宋士偉，焦德志，楊允菲

（1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 / 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2. 東北師范大學(xué)草地科學(xué)研究所 / 植被生態(tài)科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130024）

土壤鹽堿化現(xiàn)已成為世界范圍內(nèi)對(duì)生態(tài)環(huán)境影響較大的一個(gè)問(wèn)題，我國(guó)近年來(lái)土地鹽堿化面積不斷增加，而我國(guó)東北部是鹽堿化土壤分布面積較大的地區(qū)之一，土地鹽堿化問(wèn)題已經(jīng)對(duì)生態(tài)環(huán)境及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。松嫩平原是我國(guó)重要糧食及畜牧業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)地，其土壤類型總體上為鹽堿土，是我國(guó)東北部土壤鹽堿化較為嚴(yán)重的區(qū)域之一[1]，土壤鹽堿化對(duì)植被生長(zhǎng)發(fā)育及畜牧業(yè)生產(chǎn)有巨大的負(fù)面影響。松嫩平原內(nèi)最主要的自然植被是羊草(Leymus chinensis)群落和草甸植物群落，鹽堿離子濃度的過(guò)度積累，原生植被會(huì)逐漸消失，取而代之的是一些鹽生植物群落[2]。20世紀(jì)50-90年代僅在吉林省西部地區(qū)的草原面積就因土壤鹽堿化等因素退化56.57%，嚴(yán)重制約當(dāng)?shù)匦竽翗I(yè)及農(nóng)業(yè)的發(fā)展[3]。

扎龍濕地位于松嫩平原西北部，是以蘆葦(Phragmites australis)為主要植被的國(guó)際重要濕地[4]。但近年來(lái)，由于自然因素及人為因素干擾，大面積的蘆葦群落被更多的旱地所分割[5]，在一定區(qū)域內(nèi)形成以旱生植物為主的鹽堿化草地，部分區(qū)域出現(xiàn)明顯的鹽堿化現(xiàn)象。長(zhǎng)期觀察發(fā)現(xiàn)，在鹽堿化草地或者較為明顯堿斑裸地邊緣有野大麥(Hordeum brevisubulatum)種群的集群分布。野大麥?zhǔn)嵌嗄晟瘫究苾?yōu)質(zhì)牧草，是小麥族中耐鹽性最強(qiáng)的物種之一，具有營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好、牲畜喜食、再生能力強(qiáng)、產(chǎn)量高和生產(chǎn)性能良好等特點(diǎn)，是鹽化和堿化草甸草原的建群種，也是進(jìn)行作物耐鹽性改良的優(yōu)質(zhì)野生近緣種之一，其耐鹽機(jī)制的闡明對(duì)于提高作物耐鹽性有重要價(jià)值[6]。

目前利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-Seq)已經(jīng)對(duì)羊草[7]、半野生棉(Gossypium hirsutum)[8]、野生大豆(Glycine soja)[9]等物種進(jìn)行過(guò)混合鹽堿脅迫后基因表達(dá)狀況的研究。對(duì)于野大麥耐鹽堿的研究目前大多為生理特性方面，對(duì)其根本的耐鹽堿生理機(jī)制和主要的耐鹽堿控制基因尚不清楚。本研究用NaCl、NaHCO3模擬鹽堿脅迫，對(duì)脅迫后野大麥的生理響應(yīng)進(jìn)行比較分析，確定其抗鹽堿逆境的臨界濃度，在此基礎(chǔ)上通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)野大麥耐鹽堿相關(guān)基因進(jìn)行發(fā)掘，不僅在理論上能夠豐富野大麥抗逆性生理內(nèi)容，而且在實(shí)踐中能為野大麥及其近緣作物分子育種提供理論支持，對(duì)東北草地鹽堿化的修復(fù)及發(fā)展畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)具有重要指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 種子材料

2017年9月，在扎龍濕地附近草地(47°11′41″ N,124°14′19″ E)采集野大麥種子，自然風(fēng)干后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

使用育苗缽裝入蛭石∶土(V∶V)=1∶3的基質(zhì)培養(yǎng)野大麥至45日齡(株高20 cm左右)，共培養(yǎng)40盆，挑選長(zhǎng)勢(shì)基本相同的野大麥進(jìn)行試驗(yàn)，剝?nèi)ビ缋徍髮⒏炕|(zhì)沖洗干凈，置于錐形瓶中使用 200 mL 1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng) 2 d，之后處理組用 200 mL 1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液配置 100、200、300、400、500 mmol·L-1混合鹽堿溶液 (NaCl與 NaHCO3摩爾比為1∶1)進(jìn)行脅迫處理，對(duì)照組使用200 mL 1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，處理時(shí)間均為2 d。各處理組3次重復(fù)。

1.3 生理指標(biāo)測(cè)定

脅迫2 d后取野大麥葉片進(jìn)行生理指標(biāo)的測(cè)定，分別為考馬斯亮藍(lán)G250法[10]測(cè)定可溶性蛋白，酸性茚三酮法[11]測(cè)定脯氨酸含量，蒽酮比色法[12]測(cè)定可溶性糖含量，NBT光化還原法[13]測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性，剩余葉片用液氮冷凍后于-80 ℃冰箱保存。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

將保存于-80 ℃冰箱中的野大麥葉片做好標(biāo)記置于足量干冰中，送往武漢華大基因公司，委托其對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)序分析，采用Illumina (HiSeq X-Ten)平臺(tái)。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)將接頭污染、低質(zhì)量等reads去除從而獲得clean reads，使用Trinity進(jìn)行組裝獲得轉(zhuǎn)錄本，再將轉(zhuǎn)錄本用Tgicl進(jìn)行聚類去冗余得到 Unigene，對(duì) Unigene 使用 Blast 2 GO 進(jìn)行GO功能注釋，使用Blastx進(jìn)行KEGG注釋。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對(duì)生理指標(biāo)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0進(jìn)行比較分析(P＜0.05)，數(shù)據(jù)均為平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差，使用 Graphpad 6.0進(jìn)行圖表繪制。測(cè)序獲得原始數(shù)據(jù)已上傳至NCBI，SRA編號(hào)為SRP159891。

2 結(jié)果與分析

2.1 生理指標(biāo)測(cè)定

隨著混合鹽堿濃度升高，野大麥葉片內(nèi)可溶性蛋白含量呈先升高后降低的趨勢(shì)(圖1)，在300 mmol·L-1處理時(shí)達(dá)到最大值，為14.95 mg·g-1，顯著高于其他濃度處理(P＜ 0.05)；脯氨酸、可溶性糖含量隨脅迫液濃度的增加呈連續(xù)升高趨勢(shì)，并都在500 mmol·L-1處理時(shí)達(dá)到最大，分別為 1 975.15 μg·g-1和 0.60 mmol·g-1，顯著高于其他濃度處理；SOD 活性呈先上升后下降趨勢(shì)，在300 mmol·L-1處理時(shí)達(dá)到最大值，為14.61 U·g-1，顯著高于其他濃度處理；表明野大麥會(huì)通過(guò)增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量及提升抗氧化酶活性來(lái)抵御逆境環(huán)境。根據(jù)生理指標(biāo)變化趨勢(shì)以及參考相關(guān)研究文獻(xiàn)最終選擇300 mmol·L-1處理的野大麥葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，以發(fā)掘相關(guān)耐鹽堿基因。

圖1 混合鹽堿脅迫對(duì)野大麥生理指標(biāo)的影響Figure 1 Effects of mixed saline-alkali stress on physiological indices of wild barley

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)過(guò)濾及組裝

測(cè)序數(shù)據(jù)包含一些接頭污染(6.09%)及低質(zhì)量(7.51%)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析之前需要將其去除，以保證數(shù)據(jù)分析的可靠性。過(guò)濾后reads質(zhì)量指標(biāo)如表1所列，對(duì)照組與處理組過(guò)濾后reads分別為44.93和45.14 Mb，Q20分別為98.71%和98.72%，過(guò)濾后reads比例分別為85.99%和86.38%，過(guò)濾后數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝及聚類去冗余以獲得Unigene。對(duì)照組與處理組組裝后分別獲得 61 038、61 116個(gè) Unigene(表2)，長(zhǎng)度均在200～400 bp范圍內(nèi)數(shù)量最多，分別占38.68%和38.79%，平均長(zhǎng)度分別為898和893 bp，N50值分別為1 468、1 453，GC含量分別為51.69%和51.90%，數(shù)據(jù)質(zhì)量較高能夠進(jìn)一步進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

表1 過(guò)濾后reads質(zhì)量統(tǒng)計(jì)Table 1 Filtered reads quality statistics

表2 Unigene質(zhì)量指標(biāo)Table 2 Unigene's quality index

2.3 基因表達(dá)情況

在對(duì)照組中有8 273個(gè)基因特異表達(dá)，處理組中有8 646個(gè)基因特異表達(dá)，51 888個(gè)基因共同表達(dá)。根據(jù)表達(dá)量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，對(duì)照組與處理組分別有9 338、10 563個(gè)基因?yàn)橹懈咚奖磉_(dá)基因，32 594、32 284個(gè)基因?yàn)檩^低水平表達(dá)基因，18 229、17 687個(gè)基因?yàn)闃O低表達(dá)水平基因。根據(jù)基因表達(dá)水平結(jié)果檢測(cè)差異表達(dá)基因發(fā)現(xiàn)，處理組相對(duì)于對(duì)照組有4 163個(gè)基因上調(diào)，1 936個(gè)基因下調(diào)。

圖2 基因表達(dá)量分布Figure 2 Distribution of gene expression

2.4 差異表達(dá)基因GO功能分類

對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能分類(圖3)，可分為生物過(guò)程 (4 011個(gè))、細(xì)胞組分(5 206個(gè))和分子功能(2 949個(gè))3個(gè)主類，每一類又可分別進(jìn)一步劃分為23、16和13個(gè)功能組。生物過(guò)程中，有1 050個(gè)基因注釋到代謝過(guò)程功能組，972個(gè)基因注釋到細(xì)胞過(guò)程功能組；細(xì)胞組分中，有1 097個(gè)基因注釋到細(xì)胞功能組，1 091個(gè)基因注釋到細(xì)胞部分功能組，894個(gè)基因注釋到膜功能組，753個(gè)基因注釋到膜部分功能組；分子功能中，有1 307個(gè)基因注釋到催化活性功能組，1 233個(gè)基因注釋到結(jié)合功能組。

對(duì)差異表達(dá)上下調(diào)基因進(jìn)行GO功能分類發(fā)現(xiàn)，混合鹽堿脅迫對(duì)各功能組產(chǎn)生不同影響(圖4)。在生物過(guò)程主類中，代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程等20個(gè)功能組上調(diào)基因數(shù)量大于下調(diào)，節(jié)律過(guò)程、碳利用、氮利用3個(gè)功能組下調(diào)基因數(shù)量大于上調(diào)；在細(xì)胞組分主類中，細(xì)胞、細(xì)胞部分、膜等15功能組中上調(diào)基因數(shù)量大于下調(diào)，大分子復(fù)合物功能組中下調(diào)基因數(shù)量大于上調(diào)；在分子功能主類中，催化活性、結(jié)合等9個(gè)功能組上調(diào)基因數(shù)量大于下調(diào)，抗氧化劑活性功能組中下調(diào)基因數(shù)量大于上調(diào)，分子載體活性、毒素活性、翻譯調(diào)節(jié)器活動(dòng)3個(gè)功能組上調(diào)基因數(shù)量與下調(diào)基因數(shù)量持平。說(shuō)明鹽堿混合脅迫對(duì)野大麥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中對(duì)代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、細(xì)胞、膜、催化活性等生理生化過(guò)程相關(guān)基因產(chǎn)生促進(jìn)作用，對(duì)節(jié)律過(guò)程、碳利用、氮利用等生理生化過(guò)程相關(guān)基因產(chǎn)生抑制作用。

圖3 差異表達(dá)基因GO功能分類Figure 3 Differential expression of gene GO function classification

圖4 差異基因上下調(diào)GO功能分類Figure 4 Differential gene up-regulates and down-regulates GO function classification

2.5 差異表達(dá)基因KEGG分類

對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG分類，4 405個(gè)差異基因被分為5個(gè)KEGG代謝通路分支(圖5)，分別為細(xì)胞過(guò)程(紅色，206個(gè))、環(huán)境信息處理(藍(lán)色，278個(gè))、遺傳信息處理(綠色，909個(gè))、代謝(紫色，2 635個(gè))和有機(jī)系統(tǒng)(橙色，377個(gè))，其中又可以分為23個(gè)小類。混合鹽堿脅迫后主要對(duì)野大麥體內(nèi)運(yùn)輸和代謝(206個(gè))、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(251個(gè))、翻譯(466個(gè))、碳水化合物代謝(361個(gè))、其他次生代謝產(chǎn)物(284個(gè))、脂質(zhì)代謝(206個(gè))、氨基酸代謝(201個(gè))和環(huán)境適應(yīng)(376個(gè))等相關(guān)基因產(chǎn)生明顯影響，尤其對(duì)代謝途徑相關(guān)基因影響較大。

從通路富集角度進(jìn)行分析可以深入了解差異基因生物學(xué)功能，本研究中4 405個(gè)差異基因被注釋到132個(gè)通路中，直觀地顯示出混合鹽堿脅迫后野大麥體內(nèi)發(fā)生改變的相關(guān)代謝途徑(表3)。分析發(fā)現(xiàn)，淀粉和蔗糖代謝途徑中，蔗糖合成酶(SuS)基因上調(diào)；精氨酸和脯氨酸代謝途徑中，鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(OAT)基因、谷氨酸激酶(ProB)基因、谷氨酸-5-半醛脫氫酶(ProA)基因上調(diào)表達(dá)；過(guò)氧化物酶體途徑中超氧化物歧化酶(SOD)基因上調(diào)表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

植物在受到鹽脅迫時(shí)會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)生理生化過(guò)程來(lái)適應(yīng)環(huán)境[14]，而滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是植物遭受滲透脅迫時(shí)具有維持細(xì)胞滲透壓平穩(wěn)、保護(hù)細(xì)胞相關(guān)結(jié)構(gòu)等功能的物質(zhì)[15]。可溶性蛋白在植物體內(nèi)主要包括一些代謝過(guò)程的酶類和滲透調(diào)節(jié)蛋白等物質(zhì)，其含量多少能夠反映出植物體代謝水平的變化，并且維持細(xì)胞內(nèi)較低滲透壓等。野大麥經(jīng)混合鹽堿脅迫后體內(nèi)可溶性蛋白呈先上升后下降趨勢(shì)，與劉鳳岐等[16]在燕麥(Avena sativa)中的研究結(jié)果相似，對(duì)于隨濃度增加可溶性蛋白出現(xiàn)下降趨勢(shì)的原因究竟是蛋白質(zhì)合成受阻還是被降解，目前還需深入研究。

可溶性糖是高等植物光合作用的主要產(chǎn)物之一，不僅能夠?yàn)橹参矬w提供能源，還能作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)及信號(hào)分子對(duì)植物體內(nèi)相關(guān)代謝過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)，對(duì)植物生長(zhǎng)、發(fā)育、抗逆等方面有重要意義[17]。植物遭受滲透脅迫時(shí)，會(huì)提高包括蔗糖在內(nèi)的可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量來(lái)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。目前已有研究在藜麥(Chenopodium quinoa)[18]、小麥(Triticum aestivum)[19]中研究了蔗糖在植物生理生化過(guò)程中的作用。本研究中，在轉(zhuǎn)錄層面發(fā)現(xiàn)了蔗糖合成途徑中蔗糖合酶(SuS)編碼基因上調(diào)表達(dá)，SuS是高等植物蔗糖代謝途徑中的關(guān)鍵酶，其參與蔗糖代謝以及相關(guān)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成[20]，已有研究表明花生(Arachis hypogaea)中SuS編碼基因可能受干旱等非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[21]，而本研究發(fā)現(xiàn)SuS編碼基因上調(diào)表達(dá)也受混合鹽堿脅迫所誘導(dǎo)，從而增加蔗糖含量進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)以抵御逆境脅迫。

圖5 差異基因KEGG分類Figure 5 Differential gene KEGG classification

脯氨酸作為一種重要的滲透調(diào)劑物質(zhì)，當(dāng)植物遭受滲透脅迫時(shí)，植物體會(huì)通過(guò)增加脯氨酸含量來(lái)維持細(xì)胞平穩(wěn)的滲透壓及改善植物內(nèi)環(huán)境[22]。脯氨酸的合成途徑主要分為谷氨酸途徑和鳥氨酸途徑2種[23]，本研究中鳥氨酸途徑中鳥氨酸轉(zhuǎn)移酶(OAT)及谷氨酸途徑中谷氨酸激酶(ProB)、谷氨酸半醛脫氫酶(ProA)3種酶的編碼基因均上調(diào)表達(dá)，使野大麥體內(nèi)產(chǎn)生大量脯氨酸以進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)，以適應(yīng)鹽堿脅迫，由此可見這3種關(guān)鍵酶編碼基因?qū)σ按篼溙嵘鼓嫘杂兄匾饬x。有研究在模式植物煙草中表明OAT編碼基因受干旱、高鹽及低溫等非生物脅迫所誘導(dǎo)，推測(cè)其主要功能是促進(jìn)脯氨酸的生產(chǎn)以此來(lái)適應(yīng)逆境脅迫。目前在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)中證實(shí)ProB、ProA編碼基因過(guò)表達(dá)能夠明顯增加細(xì)胞內(nèi)脯氨酸含量，并且細(xì)胞抗逆性提升[24]，但尚未見ProB、ProA編碼基因在植物體中進(jìn)行功能驗(yàn)證的相關(guān)報(bào)道。

SOD是生物體內(nèi)非常重要的一種抗氧化酶，在清除活性氧、自由基的過(guò)程中發(fā)揮首要作用，以避免或減輕細(xì)胞所受到的傷害[25]。研究表明，混合鹽堿脅迫會(huì)使羊草(Leymus chinensis)[26]、紫花苜蓿(Medicago sativa)[27]等植物體內(nèi)SOD活性升高，將SOD編碼基因轉(zhuǎn)入李樹(Prunus domestica)[28]、煙草 (Nicotiana tabacumvar.Dayanyie)[29]中的研究證明，其能明顯增強(qiáng)植株的耐鹽性。本研究中SOD活性在一定混合鹽堿濃度內(nèi)呈上升趨勢(shì)，并且在轉(zhuǎn)錄層面發(fā)現(xiàn)過(guò)氧化物酶體途徑中SOD編碼基因上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明野大麥在遭受混合鹽堿脅迫時(shí)會(huì)通過(guò)上調(diào)表達(dá)SOD編碼基因、提升SOD活性的方式來(lái)適應(yīng)逆境。

東北草地不僅生長(zhǎng)著許多典型的鹽生植物，如堿蓬(Suaeda glauca)、朝鮮堿茅(Puccinellia chinampoensis)等，同時(shí)還有一些能夠忍受鹽堿環(huán)境的非真鹽生植物，即耐鹽植物(兼性耐鹽植物)，如羊草、野大麥等。耐鹽植物在生理結(jié)構(gòu)上并沒(méi)有耐鹽堿的特殊器官或結(jié)構(gòu)，之所以能夠在一定限度鹽堿生境中良好生長(zhǎng)，主要原因是通過(guò)改變相關(guān)代謝進(jìn)程進(jìn)行自我適應(yīng)調(diào)節(jié)，迅速積累相關(guān)代謝產(chǎn)物進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)、維持pH穩(wěn)定等過(guò)程[30]。本研究結(jié)果表明，野大麥在遭受混合鹽堿脅迫時(shí)，會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量以及增加SOD活性的方式來(lái)適應(yīng)逆境，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平上發(fā)掘到相關(guān)耐鹽堿基因，為進(jìn)一步在分子水平深入研究野大麥耐鹽堿性奠定基礎(chǔ)，可為東北鹽堿化草地的生態(tài)修復(fù)提供理論依據(jù)。利用植物耐鹽堿性對(duì)鹽堿化草地進(jìn)行改良，不僅能夠修復(fù)破損的生態(tài)環(huán)境，而且還能實(shí)現(xiàn)草業(yè)與畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的有機(jī)結(jié)合，對(duì)維護(hù)生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定及發(fā)展農(nóng)牧業(yè)經(jīng)濟(jì)具有重要意義。

表3 差異基因富集的20條KEGG通路Table 3 20 KEGG pathway with DEGs enrichment