趙曉燕，郭曉 ，吳海兵，丁韌燁，曾惠

（嘉興市第一醫(yī)院，浙江 嘉興 314000）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplasticsyndromes，MDS）是起源于造血干細(xì)胞的一組異質(zhì)性髓系克隆性疾病，特點(diǎn)是髓系細(xì)胞發(fā)育異常，表現(xiàn)為無效造血、難治性血細(xì)胞減少，高風(fēng)險(xiǎn)向急性髓系白血病（AML）轉(zhuǎn)化。迄今為止，MDS的病因尚未明確，相關(guān)的發(fā)病機(jī)制可能包括：染色體異常，癌基因與抑癌基因異常，骨髓造血干、祖細(xì)胞體外分化生長異常，單克隆性造血及造血細(xì)胞凋亡等[1]。酪氨酸蛋白磷酸酶非受體Ⅱ型（PTPN11）編碼蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）SHP-2，是 PTP家族的成員[2]。SHP-2通過SH2功能域結(jié)合到酪氨酸磷酸蛋白質(zhì)，使PTP酶激活，從而作為生長因子、細(xì)胞因子及其他胞外刺激因素的下游信號(hào)分子，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、分化、死亡等[3-4]。PTPN11在血液系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，參與造血生長因子以及 IL-3、EPO、SCF、GM-SCF、IL-5 和 PDGF 的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是細(xì)胞造血不可缺少的信號(hào)分子[5]。PTPN11也可見于某些急性髓系白血病亞型中，但與MDS的表達(dá)及發(fā)生有無相關(guān)性尚未見報(bào)道。本文回顧性分析本院82例MDS患者，探討PTPN11基因?qū)DS的臨床意義，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2015年9月-2018年9月本院符合MDS入選標(biāo)準(zhǔn)[6]的82例作為MDS組，男42例，女 40 例，年齡 23-76 歲，平均（58.4±11.4）歲；另外選擇同期良性血細(xì)胞減少患者30例作為對(duì)照組，其中男 17例，女 13例，年齡 24-75歲，平均（60.2±12.5）歲。兩組在年齡、性別構(gòu)成方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。MDS納入標(biāo)準(zhǔn)：入組患者均符合MDS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并簽署知情同意書。MDS組排除標(biāo)準(zhǔn)[7]：（1）依從性差，不配合治療；（2）患有肝臟、心臟以及腎臟等方面的嚴(yán)重疾病者；（3）神經(jīng)類疾病患者，如神經(jīng)纖維瘤病、Noonan綜合征等。

1.2 方法 首先靜脈采集患者的外周血4mL置于EDTA抗凝管中進(jìn)行有核細(xì)胞的分離，再取15mL紅細(xì)胞裂解液均勻混合后室溫下靜置10分鐘，以 3000r/min的速度離心10分鐘，棄上清液，在試管內(nèi)加入7.5mL的生理鹽水及與其體積相等的紅細(xì)胞裂解液，重復(fù)混合均勻，離心后棄上清液，在剩余液體中加入15mL生理鹽水，以3000r/min的速度離心10分鐘，棄分離后的上清液，將試管內(nèi)剩余液體與1mL生理鹽水混勻，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。其次使細(xì)胞DNA被抽取，在1.5mL Eppendorf管中將 QIAamp Protease（20μL）與 PBS緩沖液重復(fù)洗滌過的細(xì)胞懸液（200μL）充分混勻，以 3000r/min的速度離心10分鐘，后棄上清液，將1.5mL Eppendorf管內(nèi)剩余液體與AL Buffer（200μL）振蕩15秒，混勻后56℃水浴中加熱10分鐘，以2000r/min的速度離心10分鐘，離心后液體沉積在 Eppendorf管底部，與無水乙醇（20μL）振蕩混勻，持續(xù)15秒，將Eppendorf管內(nèi)的液體通過QIAamp吸附柱轉(zhuǎn)移至2mL收集管中，以8000r/min的速度高速離心1分鐘。取一個(gè)2mL收集管中QIAamp 吸附柱上注入 AW1 Buffer （500μL），以8000r/min的速度高速離心1分鐘，另取一個(gè)2mL收集管中QIAamp吸附柱上注入AW2 Buffer（500μL），以 14000r/min的速度高速離心3分鐘。在另一個(gè)2mL收集管中放置 QIAamp吸附柱，重復(fù)高速離心1分鐘。重新取一個(gè)1.5mL Eppendorf管放置 QIAamp吸附柱上注入 AE Buffer（50μL），在室溫下靜置 5分鐘后以 8000r/min的速度高速離心1分鐘。對(duì)提取的細(xì)胞DNA質(zhì)量及濃度結(jié)果進(jìn)行分析，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增：通過預(yù)變性及多個(gè)反應(yīng)循環(huán)，并進(jìn)行延伸。根據(jù)電泳結(jié)果確定基因表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo) 檢測(cè)到表達(dá)及突變即判定為陽性。根據(jù)IPSS評(píng)分結(jié)果，≤2分為低中危組，≥2.5分為高危組，分析低中危組及高危組PTPN11基因的表達(dá)。根據(jù)WHO分型，MDS包括四種亞型，分別為RA、RAS、RAEB/RAEB-T、CMML，分析四種亞型的PTPN11基因表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，正態(tài)計(jì)量數(shù)據(jù)用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料用率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對(duì)照組PTPN11基因表達(dá) 觀察組PTPN11基因陽性表達(dá)率顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表 1。

表1 兩組PTPN11基因表達(dá)[n（%）]

2.2 低中危組與高危組PTPN11基因表達(dá) 高危組PTPN11基因陽性表達(dá)率高于低中危組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），詳見表 2。

表2 低中危組與高危組PTPN11基因表達(dá)結(jié)果分析[n（%）]

2.3 四種MDS亞型的PTPN11基因表達(dá) 高危組RAEB/RAEB-T和CMML的PTPN11陽性表達(dá)率均明顯高于低中危組RA和RAS，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而低中危組RA與RAS間以及高危組RAEB/RAEB-T與CMML之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），詳見表 4。

表4 四種MDS亞型的PTPN11基因表達(dá)[n（%）]

3 討論

MDS為惡性克隆增殖性疾病，典型特征為骨髓造血干細(xì)胞增殖分化異常且具有很高的白血病轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)，患者生存率較低。由于機(jī)體造血功能受抑制，骨髓造血干細(xì)胞被損傷，多表現(xiàn)為一系或多系血細(xì)胞數(shù)量降低、骨髓病態(tài)造血等[8]。研究表明，PTPN11編碼蛋白SHP-2是 Akt和 Erk信號(hào)途徑活化所必須的，而后兩者由于促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、生存和抗凋亡，已被證實(shí)在許多腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用[9-10]。臨床上采用檢測(cè)蛋白酪氨酸磷酸酶，即PTPN11編碼的SHP-2。用于檢測(cè)MDS患者PTPN11基因表達(dá)，對(duì)判斷療效及預(yù)后具有較高的臨床意義。

本文表明，觀察組82例MDS患者PTPN11基因陽性表達(dá)率為53.67%，顯著高于對(duì)照組33.33%（P＜0.05）， 說明 PTPN11 的檢測(cè)對(duì)診斷MDS有一定價(jià)值。82例MDS患者低中危組50例，高危組32例，高危組PTPN11基因陽性表達(dá)率（75%）高于低中危組（40%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高危MDS患者一般生存時(shí)間短，轉(zhuǎn)化為急性白血病的風(fēng)險(xiǎn)高，預(yù)后不佳，可能與PTPN11與腫瘤細(xì)胞的增殖、生存及抗凋亡有關(guān)，PTPN11可作為MDS克隆細(xì)胞克隆負(fù)荷標(biāo)志及疾病進(jìn)展標(biāo)志。Germing等[11]在對(duì) 1095例 MDS患者的研究中發(fā)現(xiàn)，各MDS亞型中隨著危險(xiǎn)度上升，其轉(zhuǎn)化為白血病的比例也隨之升高。MDS四個(gè)亞型（RA、RAS、RAEB/RAEB-T 和 CMML）的PTPN11基因陽性表達(dá)率分別為47.83%、50.00%、66.67%、60.00%。高危組RAEB/RAEB-T和CMML的PTPN11陽性表達(dá)率明顯高于低中危組RA和RAS，對(duì)不同亞型的預(yù)后判斷有一定的幫助，高危組預(yù)后明顯差于低中危組。

MDS的易感基因?yàn)镻TPN11基因。采集患者的外周血進(jìn)行有核細(xì)胞分離，其次使細(xì)胞DNA被抽取進(jìn)行PCR擴(kuò)增并根據(jù)電泳結(jié)果確定基因表達(dá)，可有效檢出PTPN11基因陽性表達(dá)率，具有較高的安全性，其操作簡單、檢查時(shí)間短、重復(fù)性好[12]、價(jià)格經(jīng)濟(jì)，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。本文未深入分析PTPN11基因突變率，后期可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行研究。

綜上所述，MDS的易感基因?yàn)镻TPN11基因，腫瘤細(xì)胞的增殖及白血病轉(zhuǎn)化與 PTPN11基因亞型有關(guān)。檢測(cè)PTPN11基因表達(dá)可有效監(jiān)測(cè)MDS患者的病情及預(yù)后，有較高的臨床意義。