王虹 李星志 趙丹 劉愛新

摘要：辣椒溶桿菌（Lysobacter capsici）X2-3是本實(shí)驗(yàn)室從小麥根際土壤中分離的對(duì)多種植物病原真菌和卵菌有明顯拮抗活性的菌株，建立有效的遺傳操作體系對(duì)了解其基因的功能具有重要意義。本研究以VgrG為目標(biāo)基因，比較了不同載體對(duì)X2-3基因敲除效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，載體pEX18GM、pBR325和pK19mob轉(zhuǎn)化X2-3后，均未得到VgrG缺失突變體;而載體pKMS1轉(zhuǎn)化X2-3后，經(jīng)10%蔗糖二次篩選、PCR和Southern blot驗(yàn)證等，成功得到VgrG缺失突變體;用廣宿主載體pBBR1MCS-5構(gòu)建的VgrG互補(bǔ)突變體，可以恢復(fù)VgrG基因的功能。本結(jié)果為進(jìn)一步研究該菌的基因功能提供了技術(shù)保障。

關(guān)鍵詞：辣椒溶桿菌;基因敲除;載體篩選;VgrG基因

中圖分類號(hào)：S476：Q933文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）04-0007-06

Abstract Lysobacter capsici X2-3 was isolated by our lab from wheat rhizosphere soil with antimycotic activities to many plant pathogenic fungi and oomycetes. Establishing an effective genetic manipulation system was of great significance for understanding the function of its genes. Using VgrG gene as target， the study compared gene knockout effect of four different vectors on X2-3. The results showed that X2-3 transformed by the vectors pEX18GM， pBR325 and pK19mob were not VgrG deletion mutates. However， after transformation of vector pKMS1 into X2-3， VgrG deletion mutants were successfully obtained by 10% sucrose secondary screening， PCR and Southern blot verification. The complemented mutants of VgrG constructed by broad-host vector pBBR1MCS-5 also restored the function of VgrG gene. This study provided a technical guarantee for the further study on the gene function of the strain X2-3.

Keywords Lysobacter capsici; Gene knockout; Carrier screening; VgrG gene

植物病害的生物防治方法近年來日益受到人們的重視，生產(chǎn)上已廣泛利用的生防菌包括木霉和菌根真菌等真菌[1]，鏈霉菌等放線菌[2]，芽孢桿菌、假單胞桿菌等細(xì)菌[3]。溶桿菌屬（Lysobacter）常存在于水和土壤中，與芽孢桿菌、假單胞桿菌等細(xì)菌相比，生長(zhǎng)較慢，分離純化較為困難，因此分離出現(xiàn)的比例相對(duì)較低[4-6]，研究也相對(duì)較少。

辣椒溶桿菌X2-3（以下簡(jiǎn)稱X2-3）是本實(shí)驗(yàn)室從小麥根際分離到的一株對(duì)真菌、卵菌和革蘭氏陽性細(xì)菌有顯著拮抗活性[7，8]的菌株。研究發(fā)現(xiàn)，辣椒溶桿菌菌株可以產(chǎn)生多種胞外酶和抗菌物質(zhì)[7-9]，有著很好的應(yīng)用前景。但由于缺乏有效的遺傳操作體系，對(duì)X2-3的抗菌物質(zhì)及生物合成機(jī)制等了解很少。本研究以VgrG基因?yàn)槟繕?biāo)基因構(gòu)建不同的敲除載體并轉(zhuǎn)化X2-3，利用平板篩選、PCR、酶切及Southern blot檢測(cè)等技術(shù)手段對(duì)敲除VgrG基因的突變體進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)構(gòu)建VgrG互補(bǔ)菌株，以期建立X2-3有效的遺傳操作體系，并為研究該菌的基因功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為L(zhǎng)ysobacter capsici X2-3;大腸桿菌為Escherichia coli DH5α、E. coli S17-1，均由本實(shí)驗(yàn)室保存，所用質(zhì)粒見表1。供試培養(yǎng)基NA和LA分別用于L. capsici X2-3、大腸桿菌培養(yǎng)。引物（表2）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株X2-3對(duì)不同抗生素的敏感性試驗(yàn) 將菌株X2-3在NB培養(yǎng)液中28℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12～24 h，6 000 r/min離心10 min，棄上清，菌體用無菌水調(diào)節(jié)OD600為1.0。取100 μL菌液涂布于含有不同濃度抗生素的NA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)12～24 h，觀察菌株生長(zhǎng)狀況。所用抗生素包括慶大霉素（Gm）、卡那霉素（Kna）、氨芐西林（Amp）和四環(huán)素（Tet），各抗生素濃度梯度為10、20、50、100、200、500 μg/mL。以不含抗生素的NA為對(duì)照。

1.2.2 基因敲除重組載體的構(gòu)建 用引物VgrG1F/VgrG1R和VgrG2F/VgrG2R，以菌株X2-3基因組DNA為模板分別擴(kuò)增VgrG基因的上、下游同源臂。PCR反應(yīng)體系：10×buffer 2.5 μL，2.5 μmol/L dNTP Mixture 2 μL，10 μmol/L 5′端引物1 μL，10 μmol/L 3′端引物1 μL，5 U/μL DNA polymerase 0.5 μL，100 ng/μL DNA模板1 μL，ddH2O 17 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 5 min;94℃ 40 s，65～67℃ 40 s，72℃ 40 s，30個(gè)循環(huán);72℃ 10 min，電泳回收同源臂連接至克隆載體pMD19-T Simple Cloning Vector并測(cè)序。測(cè)序無誤后，將VgrG基因的上、下游同源臂與pEX18GM[10]、pPKMS1[11]、pBR325[12]、pK19mob[13]載體用相同的限制性內(nèi)切酶酶切后，16℃過夜連接，42℃熱激轉(zhuǎn)化E.coli S17-1感受態(tài)細(xì)胞。37℃、180 r/min培養(yǎng)45 min，分別涂布于含有Gm（200 μg/mL）、Kna（100 μg/mL）、Amp（100 μg/mL）、Kna（100 μg/mL）的LA平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落，進(jìn)行菌落PCR及酶切驗(yàn)證，鑒于4個(gè)載體均具有BamHⅠ、HindⅢ的酶切切點(diǎn)，確定20 μL酶切體系為：10 × K buffer 2 μL，質(zhì)粒8 μL， 20 U/μL BamHⅠ1 μL，20 U/μL HindⅢ 1 μL，ddH2O 8 μL。最后將驗(yàn)證正確的重組載體轉(zhuǎn)化X2-3感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.3 突變體的篩選及PCR驗(yàn)證 根據(jù)載體pEX18GM[10]、pPKMS1[11]、pBR325[12]和pK19mob[13]的抗生素抗性類型，分別用抗生素Gm（200 μg/mL）、Km（500 μg/mL）、Tet（10 μg/mL）和Km（500 μg/mL）對(duì)經(jīng)各重組載體轉(zhuǎn)化的X2-3進(jìn)行初步篩選。對(duì)獲得的單菌落根據(jù)載體特點(diǎn)進(jìn)一步分析篩選：載體pEX18GM和pKMS1因含有蔗糖敏感基因SacB，二次篩選用含10%蔗糖的NA培養(yǎng)基，未發(fā)生二次交換的交換子將在蔗糖培養(yǎng)基中致死[14];pK19mob中含有g(shù)usA基因，用氨基葡萄糖苷為底物的培養(yǎng)基進(jìn)行二次篩選[13];而載體pBR325在菌株生長(zhǎng)過程中可以自然脫落[12，15]，無需二次篩選。最后，對(duì)獲得的單菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證。

1.2.4 雜交驗(yàn)證 經(jīng)PCR初步驗(yàn)證，獲得缺失突變株。為明確獲得的菌株是否為基因缺失突變體，隨機(jī)挑選PCR結(jié)果正確的單菌落提取基因組DNA，進(jìn)一步用Southern blot進(jìn)行驗(yàn)證。分別設(shè)計(jì)探針，并以基因組DNA為模板克隆探針，電泳切膠回收并測(cè)序。選擇合適的酶切位點(diǎn)對(duì)基因組DNA進(jìn)行定量酶切，參照文獻(xiàn)[16]的方法進(jìn)行雜交驗(yàn)證。

1.2.5 互補(bǔ)菌株的篩選及驗(yàn)證 根據(jù)X2-3基因序列設(shè)計(jì)引物HBVgrGF/HBVgrGR，用高保真酶擴(kuò)增目的基因VgrG完整的開放閱讀框，電泳回收基因VgrG片段后連接至pEASY-Blunt Simple Cloning Vector并測(cè)序。測(cè)序無誤后，與同樣酶切的pBBR1MCS-5連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，步驟參照1.2.2。對(duì)單菌落進(jìn)行PCR及酶切驗(yàn)證，體系參照1.2.2。將酶切驗(yàn)證正確的重組載體電擊轉(zhuǎn)化缺失突變體感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于NA（Gm 200 μg/mL）平板，28℃培養(yǎng)3～5 d。單菌落用PCR等進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.6 菌株形態(tài)觀察 取2 μL培養(yǎng)至OD600為1.0的菌液接種于NA平板表面，超凈臺(tái)靜置直至菌液固定在培養(yǎng)基上不再流動(dòng)，28℃靜置培養(yǎng)3～5 d。用Leica體視鏡對(duì)野生菌株、突變體和互補(bǔ)菌株的菌落形態(tài)進(jìn)行觀察，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株X2-3 對(duì)抗生素的敏感性檢測(cè)

X2-3在不同抗生素濃度下的生長(zhǎng)結(jié)果如表3所示。其對(duì)氨芐霉素（Amp）敏感性最差，在500 μg/mL濃度下仍可正常生長(zhǎng);對(duì)四環(huán)素（Tet）最敏感，在10 μg/mL濃度下就不能生長(zhǎng);對(duì)卡那霉素和慶大霉素的敏感性居中，在500 μg/mL卡那霉素（Km）和200 μg/mL慶大霉素（Gm）不能生長(zhǎng)。本結(jié)果為后續(xù)突變體篩選時(shí)選用合適的抗生素濃度提供了依據(jù)。

2.2 不同轉(zhuǎn)化體系比較

以VgrG為目標(biāo)基因，選用載體pEX18GM、pKMS1、pBR325和pK19mob分別構(gòu)建VgrG基因的不同敲除載體并轉(zhuǎn)化X2-3，結(jié)果（表4）發(fā)現(xiàn)，各載體在菌株X2-3中的轉(zhuǎn)化效果存在明顯差異。構(gòu)建的pEX18GM、pKMS1、pBR325和pK19mob重組載體轉(zhuǎn)化后，均可在相應(yīng)抗生素平板上生長(zhǎng)，而野生株與轉(zhuǎn)化空載pEX18GM、pKMS1、pBR325和pK19mob均不生長(zhǎng)，表明構(gòu)建的重組載體均成功轉(zhuǎn)化X2-3菌株。但經(jīng)含10%的蔗糖培養(yǎng)基和含25 mg/L氨基葡萄糖苷培養(yǎng)基二次篩選時(shí)， pEX18GM和pK19mob重組載體轉(zhuǎn)化的菌株均無法正常生長(zhǎng)，表明在蔗糖和氨基葡萄糖苷條件下，一次交換子未發(fā)生二次交換，故無法生長(zhǎng);轉(zhuǎn)化pBR325重組載體的菌株可以在抗生素的平板上生長(zhǎng)，但PCR無法擴(kuò)增到目的條帶，表明pBR325不能用于菌株X2-3中VgrG基因的定向敲除;經(jīng)重組載體pKMS1-VgrG轉(zhuǎn)化的菌株，可以在10%的蔗糖板生長(zhǎng)，經(jīng)PCR擴(kuò)增初步分析，可以得到缺失VgrG基因的突變菌株。初步表明載體pKMS1可以用于菌株X2-3的基因敲除。

2.3 基因VgrG敲除重組載體的PCR和酶切驗(yàn)證

構(gòu)建重組載體pKMS1-VgrG進(jìn)行PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的用BamHⅠ、HindⅢ酶切，酶切結(jié)果見圖1。由圖1a可見，單菌落1、4、5、6、7均可以清晰地?cái)U(kuò)增到1 400 bp的條帶。以單菌落1的質(zhì)粒酶切發(fā)現(xiàn)，BamHⅠ單酶切可以得到7 200 bp的條帶;HindⅢ單酶切可以得到共計(jì)7 200 bp的條帶，因?yàn)檩d體pKMS1中有2個(gè)HindⅢ的酶切位點(diǎn);雙酶切可以得到1 400 bp和載體酶切的條帶（圖1b），與預(yù)期結(jié)果一致。這表明基因VgrG敲除重組載體構(gòu)建成功。

2.4 基因VgrG敲除菌株的篩選

將重組載體pKMS1-VgrG電擊轉(zhuǎn)化菌株X2-3感受態(tài)細(xì)胞，通過抗生素（Km，500 μg/mL）初步篩選、10%蔗糖平板二次交換，用引物VgrG1F/VgrG2R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，理論上野生株X2-3能擴(kuò)增到一條2 139 bp的條帶，而突變株可以得到1 416 bp的條帶。選用蔗糖篩選后的4個(gè)單菌落PCR，結(jié)果（圖2）顯示，菌株X2-3擴(kuò)增到2 139 bp的條帶，單菌落3、5可以擴(kuò)增到1 416 bp的條帶，初步確定為敲除成功的突變體，而2、4單菌落未擴(kuò)增到1 416 bp的條帶。

3 討論與結(jié)論

溶桿菌屬的細(xì)菌分布廣泛，可通過分泌胞外酶、小分子化合物及生物表面活性劑和抗生素等物質(zhì)發(fā)揮對(duì)多種病原細(xì)菌、真菌、線蟲等的拮抗性、競(jìng)爭(zhēng)性、抑制或殺死等作用[17，18]，對(duì)防治土傳病害等具有極大的經(jīng)濟(jì)效益和廣闊的應(yīng)用前景[19]。溶桿菌屬細(xì)菌是一類具有良好潛力的生防細(xì)菌，目前，尚無溶桿菌屬細(xì)菌對(duì)人體或者環(huán)境有害的報(bào)道[20]。與其它種類的細(xì)菌相比，其研究相對(duì)較少，因此建立一種適用于不同溶桿菌的分子操作手段尤為重要。本研究比較了4種常用自殺載體pEX18GM、pBR325、pK19mob和pKMS1對(duì)X2-3的基因敲除效果，發(fā)現(xiàn)僅有pKMS1可用于X2-3的目標(biāo)基因敲除。載體pBBR1MCS-5可在X2-3中用于基因互補(bǔ)。

常用的基因編輯技術(shù)包括轉(zhuǎn)座子插入[21]、CRISPR-Cas9[22]、基因敲除[14，23]等，而相較于點(diǎn)突變、插入突變而言，基因敲除可以避免基因重疊對(duì)其上下游基因表達(dá)的影響，并可以敲除完整的目標(biāo)基因進(jìn)而研究其功能，現(xiàn)已發(fā)展成為最佳的微生物菌劑改良途徑。目前，細(xì)菌中常利用同源重組的原理借助自殺載體來完成對(duì)基因的定向敲除。產(chǎn)酶溶桿菌（L. enzymogenes）OH11是研究較為深入的一種溶桿菌，前人利用載體pEX18GM對(duì)L. enzymogenes菌株OH11中多個(gè)基因進(jìn)行敲除，為了解OH11中基因的功能提供了很多便利[4，9，10]。然而，溶桿菌對(duì)不同載體常表現(xiàn)出選擇性，目前為止還未有一種適用于所有溶桿菌的基因敲除操作體系。本試驗(yàn)證實(shí)產(chǎn)酶溶桿菌OH11中頻繁使用的pEX18GM在辣椒溶桿菌X2-3中無法發(fā)揮基因敲除的作用。前人研究的載體pJQ200SK在菌株L. gummosus OH17中可有效完成基因敲除[24]，但在OH11中則沒有效果[25]?？梢娊⑦m合各菌株的遺傳操作體系是深入研究基因功能的前提。本研究中，我們成功建立起可用于X2-3菌株的遺傳操作體系，為下一步研究其基因功能等方面提供了技術(shù)保障。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Das M M， Haridas M， Sabu A. Biological control of black pepper and ginger pathogens， Fusarium oxysporum， Rhizoctonia solani and Phytophthora capsici， using Trichoderma spp[J]. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology，2019，1（17）：177-183.

[2] Deng Q， Xiao L， Liu Y，et al. Streptomyces avermitilis industrial strain as cell factory for Ivermectin B1a production[J]. Synthetic and Systems Biotechnology，2019，4（1）：34-39.

[3] Fu Y， Yu Z， Liu S， et al. c-di-GMP regulates various phenotypes and insecticidal activity of Gram-positive Bacillus thuringiensis[J]. Frontiers in Microbiology， 2018， 9：45.

[4] 劉軼儒， 徐菲菲， 錢國良，等. 產(chǎn)酶溶桿菌rpfG基因的克隆與功能分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，36（2）：45-50.

[5] El-Tarabily K A， Nassar A H， Hardy G E， et al. Plant growth promotion and biological control of Pythium aphanidermatum， a pathogen of cucumber， by endophytic actinomycetes[J].Journal of Applied Microbiology，2009，106（1）：13-26.

[6] Zúiga A， Poupin M J， Donoso R et al. Quorum sensing and indole-3-acetic acid degradation play a role in colonization and plant growth promotion of Arabidopsis thaliana by Burkholderia phytofirmans PsJN[J]. Mol. Plant-Microbe Interact.， 2013， 26（5）：546-553.

[7] 劉朝霞.辣椒溶桿菌X2-3抗菌物質(zhì)的初步分離及其特性分析[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2016.

[8] Yi J L， Wang J， Li Q， et al. Draft genome sequence of the bacterium Lysobacter capsici X2-3， with a broad spectrum of antimicrobial activity against multiple plant-pathogenic microbes[J]. Genome announcements， 2015， 3 （3）：e00589-15.

[9] Qian G， Wang Y， Qian D，et al. Selection of available suicide vectors for gene mutagenesis using chiA （a chitinase encoding gene） as a new reporter and primary functional analysis of chiA in Lysobacter enzymogenes strain OH11[J]. World J. Microbiol. Biotechnol.， 2012，28（2）：549-557.

[10]Qian G， Xu F， Venturi V， et al. Roles of a solo LuxR in the biological control agent Lysobacter enzymogenes strain OH11[J]. Phytopathology，2014，104（3）：224-231.

[11]Zou L F ， Li Yu R， Chen G Y . A non-marker mutagenesis strategy to generate poly-hrp gene mutants in the rice pathogen Xanthomonas oryzae pv. oryzicola[J]. Agricultural Sciences in China， 2011， 10（8）：1139-1150.

[12]Prentki P， Karch F， Iida S， et al. The plasmid cloning vector pBR325 contains a 482 base-pair-long inverted duplication[J]. Gene， 1981， 14（4）：289-299.

[13]Katzen F， Becker A， Verónica Ielmini M， et al. New mobilizable vectors suitable for gene replacement in gram-negative bacteria and their use in mapping of the 3' end of the Xanthomonas campestris pv. campestris gum operon[J]. Appl. Environ. Microbiol.， 1999， 65（1）：278-282.

[14]Tan Y，Xu D， Li Y ， et al. Construction of a novel sacB -based system for marker-free gene deletion in Corynebacterium glutamicum[J]. Plasmid， 2012， 67（1）：44-52.

[15]Chen K C ， Ravichan dran A ， Guerrero A ， et al. The Burkholderia contaminans MS14 ocfC gene encodes a xylosyltransferase for production of the antifungal occidiofungin[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2013， 79（9）：2899-2905.

[16]錢棟宇. 產(chǎn)酶溶桿菌OH11菌株幾丁質(zhì)酶基因的功能研究[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

[17]Puopolo G ， Cimmino A ， Palmieri M C ， et al. Lysobacter capsici AZ78 produces cyclo（L-Pro- L-Tyr）， a 2，5-diketopiperazine with toxic activity against sporangia of Phytophthora infestans and Plasmopara viticola[J]. Journal of Applied Microbiology， 2014， 117（4）：1168-1180.

[18]Xie Y， Wright S， Shen Y， et al. Bioactive natural products from Lysobacter[J]. Nat. Prod. Rep.，2012， 29（11）：1277-1287.

[19]Hayward A C，F(xiàn)egan N， Fegan M，et al.Stenotrophomonas and Lysobacter： ubiquitous plant-associated gamma-proteobacteria of developing significance in applied microbiology[J]. Journal of Applied Microbiology， 2009，108（3）：756-770.

[20]Qian G， Hu B， Jiang Y， et al. Identification and characterization of Lysobacter enzymogenes as a biological control agent against some fungal pathogens[J]. Agricultural Sciences in China， 2009， 8（1）：68-75.

[21]牟蕾，衣靜莉，李星志，等.一株高拮抗活性菌株的鑒定及其抗菌活性缺失突變體的獲得[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，50（7）：126-132.

[22]信欣，陳麗杰，薛闖.CRISPR-Cas9技術(shù)在細(xì)菌中的研究進(jìn)展及應(yīng)用[J].微生物學(xué)雜志，2018，38（6）：97-102.

[23]Quandt J， Hynes M F. Versatile suicide vectors which allow direct selection for gene replacement in Gram-negative bacteria[J]. Gene， 1993， 127（1）：15-21.

[24]劉琳琳，錢國良，劉鳳權(quán).膠狀溶桿菌OH17菌株遺傳操作系統(tǒng)的構(gòu)建[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，40（4）：649-654.

[25]錢國良. 產(chǎn)酶溶桿菌生防相關(guān)基因的克隆、功能分析及工程菌構(gòu)建[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.