宋鵬，龍彤，梁培育，歐善際

[編輯：安鳳；校對：黃園玲]

0 引言

前列腺癌（prostate cancer, PCa）是男性泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，近年來我國前列腺癌發(fā)病率呈上升趨勢[1]。因此，研究前列腺癌的致癌機制，開發(fā)新的研究方法，對挽救前列腺癌患者的生命具有重大意義。隨著二代測序技術的發(fā)展，大量對長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lncRNA）的深入研究結果發(fā)現(xiàn)一些異常表達的lncRNA與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展有關[2-4]。

肺腺癌轉移相關轉錄子1（metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1）屬于lncRNA中的一種，研究發(fā)現(xiàn)，book=412,ebook=30MALAT1的表達與癌細胞的增殖、轉移、成瘤率及血管生成密切相關[5]。本研究以激素依賴性的前列腺癌細胞株PC3、LNCaP為對象，構建MALAT1過表達及干擾模型，通過對MALAT1過表達（或干擾后）前列腺癌細胞生物學行為變化的檢測，探討MALAT1在前列腺癌增殖中的作用機制，為研究前列腺癌發(fā)生發(fā)展機制奠定一定的基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

激素依賴性前列腺癌細胞株PC3和LNCaP（武漢華聯(lián)科生物技術有限公司，中國武漢）；載體pCDH、pSICOR（Addgene，美國）；RPMI 1640培養(yǎng)基（HyClone，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；TRIzol（Ambion，美國）；YBR Green PCR試劑盒（KAPA Biosystems，美國）；反轉錄試劑盒（TaKaRa，中國大連）；PBS、胰蛋白酶、MTT、瑞氏-姬姆薩復合染液（Bioswamp，中國）；細胞周期檢測試劑盒、凋亡檢測試劑盒（BD，美國）；Matrigel（Corning，美國）；兔抗人Cyclin D1單克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人Bax單克隆抗體及兔抗人ERK1/2單克隆抗體（Abcam，英國）；兔抗人p-ERK1/2單克隆抗體（CST，美國）。

1.2 細胞復蘇與培養(yǎng)

將凍存的PC3及LNCaP細胞從液氮罐中取出后，移至37℃水浴中，將細胞懸液吸至離心管中，1 000 r/min離心3 min，棄上清液，在含10%胎牛血清的新鮮RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃、含體積分數(shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱內。

1.3 構建MALAT1過表達及siRNA載體

為了探討lncRNA-MALAT1對前列腺癌細胞增殖的作用機制，本研究構建了MALAT1過表達載體pCDH-MALAT1和干擾載體pSICOR-shMALAT1，以及起對照作用的過表達空載體和干擾空載體。MALAT1-siRNA序列：5’-TGTACTAT CCCATCACTGAAG-3’。

1.4 熒光定量PCR檢測MALAT1相對表達量

利用TRIzol提取PC3細胞的總RNA，反轉錄生成cDNA，進行Real-time PCR擴增。MALAT1擴增引物序列：上游引物：5’-CCGCTGCTATTAGAATGC-3’；下游引物：5’-CT TCAACAATCACTACTCCAA-3’。內參基因β-Actin上游引物：5’-ACACTGTGCCCATCTACG-3’；下游引物：5’-TGTCACGCACGATTTCC-3’。PCR反應條件：95℃ 3 min；95℃ 5 s；56℃ 10 s；72℃ 25 s，共39個循環(huán)。

1.5 MTT檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期細胞，調整濃度并分于96孔板，每種細胞設置3個復孔，37℃培養(yǎng)過夜。根據(jù)實驗分組：（1）對照組（Control）；（2）過表達空載體組（EV）；（3）干擾空載體組（si-EV）；（4）MALAT1過表達組（MALAT1）；（5）MALAT1-siRNA干擾組（si-MALAT1），分組處理細胞，繼續(xù)培養(yǎng)24、48和72 h。取出不同分組的細胞培養(yǎng)板，每孔加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。最后用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔490 nm處的吸光度值。

1.6 流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡

收集胰酶消化處理后的不同細胞，PBS清洗兩次以后，加入400 μl碘化丙啶（propidium iodide, PI）溶液（50 μg/ml），避光染核10 min，用流式細胞儀測定細胞含量，確定細胞在有絲分裂各個時期所占的比例。將細胞重懸于200 μl結合緩沖液中，并加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI溶液，輕輕混勻，4℃避光孵育30 min。最后，加入300 μl緩沖液，隨即用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.7 基質膠檢測成管能力

在96孔板中加入50 μl Matrigel基質膠，在凝膠過程中，消化各組細胞并用PBS重懸，制備細胞懸液，加入100 μl細胞懸浮液。37℃孵育，14 h后觀察細胞成管情況。

1.8 平板克隆檢測細胞成瘤率

取對數(shù)生長期的細胞，胰蛋白酶消化處理后吹打成單個細胞，并培養(yǎng)于含10%胎牛血清的培養(yǎng)液中備用。將細胞梯度稀釋，放置于37℃、5%CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2~3周。4%多聚甲醛固定細胞，加適量GIMSA染色液進行染色。

1.9 Western blot檢測細胞周期及凋亡相關蛋白表達

本研究利用Western blot實驗檢測了Cyclin D1、Bcl-2、Bax及ERK1/2和p-ERK1/2蛋白的表達水平，實驗過程如下：提取細胞蛋白并置于沸水浴中10 min，使蛋白變性。利用SDS-PAGE膠分離蛋白，電泳結束后濕轉法將蛋白轉印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，再加入二抗（1:10 000稀釋HRP標記），室溫孵育1 h。PBST洗滌三次后用ECL化學發(fā)光檢測并拍照。

book=413,ebook=31

1.1 0 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 MALAT1在PC3中的相對表達量

熒光定量PCR檢測前列腺癌細胞株PC3對照組、EV組、si-EV組、MALAT1組及si-MALAT1組中l(wèi)ncRNA-MALAT1的相對表達量。對照組與EV組、si-EV組的MALAT1相對表達量之間的差異無統(tǒng)計學意義；與對照組相比，MALAT1組中MALAT1表達量明顯上調（P<0.01），si-MALAT1組中MALAT1表達量明顯下調（P<0.01），說明MALAT1過表達和干擾細胞株構建成功，見圖1。

圖1 PC3中MALAT1的相對表達量Figure1 Relative expression of MALAT1 mRNA in PC3 cells

2.2 MALAT1對前列腺癌細胞體外增殖能力的影響

MTT檢測了培養(yǎng)24、48及72 h的PC3和LNCaP細胞株的細胞增殖情況，描繪對照組和四組實驗組細胞的生長曲線。結果顯示，MALAT1組的前列腺癌細胞體外增殖能力明顯高于對照組和EV組（P<0.01）；si-MALAT1組的前列腺癌細胞的增殖能力明顯低于對照組和si-EV組（P<0.01），見圖2。

2.3 MALAT1對前列腺癌細胞周期和凋亡的影響

PC3和LNCaP細胞中MALAT1組處于靜止期和DNA合成前期（G0/G1期）的細胞數(shù)量多于對照組，在DNA合成期（S期）的細胞少于對照組；si-MALAT1組處于G0/G1期的細胞數(shù)量少于對照組，而S期細胞多于對照組，見圖3。MALAT1組的細胞凋亡率與對照組細胞凋亡率相近；si-MALAT1組的細胞凋亡率高于對照組，見圖4。

2.4 MALAT1對前列腺癌細胞血管形成能力的影響

PC3、LNCaP細胞中，與對照組比較，MALAT1組細胞形成的管狀結構更多，在主要的管狀結構附近聚集的血管內皮層細胞也更多，更容易形成分支。而si-MALAT1組的內皮層細胞少，基本沒有形成管狀結構，見圖5。

2.5 MALAT1對前列腺細胞克隆形成能力的影響

MALAT1組的PC3、LNCaP細胞的克隆數(shù)量明顯多于對照組，說明MALAT1組細胞的克隆形成能力明顯增強。si-MALAT1組的細胞數(shù)量明顯少于對照組，克隆形成能力減弱，見圖6。

2.6 MALAT1對Cyclin D1、Bcl-2、Bax及p-ERK1/2蛋白表達的影響

與對照組相比，MALAT1組細胞中參與周期調控的Cyclin D1蛋白、抗凋亡蛋白Bcl-2及磷酸化的細胞外信號調節(jié)激酶（p-ERK1/2）的表達水平顯著升高（P<0.01），而促凋亡蛋白Bax的表達水平明顯降低（P<0.01）；si-MALAT1組的Cyclin D1、Bcl-2和p-ERK1/2蛋白表達水平顯著降低（P<0.05或P<0.01），Bax表達水平升高（P<0.01），見圖7。

圖2 MALAT1對細胞增殖能力的影響Figure2 Effects of MALAT1 on proliferation of PC3 and LNCaP cells in vitro

book=414,ebook=32

圖3 MALAT1對PC3、LNCaP細胞周期的影響Figure3 Effects of MALAT1 on cell cycle of PC3 and LNCaP cells

圖4 MALAT1對PC3、LNCaP細胞凋亡的影響Figure4 Effects of MALAT1 on apoptosis of PC3 and LNCaP cells

圖5 MALAT1對PC3、LNCaP細胞血管形成的影響 (×100)Figure5 Effects of MALAT1 on angiogenesis of PC3 and LNCaP cells (×100)

book=415,ebook=33

3 討論

前列腺癌的發(fā)病率隨著生活質量的提高呈現(xiàn)上升趨勢，對前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展研究也隨之增多。近些年研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色：Chung等研究發(fā)現(xiàn)PRNCR1（前列腺非編碼RNA1）-siRNA會減弱前列腺癌細胞的生存、增殖能力和雄激素受體的活性，揭示PRNCR1通過影響雄激素受體活性參與前列腺癌的發(fā)生過程，為前列腺癌的發(fā)病機制提供了新的認識[6]；lncRNA SOCS2-ASI可以促進前列腺癌細胞的生長、抑制凋亡，對前列腺癌的發(fā)生發(fā)展影響甚大[7]；Liu等發(fā)現(xiàn)lncRNA-PVTI在前列腺癌發(fā)生過程中表達上調，進一步研究其影響機制，發(fā)現(xiàn)lncRNA-PVTI與miR-146a存在調控關系，過表達lncRNA-PVTI或沉默miR-146a，可明顯提高前列腺癌細胞的活力，抑制細胞凋亡[8]。

MALAT1是一種致癌性的長鏈非編碼RNA，參與癌細胞的增殖、轉移等過程，在宮頸癌、結直腸癌、非小細胞肺癌以及食管鱗狀細胞癌等癌細胞中都表達上調[9-12]。Cai等發(fā)現(xiàn)，MALAT1在人骨肉瘤細胞和組織中都表達上調，而敲除MALAT1顯著抑制了骨肉瘤細胞的增殖和遷移，并誘導了細胞的周期阻滯和凋亡，這些結果表明MALAT1在骨肉瘤中有促癌的作用[13]。Ren等的研究表明MALAT1也參與了前列腺癌細胞的發(fā)展過程，發(fā)現(xiàn)MALATI-siRNA抑制了前列腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并在G0/G1期誘導周期阻滯，可作為去勢抗性前列腺癌的潛在治療靶點[14]。Cyclin D1是周期蛋白家族成員之一，細胞從G1期進入S期需要Cyclin/CDK進行調控[15]。本研究結果發(fā)現(xiàn)MALAT1過表達后細胞增殖能力增強，且促進了細胞從G0/G1期向S期轉換，進一步檢測周期蛋白Cyclin D1表達，顯示MALAT1過表達組的Cyclin D1蛋白表達量顯著高于對照組，而干擾組降低，該結果說明MALAT1過表達促進Cyclin D1高表達，從而促進了細胞增殖。對細胞凋亡情況進行研究，發(fā)現(xiàn)MALAT1過表達組凋亡率降低，干擾組升高，MALAT1過表達組的抗凋亡因子Bcl-2高表達，而促凋亡因子Bax低表達，MALAT1表達干擾后結果相反，說明MALAT1過表達會抑制癌細胞凋亡，干擾MALAT1表達則促進細胞凋亡。本研究還檢測了各組細胞p-ERK1/2蛋白相對表達量，結果顯示MALAT1過表達組高表book=416,ebook=34達p-ERK1/2，推測MALAT1促進了ERK1/2信號通路的激活，進而影響前列腺癌細胞的生物學行為發(fā)生變化。

圖6 MALAT1對PC3、LNCaP細胞克隆形成能力的影響Figure6 Effects of MALAT1 on clone formation of PC3 and LNCaP cells

圖7 MALAT1對Cyclin D1、Bcl-2、Bax及p-ERK1/2表達的影響Figure7 Effects of MALAT1 on expression of Cyclin D1, Bcl-2, Bax and p-ERK1/2

綜上所述，MALAT1過表達促進前列腺癌細胞的增殖，抑制凋亡，在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。而干擾MALAT1的表達后，抑制了癌細胞的增殖，并促進其凋亡，推測抑制MALAT1表達會對前列腺癌的治療具有非常重要的意義，但lcnRNA-MALAT1對前列腺癌的具體作用機制還需進一步深入研究。

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