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        寄生醉馬草的孢囊線蟲(chóng)種類鑒定

        2019-06-04 09:27:30張譯文李惠霞陳秀菊徐鵬剛張淑玲
        草業(yè)科學(xué) 2019年5期

        張譯文,李惠霞,陳秀菊,徐鵬剛,郭 靜,張淑玲

        (甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 / 甘肅省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730070)

        醉馬草(Achnatherum inebrians)是多年生草本植物,屬于禾本科(Gramineae)芨芨草屬(Achnatherum),是我國(guó)北方天然草原上的一種烈性毒草,在內(nèi)蒙古、西藏、青海、甘肅、新疆和寧夏等省(區(qū))均有分布[1-3]。因其抗旱、耐寒等優(yōu)勢(shì),加之有毒性,牲畜較少取食,在退化草原中蔓延日益嚴(yán)重[4],直接影響了草地質(zhì)量和載畜量,已成為發(fā)展草地畜牧業(yè)生產(chǎn)及生態(tài)環(huán)境建設(shè)的主要限制因素之一。在新疆昌吉,每年因醉馬草侵占而減少的草地載畜量為200萬(wàn)~300萬(wàn)羊單位,可造成的直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)1億元[5]。目前關(guān)于醉馬草的研究,主要集中在醉馬草和內(nèi)生真菌共生體方面。研究表明,內(nèi)生真菌可提高醉馬草的耐旱性[6]、耐寒性[7]、抗蟲(chóng)性[8]、抗病性[9]和對(duì)重金屬脅迫的耐受性[10];醉馬草可為內(nèi)生真菌的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),二者為互利互惠的關(guān)系。據(jù)報(bào)道,在甘肅天然草地上,醉馬草植株的內(nèi)生真菌帶菌率近100%[11]。郭長(zhǎng)輝等[12]研究發(fā)現(xiàn),帶內(nèi)生真菌醉馬草根際土壤線蟲(chóng)密度高于不帶內(nèi)生真菌醉馬草,并且內(nèi)生真菌可以改變土壤線蟲(chóng),特別是植物寄生線蟲(chóng)的類群組成。

        線蟲(chóng)可寄生于植物的各個(gè)部位,導(dǎo)致植物生長(zhǎng)不良,同時(shí)還會(huì)傳播其他植物病害,引起植物發(fā)病[13]。孢囊線蟲(chóng)是線蟲(chóng)門(mén)側(cè)尾腺綱墊刃目異皮科(Heteroderidae)可形成孢囊的線蟲(chóng)統(tǒng)稱,是一種固著性植物線蟲(chóng)。孢囊線蟲(chóng)廣泛分布于世界各地,可為害小麥(Triticum aestivum)、馬鈴薯(Solanum tuberosum)、大豆(Glycine max)等多種作物,造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失。我國(guó)每年在小麥上,禾谷孢囊線蟲(chóng) (Heterodera avenaeWollenweber) 的為害面積就達(dá) 333.33萬(wàn) hm2[14],造成20%~30%的減產(chǎn)[15]。孢囊線蟲(chóng)是否可寄生在醉馬草等其他禾本科植物上,目前尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究通過(guò)運(yùn)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)天祝高寒草甸醉馬草根際孢囊線蟲(chóng)進(jìn)行鑒定,以明確醉馬草根部孢囊線蟲(chóng)的種類,為醉馬草的生物防治提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 孢囊線蟲(chóng)的采集和分離

        1.1.1 孢囊線蟲(chóng)的采集

        采樣地點(diǎn)設(shè)置在甘肅省天祝縣抓喜秀龍鄉(xiāng)、打柴溝鎮(zhèn)。兩地屬大陸性高原季風(fēng)氣候,年均降水量400~500 mm,年均氣溫-2 ℃。植被類型屬于草甸草原,土壤以黑鈣土、栗鈣土為主。

        于2017年7月,依據(jù)甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)線蟲(chóng)學(xué)實(shí)驗(yàn)室統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[16],在孢囊線蟲(chóng)分布較多的采樣點(diǎn),選取醉馬草生長(zhǎng)較集中的區(qū)域,對(duì)醉馬草根際10 cm范圍內(nèi)土壤用工兵鏟進(jìn)行采集,每份樣品取醉馬草植株1叢和根圍土樣約500 g,將樣品用封口袋混勻密封帶回實(shí)驗(yàn)室,放入4 ℃恒溫箱保存。采樣時(shí)記錄經(jīng)緯度、海拔、生境等信息。樣品采集信息如表1所列。

        1.1.2 孢囊線蟲(chóng)的分離

        將土樣放在紙上自然陰干,醉馬草植株暫時(shí)放置在4 ℃恒溫箱里冷藏備用。孢囊線蟲(chóng)的分離方法采用簡(jiǎn)易漂浮分離法,具體做法如下:將自然陰干的土樣稱取500 g倒入水桶中,連續(xù)攪拌,使土樣充分溶解于水中,靜置1 min,然后將含有土樣的溶液倒入孔徑為0.71 mm和0.3 mm的樣品套篩(0.71 mm在上,0.3 mm在下)中,將上述步驟重復(fù)3次。用小水流沖洗0.71 mm樣品篩上的雜質(zhì),盡可能使0.71 mm樣品篩上的孢囊線蟲(chóng)沖洗至0.3 mm樣品篩上,沖洗完后棄除,再用小水流小心清洗0.3 mm篩上的剩余物質(zhì),待通過(guò)篩孔的水流澄清時(shí)將0.3 mm篩上的剩余物質(zhì)完全沖洗至0.15 mm尼龍紗上,在體視顯微鏡下挑取剩余物中的孢囊線蟲(chóng),統(tǒng)計(jì)并收集孢囊線蟲(chóng)。再將醉馬草植株根部白雌蟲(chóng)計(jì)入孢囊數(shù)據(jù)。將孢囊切開(kāi),直接可得到卵和二齡幼蟲(chóng)[17]。

        1.2 孢囊線蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法

        在顯微鏡(蔡司,德國(guó),Scope A1)和體視顯微鏡(蔡司,德國(guó),Discovery V12)下,測(cè)量并拍照醉馬草上分離得到的孢囊線蟲(chóng)孢囊、卵和二齡幼蟲(chóng)的主要形態(tài)特征,制作陰門(mén)錐和二齡幼蟲(chóng)玻片。觀察和測(cè)量的形態(tài)特征包括:受精卵長(zhǎng)、寬;二齡幼蟲(chóng)蟲(chóng)體長(zhǎng)、體寬、基部球?qū)挕⒖卺橀L(zhǎng)、透明尾長(zhǎng);孢囊長(zhǎng)、寬;陰門(mén)錐膜孔類型,陰門(mén)膜孔長(zhǎng)、寬,陰門(mén)裂長(zhǎng),下橋的有無(wú),泡狀突的有無(wú)。參考劉維志[18]和段玉璽[19]關(guān)于孢囊線蟲(chóng)的分類描述特征進(jìn)行種類鑒定。

        表1 天祝草原醉馬草樣品采集信息Table 1 Sampling information for Achnatherum inebrians from Tianzhu steppe

        1.2.1 陰門(mén)錐玻片的制作

        將飽滿的孢囊線蟲(chóng)在盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿內(nèi)浸泡24 h,用毛筆尖將浸過(guò)的孢囊挑在載玻片的一邊,用解剖刀切下蟲(chóng)體后端,用昆蟲(chóng)針仔細(xì)清除附著在孢囊內(nèi)側(cè)的內(nèi)含物,將陰門(mén)錐的邊緣修整齊,以陰門(mén)錐的面積不超過(guò)陰門(mén)錐膜孔面積的5~10倍為宜。將修整好的陰門(mén)錐放入40%的H2O2中漂白5 min,再依次放入70%、95%和100%的酒精中脫水,最后放入丁香油中透明,將透明后的陰門(mén)錐移至載玻片上觀察、拍照。

        1.2.2 二齡幼蟲(chóng)玻片的制作

        將二齡幼蟲(chóng)吸至載玻片上的水滴中,熱殺死后,用三乙醇胺-福爾馬林 (Triethanolamine Formalin,TAF) 固定液固定線蟲(chóng)。吸取浮載劑滴至干凈的玻片中間,將固定后的二齡幼蟲(chóng)挑至浮載劑中。選取5 mm左右的支撐物,放在浮載劑的邊緣,蓋上蓋玻片,用濾紙吸取多余的浮載劑,用封片劑封片,待封片劑干燥后貼上標(biāo)簽,觀察、拍照。

        1.3 孢囊線蟲(chóng)分子鑒定

        1.3.1 孢囊線蟲(chóng)DNA的提取

        參考廖金玲等[20]的方法提取4個(gè)孢囊線蟲(chóng)DNA。挑取用于形態(tài)觀察的孢囊線蟲(chóng)的卵和二齡幼蟲(chóng)放入滅過(guò)菌的Eppendorf管中,加入10 μL雙蒸水、3 μL蛋白酶 K、7 μL 10 × PCR-buffer(含 Mg2+),在液氮中速凍30 s,取出后用75%的乙醇消毒的玻璃研磨棒快速研磨,待Eppendorf管中液體溶解后再將其放入液氮中迅速冷凍研磨。將研磨好的樣液放入-20 ℃ 的冰箱中冷凍 2 h,然后將 Eppendorf管置于 65 ℃ 下保溫 1 h,94 ℃ 滅活 10 min,放入-20 ℃分裝保存,備用。

        1.3.2 孢囊線蟲(chóng)ITS1和28S核糖體DNA序列的PCR擴(kuò)增

        本研究采用 25 μL 的 PCR 反應(yīng)體系:10 × PCR buffer(500 mmol·L-1KCl,100 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.8),15 mmol·L-1MgCl2) 2.5 μL、25 mmol·L-1MgCl22.5 μL、10 mmol·L-1dNTP 1 μL、5 × 103mol·L-1Taq DNA聚合酶 0.2 μL、106mol·L-1上下引物各 1 μL、模板DNA 2 μL,剩余用ddH2O 補(bǔ)至 25 μL。以無(wú)菌水代替模板DNA作為陰性對(duì)照。ITS1-rDNA序列的擴(kuò)增引物為PXb101(TTGATTACGTCCCTGCCCTTT)和ChR(ACGAGCCGAGTGATCCACCG);28S-rDNA序列的擴(kuò)增引物為28-61(GTCGTGATTACCCGCTGAACTTA)和28-1001(GTTCGATTAGTCTTTCGCCCCT)。PCR擴(kuò)增條件相同:94 ℃ 預(yù)變性 5 min;94 ℃ 變性 50 s,55 ℃ 退火 50 s,72 ℃ 延伸 1 min,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸 10 min,將擴(kuò)增產(chǎn)物放入-20 ℃ 保存。取 5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在用Goodview染色的1%瓊脂糖凝膠上電泳,電泳緩沖液為 0.1 × TAE, 100 V 下電泳 45 min,用BIORAD成像儀在紫光燈下觀測(cè)。

        1.3.3 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序及序列系統(tǒng)發(fā)育分析

        PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用軟件MAGA 6.0進(jìn)行序列拼接并在Genbank上注冊(cè),在NCBI中用BLAST進(jìn)行比較,下載同源性較高的序列,用最大似然法在軟件MEGA 6.0中分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),分析其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 醉馬草根部孢囊線蟲(chóng)的發(fā)生情況

        本研究采集到醉馬草根及根際土樣共35份,有3份土樣中分離到孢囊線蟲(chóng),其中1份醉馬草根部發(fā)現(xiàn)有白色雌蟲(chóng)寄生(圖1A、B、C)。孢囊線蟲(chóng)的檢出率為8.57%,3份樣品中每100 g土樣的孢囊數(shù)分別為7、23和11個(gè)。

        2.2 孢囊線蟲(chóng)的形態(tài)學(xué)鑒定

        分離自醉馬草根系的孢囊線蟲(chóng)群體形態(tài)特征為:新鮮孢囊有亞晶層(圖1C)。一個(gè)月后蟲(chóng)體變深褐色,呈檸檬形,角質(zhì)層厚,頸部明顯,有突出的陰門(mén)錐(圖1D)。陰門(mén)膜孔為雙膜孔(圖1E),無(wú)下橋,陰門(mén)裂明顯,有發(fā)達(dá)的泡狀突(圖1F)。二齡幼蟲(chóng)為線型(圖1J),唇區(qū)圓形(圖1H),頭部跟身體連接處有明顯縊縮,基部球較大,口針強(qiáng)壯。尾部圓錐形(圖1I),透明區(qū)較長(zhǎng),末端尖銳,醉馬草孢囊線蟲(chóng)主要形態(tài)測(cè)量值如表2所列。天祝地區(qū)寄生醉馬草的孢囊線蟲(chóng)群體形態(tài)描述和測(cè)量特征值與陳品三等[21]所描述的禾谷孢囊線蟲(chóng)基本一致,并參考Mulvey等[22]、Handoo[23]、李惠霞等[24]對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)形態(tài)的描述,將該線蟲(chóng)群體鑒定為禾谷孢囊線蟲(chóng) (Heterodera avenaeWollenweber)。

        2.3 孢囊線蟲(chóng)的分子生物學(xué)特征分析

        2.3.1 ITS1核糖體DNA序列特征與聚類分析

        將4個(gè)孢囊線蟲(chóng)擴(kuò)增的ITS1-rDNA序列分別編號(hào)為:B1(MG262561)、B2(MG550972)、B3(MG550973)、B4(MG550974)。醉馬草上孢囊線蟲(chóng)的ITS1-DNA序列長(zhǎng)度均為792 bp,序列的一致性為100%,B1~B4與中國(guó)禾谷孢囊線蟲(chóng)群體(KR704399)相似性為99%。將所得序列與NCBI中下載的孢囊屬(Heterodera)和球形孢囊屬(Globodera)ITS-rDNA序列進(jìn)行Clustal比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。結(jié)果表明:17個(gè)序列聚為3個(gè)分支,B1~B4與中國(guó)(KR704309)、捷克(KX573040)、德國(guó)(KF225722)禾谷孢囊線蟲(chóng)群體聚為1個(gè)分支,并與禾谷孢囊線蟲(chóng)復(fù)合種群中的其他5個(gè)群體 (比利時(shí)群體 AF274400、AF498381、KM504378、AF274402和美國(guó)群體GU079654)聚為一支,置信度為93%。孢囊線蟲(chóng)屬的其他線蟲(chóng)群體(AY347919、AF498378、AY166438)聚為一支,置信度為100%。外群球孢囊屬線蟲(chóng)群體(GQ294525、DQ097514)聚為一支。孢囊線蟲(chóng)ITS1序列類聚分析結(jié)果顯示,醉馬草上孢囊線蟲(chóng)的種類為禾谷孢囊線蟲(chóng)。

        圖1 醉馬草群體孢囊線蟲(chóng)形態(tài)特征圖Figure 1 Illustration of cyst nematodes on A. inebrians

        表2 天祝醉馬草孢囊線蟲(chóng)群體與已報(bào)道群體的孢囊、陰門(mén)錐、二齡幼蟲(chóng)、受精卵形態(tài)測(cè)量值Table 2 Morphometrics of cysts, vulval cones, second stage juveniles, and fertilized eggs of H. avenae in A. inebrians from Tianzhu, and other populations reported

        圖2 基于最大似然法構(gòu)建的醉馬草孢囊線蟲(chóng)群體1TS1核糖體DNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 2 Phylogenetic tree of cyst nematode population of A. inebrians based on the ITS1-rDNA sequences using the maximum likelihood method

        2.3.2 28S-rRNA D2~D3區(qū)序列特征與聚類分析

        將4個(gè)孢囊線蟲(chóng)擴(kuò)增的28S-rDNA序列分別編號(hào):C1(MG266696)、C2(MG5-51855)、C3(MG551854) 、C4(MK757873)]。醉馬草孢囊線蟲(chóng)群體的28S核糖體DNA序列長(zhǎng)度均為1 063 bp,序列的一致性為100%,將所得序列與NCBI中下載的孢囊屬和球形孢囊屬28S核糖體DNA序列進(jìn)行Clustal比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。結(jié)果表明,17個(gè)序列聚為3個(gè)分支,C1~C4與捷克(KX573052)、中國(guó)(GU595438)、意大利(LT159826)禾孢囊線蟲(chóng)群體聚為1個(gè)分支,并與孢囊線蟲(chóng)復(fù)合種群中的中國(guó)群體GU083592和意大利群體LT159829聚為一支。孢囊線蟲(chóng)屬的其他線蟲(chóng)群體(DQ328687、DQ328691、DQ328693、JX402414、JQ040527、GU595452)聚為一支。外群球孢囊屬線蟲(chóng)群體(EU855121、KJ409635)單獨(dú)聚為一支。孢囊線蟲(chóng)28S序列類聚分析結(jié)果顯示,醉馬草上孢囊線蟲(chóng)的種類為禾谷孢囊線蟲(chóng)。

        圖3 基于最大似然法構(gòu)建的醉馬草孢囊線蟲(chóng)群體28S核糖體DNA部分序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree of cyst nematode population of A. inebrians based on the 28S-rDNA sequences using the maximum likelihood method

        3 討論

        本研究中醉馬草孢囊線蟲(chóng)的形態(tài)特征與Mulvey和Golden[22]、劉維志[18]、陳品三等[21]描述的寄生于作物的禾谷孢囊線蟲(chóng)一致,而與李惠霞等[24]報(bào)道的寄生于該地區(qū)矮生嵩草(Kobresia humilis)根部的禾谷孢囊線蟲(chóng)在孢囊寬和二齡幼蟲(chóng)長(zhǎng)等特征上略有差異。但由于孢囊線蟲(chóng)屬多個(gè)種在形態(tài)上差異較小,有時(shí)很難準(zhǔn)確鑒定,所以需要結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)孢囊線蟲(chóng)做進(jìn)一步鑒定。目前,植物線蟲(chóng)的種類鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化研究常采用核糖體DNA(ITS序列、28S序列及18S序列)和線粒體DNA的部分序列進(jìn)行[25]。本研究選用核糖體DNA的ITS1和28S基因序列對(duì)寄生于醉馬草的孢囊線蟲(chóng)群體進(jìn)行種類鑒定。鑒定結(jié)果表明,醉馬草孢囊線蟲(chóng)的ITS1和28S序列分別與其他地方禾谷孢囊線蟲(chóng)序列聚為一支,有較高的同源性。分子生物學(xué)方法更進(jìn)一步證明了寄生醉馬草的孢囊線蟲(chóng)種類為禾谷孢囊線蟲(chóng)。

        禾谷孢囊線蟲(chóng)主要侵染大麥屬、小麥屬、雀麥屬、高粱屬、燕麥屬、剪股穎屬、冰草屬、看麥娘屬、短柄草屬、稗屬、羊茅屬、鵝觀草屬、落草屬、黑麥草屬、鸛草屬、梯牧草屬、早熟禾屬、棒頭草屬、狗尾草屬、鼠茅屬等[26-33]多個(gè)屬的禾本科植物。這些被禾谷孢囊線蟲(chóng)寄生的禾本科植物大多為小麥族和剪股穎族[34-35]。醉馬草屬于針茅族植物,是禾谷孢囊線蟲(chóng)的寄主新記錄種。未來(lái)關(guān)于孢囊線蟲(chóng)在針茅族植物的寄主范圍需要進(jìn)一步研究。

        本研究采集的35份醉馬草根及根際土樣中,3份檢出禾谷孢囊線蟲(chóng),線蟲(chóng)檢出率為8.57%,遠(yuǎn)低于采樣地周邊燕麥田44%的孢囊線蟲(chóng)檢出率[36]。郭長(zhǎng)輝[37]的研究發(fā)現(xiàn),帶內(nèi)生真菌醉馬草根際土壤線蟲(chóng)密度高于不帶內(nèi)生真菌醉馬草,但不帶內(nèi)生真菌醉馬草根際土壤中植物寄生線蟲(chóng)的密度更高。Townsend等[38]在種植8周后的高羊茅(Festuca arundinaceae)共生體植物土壤中檢測(cè)到穿刺短體線蟲(chóng)(Pratylenchus penetrans)線蟲(chóng)的數(shù)量降低到40%;在禾草共生體上北方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne hapla)、禾本科根結(jié)線蟲(chóng)(M. graminis)、南方根結(jié)線蟲(chóng)(M.incognita)、M. marylandi等的數(shù)量也降低[39]。由此推測(cè),內(nèi)生真菌可能對(duì)植物線蟲(chóng)寄生醉馬草有抑制作用,至于醉馬草內(nèi)生真菌與孢囊線蟲(chóng)之間相互影響的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

        4 結(jié)論

        本研究運(yùn)用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合核糖體DNA的ITS1、28S序列分析,對(duì)寄生于甘肅天祝醉馬草根部的孢囊線蟲(chóng)進(jìn)行種類鑒定,將其鑒定為禾谷孢囊線蟲(chóng)。這是首次報(bào)道禾谷孢囊線蟲(chóng)寄生醉馬草,并可完成其生活史。

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