為25°07′01″—25°12′22″N,107°54′01″—108°05′51″E,南緣云貴高原,北連貴州茂蘭國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū),總面積8969 hm2,海拔400—1000 m。該區(qū)域?yàn)橹衼啛釒Ъ撅L(fēng)氣候,年平均氣溫15—18.7℃,最冷月(1月)平均氣溫3.4—8.7℃,最熱月(7月)平均氣溫23—26.7℃,年積溫4700—6300℃；年降雨量1530—1820 mm,集中于4—8月,年平均相對(duì)濕度為80%—90%,無(wú)霜期235—290 d,氣候溫暖,雨量充沛。土壤主要為石灰土和零星分布的硅質(zhì)土,河流及水時(shí)空分布不均,地域性來(lái)水差異大。研究區(qū)植被為中亞熱帶石灰?guī)r常綠落葉闊葉混交林,屬隱域性喀斯特森林植被頂極群落類(lèi)型,是目前世界上同緯度地區(qū)殘存下來(lái)的僅有的、原生性強(qiáng)、相對(duì)穩(wěn)定的喀斯特森林生態(tài)系統(tǒng),也是喀斯特區(qū)原生性森林分布面積最大的區(qū)域,植被成層現(xiàn)象比較明顯。

1.2 樣品采集

圖1 木論樣地地形圖Fig.1 Thecontour map of the 25 hm2 Mulun forest plot

通過(guò)勘測(cè),于2014年3月在研究區(qū)內(nèi)設(shè)置了一塊500 m×500 m的大樣地,作為長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)樣地(圖1)。參照CTFS標(biāo)準(zhǔn)采用規(guī)則網(wǎng)格法(20 m×20 m)進(jìn)行樣點(diǎn)布置和采樣,用全站儀和GPS基站相結(jié)合的測(cè)量方法設(shè)置和劃分樣地,參考木論自然保護(hù)區(qū)的森林狀況和植被、地形分布狀況,共設(shè)置625個(gè)小樣方,樣方4個(gè)角用水泥樁作永久標(biāo)記。將縱橫各5個(gè)20 m×20 m的小樣方作為1個(gè)100 m×100 m的大樣方,在樣方的4個(gè)角和中心的小樣方內(nèi)進(jìn)行采樣,共計(jì)85個(gè)樣方。采樣時(shí)在每個(gè)樣點(diǎn)周?chē)? m范圍內(nèi)隨機(jī)采取5個(gè)0—10 cm表層土壤混合成一個(gè)樣品,代表該樣點(diǎn)土樣,并混合均勻、去除根和石頭,-80℃保存用于DNA的提取和后續(xù)分析(由于采樣過(guò)程中樣品丟失,因此最后樣品數(shù)量為82個(gè))。

1.3 DNA提取、擴(kuò)增和高通量測(cè)序

土壤微生物宏基因組DNA提取采用的專(zhuān)用試劑盒(FastDNA?SPIN Kit for Soil,MP),采用引物515F(GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對(duì)16S rRNA基因的V4高變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系30 μL：15 μL Phusion Master Mix(2×),3 μL(6 μmol/L) Primer(2 μmol/L),10 μL(5—10 ng)gDNA(1 ng/μL),2 μL H2O。PCR反應(yīng)條件為：98 m℃預(yù)變性1 min；30個(gè)循環(huán)包括(98℃,10 sec；50 m℃,30 sec；72 m℃,30 sec)；72℃,5 min。依據(jù)PCR產(chǎn)物濃度,將所有擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物等量混合,再經(jīng)定量等質(zhì)量控制后,將質(zhì)量合格的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA文庫(kù)的構(gòu)建,采用Illumina Hiseq平臺(tái)進(jìn)行雙末端250 bp測(cè)序(委托諾禾致源生物信息科技有限公司完成)。

1.4 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù),截去Barcode和引物序列后使用FLASH(V1.2.7,http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)[16]對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接,過(guò)濾掉低質(zhì)量的序列。使用Qiime(V1.7.0,http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)[17]的Tags質(zhì)量控制流程做聚類(lèi)及多樣性分析。其中,利用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001,http://drive5.com/uparse/)[18]對(duì)所有樣品進(jìn)行聚類(lèi),依據(jù)慣例[19]以97%的一致性將序列聚類(lèi)成為OTUs(Operational taxonomic units),依據(jù)其算法原則,篩選出OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列,用RDP[20]對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)分類(lèi)。再用QIIME[17]進(jìn)行單樣品組成分析,得到樣品在不同分類(lèi)水平上的細(xì)菌類(lèi)群組成及相對(duì)豐度的數(shù)據(jù),將各分類(lèi)水平：Phylum(門(mén))、Class(綱)、 Order(目)、Family(科)、Genus(屬)上最大豐度排名前10的物種,生成物種相對(duì)豐度圖。

在上述基礎(chǔ)上制作采樣點(diǎn)數(shù)-土壤細(xì)菌類(lèi)群數(shù)曲線。具體的做法是：從82個(gè)樣品中隨機(jī)抽取1個(gè)樣品,記下這個(gè)樣品中包含的細(xì)菌類(lèi)群數(shù)目；然后從剩下的81個(gè)樣品中再隨機(jī)抽取1個(gè)樣品數(shù)據(jù),和第一個(gè)抽到的樣品數(shù)據(jù)合并,記下這2個(gè)樣品中包含的細(xì)菌類(lèi)群數(shù)目；依此類(lèi)推,直至采樣點(diǎn)的數(shù)目達(dá)到最大：重復(fù)99次取平均值,制作采樣點(diǎn)數(shù)-土壤細(xì)菌類(lèi)群數(shù)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量原始數(shù)據(jù)處理

測(cè)序原始數(shù)據(jù)得到8872996條reads,拼接并進(jìn)行預(yù)處理、質(zhì)控后剩余6381418條序列。預(yù)設(shè)每個(gè)樣品46431條序列,然后去除嵌合體,去除Singleton(只有1條序列的那些OTU),并標(biāo)準(zhǔn)化為每樣品37567條序列,得到每個(gè)樣品的序列數(shù)及OTU數(shù)(表1)。

表1 樣品序列數(shù)及OTU數(shù)

續(xù)表樣品編號(hào)Sample identity原始序列數(shù)Original sequence number原始OTU數(shù)Original OTU number標(biāo)準(zhǔn)化序列數(shù)Even sequence number標(biāo)準(zhǔn)化后OTU數(shù)Even OTU number151195553315937567258115158903627633756723261519979013038375672548152398611302037567252917011007703402375672760170594554326037567267317099253234493756728551713887483094375672561171792319324637567269017219721033723756727711723924573234375672685190391404300237567245919071041493239375672681191199487302237567246619159197932443756726391919955203066375672507192386903313237567260021018812128533756723622103950353559375673027210993149306437567250821139249233463756727742117103449284837567238721219764529193756724292125100156283337567237323039640132723756726862307875803002375672488231196295301737567249523159238629763756724462319978163104375672545250110096734143756727752505100718318237567259125098261831803756727002513945492947375672490251710242334293756728052521987773190375672640

2.2 土壤細(xì)菌分類(lèi)

對(duì)木論樣地82個(gè)土壤樣品進(jìn)行高通量測(cè)序,共產(chǎn)生269822個(gè)OTU。未獲得注釋信息的OTU約占總數(shù)的0.064%。82個(gè)土壤樣品的平均OTU為(3290.51±290.28)個(gè),其中單個(gè)樣品最多的有3979個(gè)、最少的有2763個(gè),分屬于44門(mén)99綱180目356科630屬。

2.2.1門(mén)

82個(gè)土壤樣品平均為細(xì)菌28.8±2.6門(mén),其中單個(gè)樣品最多的有36門(mén),最少的有23門(mén)。相對(duì)豐度最高的5個(gè)門(mén)所占比例總和達(dá)到87.67%,分別是變形菌門(mén)(Proteobacteria)(34.51%)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)(30.74%)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)(12.24%)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)(6.01%)和奇古菌門(mén)(Thaumarchaeot)(4.17%)。

2.2.2綱

82個(gè)土壤樣品平均有細(xì)菌60.9±3.8綱,其中單個(gè)樣品最多的有70綱,最少的有53綱。相對(duì)豐度最高的5個(gè)綱所占比例總和達(dá)到59.50%,分別是α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)(18.43%),嗜熱油菌綱(Thermoleophilia)(11.57%)、未確認(rèn)酸桿菌綱(unidentified-Acidobacteria)(11.10%)、未確認(rèn)放線菌綱(unidentified-Actinobacteria)(10.65%)和δ-變形菌(Deltaproteobacteria)(7.75%)。

2.2.3目

82個(gè)土壤樣品平均有細(xì)菌108.1±6.0目,其中單個(gè)樣品最多的有123目,最少的有92目。相對(duì)豐度最高的5個(gè)目所占比例總和達(dá)到37.75%,分別是根瘤菌目(Rhizobiales)(12.50%)、Gaiellales(8.48%)、Subgroup-6(6.63%)、酸微菌目(Acidimicrobiales)(6.48%)和黃色單胞菌目(Xanthomonadales)(3.66%)。

2.2.4科

82個(gè)土壤樣品中平均有細(xì)菌(206.8±11.6)科,其中單個(gè)樣品最多的有236科,最少的有185科。相對(duì)豐度最高的5個(gè)科所占比例總和達(dá)到14.96%,分別是黃色桿菌科(Xanthobacteraceae)(3.54%)、小單孢菌科(Micromonosporaceae)(3.49%)、0319-6A21(3.04%)、Gaiellaceae(2.76%)和生絲微菌科(Hyphomicrobiaceae)(2.13%)。

2.2.5屬

82個(gè)土壤樣品中平均有細(xì)菌(239.6±21.0)屬,其中單個(gè)樣品最多的有322屬,最少的有203屬。相對(duì)豐度最高的5個(gè)屬所占比例總和為9.21%,說(shuō)明細(xì)菌的屬水平的多樣性不顯著。相對(duì)豐度最高的5個(gè)屬分別是Gaiella(2.76%)、小單孢菌屬(Micromonospora)(1.65%)、土微菌屬(Pedomicrobium)(1.62%)、溶桿菌屬(Lysobacter)(1.60%)和鏈霉菌屬(Streptomyces)(1.55%)。

2.3 取樣數(shù)量對(duì)土壤細(xì)菌多樣性的影響

在不同的分類(lèi)水平上,隨著取樣點(diǎn)的增加,檢測(cè)出的土壤細(xì)菌類(lèi)群數(shù)目也在增加。當(dāng)取樣點(diǎn)達(dá)到82個(gè)時(shí),土壤細(xì)菌類(lèi)群的數(shù)目達(dá)到最大,分別為44門(mén)99綱180目356科630屬269822個(gè)OTU(圖2)。

在門(mén)的分類(lèi)水平上,取樣點(diǎn)數(shù)在1—6之間時(shí),檢測(cè)到的細(xì)菌門(mén)數(shù)量隨著取樣點(diǎn)數(shù)量增加而快速增加；取樣點(diǎn)數(shù)超過(guò)6個(gè)后,門(mén)的數(shù)量增速減慢；當(dāng)取樣點(diǎn)數(shù)為36個(gè)時(shí),約能檢測(cè)到43個(gè)門(mén)；取樣點(diǎn)數(shù)在37—82之間時(shí),門(mén)數(shù)僅增加1個(gè),此時(shí)門(mén)數(shù)量為達(dá)到44。

在綱的分類(lèi)水平上,取樣點(diǎn)數(shù)在1—13之間時(shí),檢測(cè)到的細(xì)菌綱數(shù)量隨著取樣點(diǎn)數(shù)量增加而快速增加；取樣點(diǎn)數(shù)超過(guò)13后,綱的數(shù)量增速減慢；當(dāng)取樣點(diǎn)數(shù)為57個(gè)時(shí),約能檢測(cè)到98個(gè)綱；取樣點(diǎn)數(shù)在57—82間時(shí),綱數(shù)僅增加1個(gè)達(dá)到99個(gè)。

在目的分類(lèi)水平上,取樣點(diǎn)數(shù)在1—31區(qū)間時(shí),檢測(cè)到的細(xì)菌目數(shù)量隨著取樣點(diǎn)數(shù)量增加而快速增加；取樣點(diǎn)數(shù)超過(guò)31后,目的數(shù)量增速減慢；當(dāng)取樣點(diǎn)數(shù)為72個(gè)時(shí),約能檢測(cè)到179個(gè)綱；取樣點(diǎn)數(shù)在73—82區(qū)間時(shí),目數(shù)僅增加1個(gè)達(dá)到180。

在科的分類(lèi)水平上,取樣點(diǎn)數(shù)在1—62區(qū)間時(shí),檢測(cè)到的細(xì)菌科數(shù)量隨著取樣點(diǎn)數(shù)量增加而快速增加；取樣點(diǎn)數(shù)超過(guò)62后,科的數(shù)量增速減慢,但增速仍較大；當(dāng)取樣點(diǎn)數(shù)為78個(gè)時(shí),約能檢測(cè)到355個(gè)目；取樣點(diǎn)數(shù)在79—82區(qū)間時(shí),科數(shù)僅增加1個(gè)達(dá)到356。

在屬的分類(lèi)水平上,取樣點(diǎn)數(shù)在1—71區(qū)間時(shí),檢測(cè)到的細(xì)菌屬數(shù)量隨著取樣點(diǎn)數(shù)量增加而快速增加；取樣點(diǎn)數(shù)超過(guò)71后,屬的數(shù)量增速減慢,但增速仍較大,且屬的增速大于科的增速。在OTU的分類(lèi)水平上,取樣點(diǎn)數(shù)在1—82區(qū)間時(shí),檢測(cè)到的細(xì)菌OTU數(shù)量隨著取樣點(diǎn)數(shù)量增加一直在較快增加(圖2)。

圖2 木論大樣地82個(gè)土壤樣品中檢測(cè)到的各分類(lèi)水平上細(xì)菌類(lèi)群數(shù)量隨采樣點(diǎn)數(shù)增加的稀疏曲線Fig.2 Rarefaction curves of the observed bacterial quantity at different taxonomic levels varying with number of samples in the Mulun Plot

3 討論

本文采用Illumina公司Hiseq測(cè)序儀對(duì)地處中亞熱帶的木論常綠落葉闊葉混交林土壤細(xì)菌多樣性進(jìn)行了初步研究,列出了木論森林土壤壤細(xì)菌門(mén)、綱、目、科、屬、OTU數(shù)量以及不同分類(lèi)水平上的優(yōu)勢(shì)類(lèi)群及其相對(duì)豐度。雖然本次調(diào)查采集的土壤樣品數(shù)量有限,但高通量測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用為進(jìn)一步調(diào)查木論大樣地內(nèi)土壤細(xì)菌等微生物資源積累了經(jīng)驗(yàn),并提供了新的技術(shù)支撐。在本研究中,與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)不上的OTU約占總數(shù)的0.064%,這說(shuō)明所參考的GreenGenes數(shù)據(jù)庫(kù)中包含了木論森林土壤細(xì)菌類(lèi)群中的絕大部分。研究顯示,木論森林土壤細(xì)菌在各分類(lèi)水平上的信息較明確,這可能與測(cè)序區(qū)間、序列長(zhǎng)度以及比對(duì)的數(shù)據(jù)庫(kù)等有關(guān),測(cè)序區(qū)間、序列長(zhǎng)度的增加,也有可能檢測(cè)出來(lái)更多的細(xì)菌類(lèi)群。而隨著分類(lèi)水平的降低,所檢測(cè)出的細(xì)菌類(lèi)群越多,是因?yàn)榉诸?lèi)水平越低,細(xì)菌的類(lèi)群種類(lèi)就越豐富,因此土壤細(xì)菌相對(duì)豐度前10的類(lèi)群在所有類(lèi)群中所占的比例也越低。

本研究在木論喀斯特常綠落葉闊葉混交林土壤中共檢測(cè)出變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)等44門(mén),變形菌門(mén)是最豐富的細(xì)菌類(lèi)群,這一結(jié)果也與國(guó)內(nèi)外關(guān)于森林、草地以及農(nóng)田土壤細(xì)菌多樣性方面的很多研究結(jié)果相一致[22-24]。Yuan等[25]對(duì)我國(guó)青藏草地研究發(fā)現(xiàn)酸桿菌是土壤中含量最豐富的細(xì)菌類(lèi)群,Fierer等[8]也發(fā)現(xiàn)在溫帶森林中酸桿菌是土壤中含量最豐富的細(xì)菌類(lèi)群,在對(duì)木論大樣地森林土壤的研究中,酸桿菌門(mén)是僅次于變形菌門(mén)和放線菌門(mén)居細(xì)菌類(lèi)群總含量第三位,這也證實(shí)了楊官品等[26]的觀點(diǎn),在土壤細(xì)菌中存在非常豐富的多樣性,不同類(lèi)型的土壤中具備各自的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群,而同時(shí)又含有相似的細(xì)菌類(lèi)群。

Nacke等[24]通過(guò)在德國(guó)的研究表明,土壤細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)在很大程度上是受樹(shù)種和土壤pH值影響的；也有學(xué)者認(rèn)為在不同的空間尺度上,pH值對(duì)土壤細(xì)菌的多樣性和群落組成均會(huì)產(chǎn)生很大的影響[27-29]。植物多樣性、土壤理化性狀、土壤溫度是形成森林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的3個(gè)主要因素[30]。到底是哪些環(huán)境因子影響著木論森林土壤細(xì)菌群落的組成和結(jié)構(gòu)？土壤細(xì)菌不同類(lèi)群又存在什么樣的功能？土壤細(xì)菌與其他生物類(lèi)群之間是如何相互作用的？以及土壤細(xì)菌在森林群落維持上扮演著什么樣的角色？這些問(wèn)題都有待進(jìn)一步的深入探討和研究。

在已有土壤細(xì)菌或土壤微生物研究中采用的取樣數(shù)量變化較大(如1個(gè)、10個(gè)、36個(gè)樣品等),但是具體到某種植被類(lèi)型、生境類(lèi)型或是某個(gè)生態(tài)系統(tǒng),需要采集分析多少土壤樣品才能較好地反映其微生物多樣性水平,仍然是一個(gè)值得探究的問(wèn)題。值得注意的是,在采樣數(shù)量一定的情況下,多數(shù)研究還是將數(shù)個(gè)取樣點(diǎn)土樣混合后形成混合樣品以增加樣品的代表性[1,9,31-32]。對(duì)木論大樣地森林土壤細(xì)菌多樣性的初步研究表明,取樣數(shù)量對(duì)檢測(cè)出的土壤細(xì)菌類(lèi)群數(shù)量有顯著影響：隨著樣品數(shù)量增多,被檢測(cè)出來(lái)的細(xì)菌類(lèi)群數(shù)量也增多,當(dāng)樣品達(dá)到82個(gè)時(shí),其增速雖然變緩但仍保持上升的趨勢(shì),且各分類(lèi)水平上的細(xì)菌類(lèi)群多樣性表現(xiàn)出類(lèi)似趨勢(shì)的同時(shí)也存在一定區(qū)別,這表明增加土壤采樣點(diǎn)數(shù)量應(yīng)能檢測(cè)出更多的細(xì)菌類(lèi)群,同時(shí)也說(shuō)明在進(jìn)行不同研究時(shí)要考慮取樣數(shù)量的影響。本研究結(jié)果表明,各分類(lèi)水平在取樣點(diǎn)數(shù)一定時(shí),檢測(cè)到的細(xì)菌數(shù)量隨著取樣點(diǎn)數(shù)的增加而增加,但增速不同,這說(shuō)明當(dāng)取樣點(diǎn)數(shù)較少時(shí),可能會(huì)有較多的細(xì)菌類(lèi)群沒(méi)有被監(jiān)測(cè)出來(lái)。在木論常綠落葉闊葉混交林中,在門(mén)的分類(lèi)水平上,36個(gè)樣品基本上可代表82個(gè)樣品監(jiān)測(cè)出來(lái)的細(xì)菌門(mén)多樣性信息；在綱的分類(lèi)水平上,57個(gè)樣品基本上可代表82個(gè)樣品監(jiān)測(cè)出來(lái)的細(xì)菌綱多樣性信息；在目的分類(lèi)水平上,72個(gè)樣品基本可以代表82個(gè)樣品監(jiān)測(cè)出來(lái)的細(xì)菌目多樣性信息；在科的分類(lèi)水平上,78個(gè)樣品基本可以代表82個(gè)樣品監(jiān)測(cè)出來(lái)的細(xì)菌科多樣性信息；在屬的分類(lèi)水平上,當(dāng)樣品數(shù)量達(dá)到82個(gè)時(shí)檢測(cè)出來(lái)的相應(yīng)細(xì)菌類(lèi)群數(shù)仍在不斷的增加；特別是在OTU的水平上,當(dāng)樣品數(shù)量達(dá)到82個(gè)時(shí)細(xì)菌OTU數(shù)量仍呈現(xiàn)出較快增加的趨勢(shì),由此推測(cè),如果增加較多樣品數(shù)量,檢測(cè)出來(lái)的細(xì)菌OTU數(shù)量還會(huì)有較大增加。

獲取一定數(shù)量的土壤樣品是森林土壤微生物群落調(diào)查的首要步驟,且這些樣品能夠代表它們所在的群落。以往的研究中土壤樣品的采集有每個(gè)樣地或樣方1個(gè)[29-30]、10個(gè)[33-34]、36個(gè)[9]等不同數(shù)量,究竟多少數(shù)量土壤樣品才能充分反映森林土壤微生物群落的信息,這是一個(gè)基本且重要的問(wèn)題[35],也是一個(gè)需要進(jìn)一步深入探討與研究的問(wèn)題。在以往對(duì)草地[24-25]、農(nóng)田[36-37]或是森林[18,38]等的土壤微生物研究中,均考慮取樣數(shù)量對(duì)于研究結(jié)果的影響。取樣數(shù)量除了受研究目的和研究深度決定外,同時(shí)也會(huì)受到研究成本的影響,特別是在高通量測(cè)序單個(gè)樣品所需經(jīng)費(fèi)較高的情況下,因此,在實(shí)際研究中需要對(duì)于取樣數(shù)量進(jìn)行權(quán)衡,既要能滿足研究目的、反應(yīng)所研究對(duì)象的微生物多樣性水平,又要能兼顧到實(shí)驗(yàn)的研究費(fèi)用。另外,文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序深度的選擇等也會(huì)對(duì)檢測(cè)出的細(xì)菌類(lèi)群產(chǎn)生一定程度影響。庫(kù)容和測(cè)序深度的增加,也有可能檢測(cè)出來(lái)更多的細(xì)菌類(lèi)群。還有,測(cè)序區(qū)間的選擇也會(huì)對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生一定的影響,例如：16S rRNA基因的高變區(qū)不同,其分類(lèi)信息的精確性也會(huì)不一樣[39]。

致謝：感謝木論國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)工作人員對(duì)野外工作的幫助。