邢清朝，習(xí)彥花，單勝道，程輝彩，王宏偉，張麗萍

(1.河北省科學(xué)院 生物研究所，石家莊 050081;2.河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000;3.浙江科技學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，杭州 310023)

石油是人類生產(chǎn)、生活中不可或缺的重要能源和工業(yè)原料。石油在開采、生產(chǎn)和運(yùn)輸過程中，常伴隨由石油泄漏造成的環(huán)境污染。據(jù)估計(jì)，全世界范圍內(nèi)每年約有上千萬噸的石油進(jìn)入水體、土壤等自然環(huán)境中[1-3]。石油的主要成分是烷烴、苯、甲苯和二甲苯等復(fù)雜芳香烴，如進(jìn)入食物鏈會(huì)對(duì)動(dòng)物和人體造成損傷。因此，治理石油污染勢在必行。石油污染處理常用的方法有物理、化學(xué)以及微生物修復(fù)法[4]，物理、化學(xué)修復(fù)一般存在成本高、操作復(fù)雜、易造成二次污染等缺點(diǎn)，而微生物修復(fù)則具有操作簡單、作用時(shí)間長、安全等優(yōu)點(diǎn)[5]。微生物降解石油已成為當(dāng)前石油污染生物修復(fù)的重要方法之一[6-7]。因此，本文擬篩選針對(duì)降解石油的微生物，以期為環(huán)境中石油污染生物修復(fù)提供新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品采集

石油污染樣品采自石油污染的土壤。采集距地表10 cm左右土層的土壤，裝入滅菌袋中，在實(shí)驗(yàn)室中除去雜物，低溫保存，備用。

1.1.2 石 油

石油樣品取自唐海冀東油田，室溫下為黑色黏稠狀物，密度為0.824 g/mL，50 ℃時(shí)黏度為8.75 mm2/s，正構(gòu)烷烴含量50.52%。密封保存。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(簡稱PB培養(yǎng)基)：蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，牛肉膏5 g/L；pH值7.0～7.2(固體培養(yǎng)基加1.2%瓊脂粉)。Luria-Bertani培養(yǎng)基(簡稱LB培養(yǎng)基)：蛋白胨10 g/L，NaCL 10 g/L，酵母粉10 g/L，pH值7.0～7.2。石油培養(yǎng)基：無機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基(簡稱MSM培養(yǎng)基)[8]加石油5 g/L；pH值7.0～7.5。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備

電子分析天平A210P型，德國賽多利斯公司(Sartorius)；BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂公司(Bio-Rad)；OLYMPUS光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司(Olympus)；752型紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；DSQⅡ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾科技公司(Thermo)；SIGMA2-16PK型高速臺(tái)式離心機(jī)，美國西格瑪有限公司(Sigma)。

1.2 方 法

1.2.1 石油降解菌的篩選

將5 g土壤樣品加入100 mL石油培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)7 d，連續(xù)富集培養(yǎng)3次。采用平板劃線法進(jìn)行分離，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。選擇不同形態(tài)的單菌落，分別接種于PB固體平板，30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。對(duì)平板細(xì)菌進(jìn)行涂片觀察，確認(rèn)無雜菌后，接種到PB固體斜面進(jìn)行保存。

將純化的單菌株于PB液體培養(yǎng)基中活化，吸取10 mL菌液加入到100 mL石油培養(yǎng)基中，對(duì)照組直接加入10 mL滅菌后的PB液體培養(yǎng)基，每株菌3個(gè)平行，25 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d，期間觀察石油形態(tài)的變化，并于第7天測石油的降解率。

1.2.2 石油降解菌的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察 將菌株在細(xì)菌生長固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，經(jīng)番紅染色后，用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)[8]。

1.2.2.2 生理生化鑒定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]進(jìn)行鑒定。

1.2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 利用Ezup柱式細(xì)菌基因DNA抽提式試劑盒進(jìn)行基因組總DNA的提取。將提取的DNA用于16S rDNA PCR擴(kuò)增，正向引物Pf5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物Pr5’-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性4 min；95 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物回收、連接、轉(zhuǎn)化測序由金唯智公司完成。將測序結(jié)果在GenBank上進(jìn)行比對(duì)，采用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 石油降解性能

1.2.3.1 菌株XS -2生長曲線 將體積分?jǐn)?shù)為5%的種子液接入LB培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)，每2 h取一次樣，用分光光度計(jì)測定吸光度值(OD600)，3個(gè)重復(fù)。

1.2.3.2 石油標(biāo)準(zhǔn)曲線測定 在0.250 g石油中加入少量正己烷，溶解、定容至50 mL，配成5 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將標(biāo)準(zhǔn)液梯度稀釋成質(zhì)量濃度0、10、20、30、40、50、100、150、200 mg/L。在分光光度計(jì)的200～300 nm，對(duì)中間質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行光譜掃描[10]，以確定最大吸收峰所用波長。在最大吸收峰波長下測定不同質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，以吸光度值為縱坐標(biāo)，石油質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3.3 樣品預(yù)處理 降解后的殘油用正己烷進(jìn)行萃取，在標(biāo)準(zhǔn)曲線測定條件下測定吸光度。

1.2.3.4 石油去除率計(jì)算 石油去除率=[(石油初始質(zhì)量濃度-培養(yǎng)液石油質(zhì)量濃度)/石油初始質(zhì)量濃度]×100 %。

1.2.3.5 殘油GC分析 在預(yù)處理殘油中取1 mL用于GC檢測。檢測條件參照王婧[4]研究中的GC條件。

1.2.4 菌株XS -2降解石油的影響因素

圖1 菌株XS -2對(duì)石油的降解作用Fig.1 Petroleum degradation by strain XS -2

分別對(duì)環(huán)境溫度、石油質(zhì)量濃度和培養(yǎng)基初始pH等影響因素進(jìn)行研究，于第7天測石油的降解率，選出XS -2在各項(xiàng)指標(biāo)中的最佳值，作為紅球菌降解石油的最佳條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 石油降解菌篩選結(jié)果

通過連續(xù)富集傳代培養(yǎng)的方法在樣品中篩選出高效石油降解菌XS -2，該菌株對(duì)石油降解作用明顯，如圖1所示，24 h內(nèi)石油完全為絮狀物，形成油水混合物。

2.2 石油降解菌篩選結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)觀察

圖2 XS -2菌落形態(tài)與菌體光學(xué)圖片F(xiàn)ig.2 Colony morphology and optical photograph of strain XS -2

XS -2菌株在PB平板培養(yǎng)24 h，如圖2(a)所示，其菌落特征為：菌落圓形、邊緣整齊、不透明、表面凸起、干燥、顏色為橙紅色。圖2(b)是XS -2放大1 000倍菌體圖片，生長前期菌體為桿狀，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，菌體長度差異較大，變?yōu)闄E球形。

2.2.2 生理生化鑒定

參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]中操作方法對(duì)菌株XS -2進(jìn)行以下試驗(yàn)項(xiàng)目的檢測，結(jié)果如表1所示。細(xì)菌XS -2為好氧菌，不產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色陽性，甲基紅反應(yīng)陰性，V-P反應(yīng)陽性，氧化酶陽性，接觸酶陽性，不能液化明膠，能利用環(huán)糊精、檸檬酸鹽、核糖、α-D-葡萄糖、D-果糖、丙酮酸、甘露糖，不能利用阿拉伯糖和棉子糖。這與孫磊等[11]分離的赤紅球菌(Rhodococcusruber)S6-2的生理生化特性基本上一致。

表1 菌株XS -2生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical tests of strain XS -2

注:“+”表示陽性，“-”表示陰性，“ND”表示未做檢測。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

通過16S rRNA測序，得到序列長度為1 500 bp左右的的基因片段，將測序結(jié)果上傳GenBank，登陸號(hào)為MK380013，并與GenBank上的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，與紅球菌屬同源性最高，相似度達(dá)到99%。根據(jù)細(xì)菌形態(tài)、生理生化特性、16S rRNA測序結(jié)果構(gòu)建XS -2的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)，綜合分析，鑒定該菌株為赤紅球菌。

圖3 菌株XS -2的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain XS -2

2.2.4 菌株XS -2的生長曲線

圖4 菌株XS -2生長曲線Fig.4 Growth curve of strain XS -2

如圖4所示，測定了XS -2在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h內(nèi)的生長量。結(jié)果表明，在LB培養(yǎng)基中，0～6 h為細(xì)菌生長的延滯期，6～16 h為對(duì)數(shù)生長期，16～44 h為生長穩(wěn)定期，44 h以后細(xì)菌進(jìn)入衰亡期。因此，后期試驗(yàn)采用培養(yǎng)16 h的菌液活性最高。

2.3 石油降解菌XS -2降解性能

2.3.1 最大吸收波長和標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描發(fā)現(xiàn)，最大吸收波峰在224 nm處，在OD224分別測定不同標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖5所示,相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1，表明曲線擬合度很好。

圖5 石油標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Standard curve of petroleum

2.3.2 降解菌XS -2對(duì)石油的降解情況

圖6 XS -2石油降解率 Fig.6 Petroleum degradation rate of strain XS -2

取培養(yǎng)16 h的XS -2菌液，按體積分?jǐn)?shù)5%接種量接入LB培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)，在前期表現(xiàn)出很好的降解作用，并且與對(duì)照組相比(圖6)，XS -2試驗(yàn)組錐形瓶瓶壁上沒有明顯的油膜。通過紫外分光光度法測得XS -2對(duì)石油的7 d降解率達(dá)到54.56%以上，因此可以作為石油污染生物修復(fù)的降解菌株。

2.3.3 GC分析

圖7 石油GC譜圖Fig.7 GC map of petroleum

如圖7所示，菌株XS -2降解的石油組分在保留時(shí)間為12.80、13.91、14.21、16.79、43.12 min的波峰均出現(xiàn)空白缺失，這說明菌株XS -2對(duì)碳數(shù)為14、15、16和17的正構(gòu)烷烴有很好的降解效果；保留時(shí)間為43.12 min的波峰缺失，但是多出保留時(shí)間為40.29 min峰面積相似的波峰，這可能是菌株XS -2將保留時(shí)間為43.12 min的物質(zhì)進(jìn)行了降解，具體機(jī)理有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

2.4 石油降解菌XS -2降解條件優(yōu)化

2.4.1 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株XS -2石油降解性能的影響

圖8 培養(yǎng)溫度對(duì)降解性能的影響Fig.8 Effect of culture temperature on degradation rate

培養(yǎng)溫度與微生物的生長繁殖、代謝活性有密切關(guān)系[12-14]。如圖8所示，20～25 ℃，第7天石油降解率為30%～40%，降解率相對(duì)較低。其原因是溫度較低時(shí)，細(xì)菌代謝能力受到限制，導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物活性較低，對(duì)石油降解性能不高。隨著培養(yǎng)溫度的升高，石油降解效率顯著提高，在35 ℃時(shí)達(dá)到最大值，降解率為65.13%；之后隨著溫度的升高降解效果明顯呈下降趨勢。

圖9 培養(yǎng)基初始pH對(duì)降解性能的影響Fig.9 Effect of initial pH value on degradation rate

在35 ℃時(shí)降解效率最高，這與菌株最佳培養(yǎng)溫度不完全一致，其原因是微生物對(duì)石油烴的降解，主要借助酶的催化作用，如環(huán)烷烴一般先被各種氧化酶氧化為醇，然后通過脫氫酶轉(zhuǎn)化為酮，最后再被氧化為酯酶或脂肪酸，而酶的活性只有在一定溫度范圍內(nèi)才能得以發(fā)揮[15]，所以石油降解溫度與菌株XS -2的最適培養(yǎng)溫度略有差異。

2.4.2 培養(yǎng)基初始pH對(duì)菌株XS -2石油降解性能的影響

pH過高或過低對(duì)微生物生長代謝都是不利的。如圖9所示，pH值在5.0～7.0之間，菌株XS -2在第7天對(duì)石油的降解率呈上升趨勢。在pH值為7.0時(shí)降解率最高達(dá)60%；之后，隨著pH升高，石油降解率明顯下降。這與申圓圓的研究結(jié)果一致[16]。初始pH可以影響微生物細(xì)胞內(nèi)的酶活性，進(jìn)而影響其生物化學(xué)過程。因此，菌株XS -2降解石油的最佳pH值為7.0。

2.4.3 石油質(zhì)量濃度對(duì)菌株XS -2石油降解性能的影響

石油作為微生物生長代謝底物，其質(zhì)量濃度的高低對(duì)微生物降解性能有一定的影響。由圖10可知，隨著石油質(zhì)量濃度的升高，菌株XS -2對(duì)石油降解率呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)石油質(zhì)量濃度為5 g/L時(shí)，第7天降解率最高為65%。

圖10 石油質(zhì)量濃度對(duì)石油降解性能的影響Fig.10 Effect of petroleum mass concentration on degradation rate

石油質(zhì)量濃度較低時(shí)，菌株生長底物不足，導(dǎo)致細(xì)菌生長緩慢，石油降解率較低，該現(xiàn)象與朱杰等[1]的研究結(jié)果一致。隨著石油質(zhì)量濃度增加，底物充足，菌株生長代謝能力旺盛，其降解率也隨之提高。但并不是石油質(zhì)量濃度越高越好，當(dāng)石油質(zhì)量質(zhì)量濃度過高時(shí)，底物碳氮比失調(diào)，菌株生長受到抑制，進(jìn)而使微生物對(duì)石油降解的效果顯著下降。

3 結(jié) 語

微生物修復(fù)無殘毒、低成本、見效快，成為解決石油污染的有效途徑。本試驗(yàn)從石油污染的土壤樣品中分離到高效石油降解菌XS -2，以石油作為唯一碳源，能有效快速地清除瓶壁上的油污，使得培養(yǎng)基中的石油形成油水混合物，這說明它能夠快速將大分子的石油烴降解，在石油污染領(lǐng)域開展生物修復(fù)有較高的研究價(jià)值和較好的應(yīng)用前景。經(jīng)菌體及菌落形態(tài)、生理生化特性和16S rRNA基因序列同源性分析，鑒定菌株XS -2為赤紅球菌。

微生物作為環(huán)境修復(fù)的主體，其降解效率決定修復(fù)水平[17]。因此分別對(duì)菌株XS -2的培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)初始pH和石油質(zhì)量濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定在培養(yǎng)溫度30 ℃、初始培養(yǎng)pH值7.0、石油質(zhì)量濃度5 g/L時(shí)，赤紅球菌XS -2對(duì)石油的降解率最高達(dá)到65%。經(jīng)GC分析，該菌可有效降解碳原子數(shù)量為14、15、16、17的烷烴。赤紅球菌XS -2對(duì)石油的降解機(jī)理以及具體效果還有待進(jìn)一步深入研究。