周 杰 安 姣 董 超 趙 靜 張耀海 焦必寧

(西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712)

抗生素是微生物或高等動(dòng)植物代謝產(chǎn)生的具有抗病原體或其他活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛用于動(dòng)物疾病防治或作為飼料添加劑用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，因此其在動(dòng)物源性食品中的殘留問(wèn)題普遍受到關(guān)注，相應(yīng)的研究也較多[1-3]。而抗生素作為農(nóng)藥用于防治植物病蟲(chóng)害會(huì)殘留在農(nóng)產(chǎn)品上，環(huán)境中的抗生素通過(guò)作物吸收也會(huì)進(jìn)入食品中，植物源性食品中抗生素殘留同樣會(huì)對(duì)人體健康構(gòu)成威脅。但目前對(duì)該問(wèn)題關(guān)注度較低，相應(yīng)的研究和綜述也較少。本文介紹了中國(guó)抗生素農(nóng)藥的基本情況，重點(diǎn)對(duì)其前處理和檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行較詳細(xì)的綜述。

1 中國(guó)抗生素農(nóng)藥登記及其限量標(biāo)準(zhǔn)

抗生素農(nóng)藥是指具有農(nóng)藥功能、用于防治病蟲(chóng)草鼠等有害生物的天然代謝產(chǎn)物，屬生物農(nóng)藥范疇。中國(guó)登記的抗生素農(nóng)藥的有效成分有21種，大多為鏈霉菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，農(nóng)藥產(chǎn)品有2 200多個(gè)，約占生物農(nóng)藥總數(shù)的70%[4]。目前，僅阿維菌素、多殺菌素、春雷霉素、多抗霉素、寧南霉素、井岡霉素、伊維菌素和滅瘟素8種有效成分在食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[5]中有限量要求，且多為臨時(shí)限量，有限量要求的作物種類(lèi)也較少，如后兩者分別僅對(duì)結(jié)球甘藍(lán)(0.02 mg/kg)和糙米(0.1 mg/kg)有限量要求。

2 植物源性食品中抗生素來(lái)源及在作物中的累積

施用抗生素農(nóng)藥會(huì)直接殘留在植物上，是植物源性食品中抗生素的主要來(lái)源。土壤、水體等環(huán)境介質(zhì)也是植物源性食品抗生素的重要來(lái)源?？股刂饕ㄟ^(guò)人類(lèi)和動(dòng)物尿液和糞便進(jìn)入環(huán)境，最終通過(guò)淋溶或地表徑流污染土壤、地表水和地下水[6]。同時(shí)，醫(yī)用抗生素可通過(guò)廢水排出或農(nóng)業(yè)灌溉而進(jìn)入環(huán)境。此外，噴施抗生素農(nóng)藥也會(huì)不可避免地殘留于土壤和水體中。這些抗生素通過(guò)以上各種途徑進(jìn)入環(huán)境中，進(jìn)而被植物組織不同程度吸收，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人體健康構(gòu)成潛在的危害。

已有多篇報(bào)道涉及抗生素在植物中的累積[7-8]、遷移和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[9]、對(duì)植物生長(zhǎng)[10-11]以及人體膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的影響[9,12]。Kang等[13]研究了有機(jī)肥中5種抗生素在11種蔬菜中的累積情況，發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)蔬菜都可吸收有機(jī)肥中抗生素，但濃度一般都小于定量限(10 μg/kg)，不會(huì)對(duì)人體造成健康風(fēng)險(xiǎn)。Ahmed等[14]研究了四環(huán)素類(lèi)(TCs)和磺胺類(lèi)(SAs)(5，10，20 mg/kg)對(duì)黃瓜、番茄和生菜生長(zhǎng)的影響及其在作物中的分布及累積情況。結(jié)果顯示：SAs和TCs對(duì)3種蔬菜生長(zhǎng)均具有負(fù)面作用，并與濃度呈正相關(guān)?？股貙?duì)植物的毒性效應(yīng)不同，與其在土壤中吸附，降解及與金屬螯合等作用有關(guān)，SAs在土壤中具有較高的遷移性，易被植物吸收，毒性效應(yīng)強(qiáng)于TCs。此外，抗生素在不同植物和組織中的累積程度不同。對(duì)于TCs而言，其在作物中的累積量為番茄(1.021～5.104 mg/kg)>黃瓜(0.574～3.418 mg/kg)>生菜(0.459～1.892 mg/kg)，在葉和根中高于果實(shí)。土霉素和金霉素在同一部位的積累量普遍高于四環(huán)素。對(duì)于SAs而言，其在作物中的累積量為番茄(32.879～101.799 mg/kg)>生菜(18.169～64.458 mg/kg)>黃瓜(15.916～40.341 mg/kg)，積累趨勢(shì)與TCs相似，但積累水平遠(yuǎn)高于TCs。由于試驗(yàn)條件下抗生素濃度較高，導(dǎo)致了其在植物中的累積水平也較高，但在實(shí)際樣品檢測(cè)中，抗生素濃度較低，一般在10-9的水平，如喹諾酮類(lèi)(QNs)和SAs在蔬菜(干重)中的濃度分別為10.56～193.25 μg/kg[15]和<32.7 μg/kg[16]。

3 樣品前處理方法

3.1 提取方法

植物源性食品中抗生素的提取主要采用溶劑提取法。多數(shù)抗生素的結(jié)構(gòu)中包含極性較強(qiáng)的官能團(tuán)，因此常采用極性溶劑(如乙腈[17]、水[18]、丙酮[19]、甲醇[20]等)作為提取劑，也有用磷酸緩沖液(PBS)[21]的。因樣品常含有色素、纖維素和碳水化合物等物質(zhì)，基質(zhì)較為復(fù)雜，抗生素可通過(guò)氫鍵、疏水作用力及色散力等與之吸附或絡(luò)合，導(dǎo)致單一溶劑的提取效果較差，尤其是多抗生素殘留的同時(shí)檢測(cè)。因此，目前大多選用乙腈、甲醇、丙酮和水的混合溶劑提取[20,22-24]。Chuang等[25]研究發(fā)現(xiàn)乙腈、甲醇和水的比例為46∶25∶29時(shí)，蔬菜中7種抗生素回收率在70%以上。此外，一些抗生素含堿性或酸性基團(tuán)，在不同pH溶液中可呈現(xiàn)出不同的離子形態(tài)，因此在提取劑中常加入酸(如鹽酸[15]、1%甲酸[26]、0.1%～4%乙酸[16,27]、1%檸檬酸[28])或鹽(Mcllvaine緩沖液)。四環(huán)素類(lèi)抗生素可與金屬離子螯合，還需在提取劑中添加EDTA等絡(luò)合劑[29]。

溶劑提取常輔以超聲、振蕩等方式。超聲提取具有效率高、用時(shí)短、設(shè)備易得的優(yōu)點(diǎn)，但會(huì)導(dǎo)致部分抗生素發(fā)生降解，因此也常用振蕩提取代替。李學(xué)德等[30]在測(cè)定蔬菜中3種SAs殘留時(shí)，發(fā)現(xiàn)振蕩提取的回收率(83.6%～88.0%)比超聲提取的(77.9%～85.2%)略高。此外，這2種方式也常結(jié)合使用[15-16,31]。加壓溶劑萃取法(PLE)具有溶劑用量少、提取充分、操作快速、可重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，也常被用于植物中抗生素的提取。Azanu等[32]以水為提取劑，70 ℃加壓萃取10 min，經(jīng)SPE凈化，測(cè)得胡蘿卜和生菜中四環(huán)素和阿莫西林的回收率可達(dá)86.1%以上。

3.2 凈化方法

目前，植物源性食品中的抗生素殘留檢測(cè)常用的凈化方法有液—液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、QuEChERS、分散液液微萃取(DLLME)以及基質(zhì)固相分散(MSPD)等。

LLE是食品中抗生素傳統(tǒng)的凈化方法，植物源性食品中的抗生素最常用的萃取溶劑是正己烷和二氯甲烷。Liu等[33]采用丙酮/水(體積比1∶1)提取，再以正己烷液—液萃取，利用UPLC-FLD測(cè)定了蔬菜中阿維菌素和伊維菌素，其回收率分別為80.3%～110.2%和82.4%～103.4%。但由于該方法操作繁瑣費(fèi)時(shí)，并需大量有機(jī)溶劑，目前已結(jié)合SPE使用或被其取代。

與LLE相比，SPE可同時(shí)完成樣品富集和凈化，回收率和靈敏度高，是食品中抗生素殘留檢測(cè)最常用的凈化手段。常用的SPE小柱有HLB柱、C18柱、SCX柱和Florisil柱等，其中，HLB柱的填料為N-乙烯基吡咯烷酮(親水性)-二乙烯基苯(親脂性)，具有兩親平衡性，對(duì)多數(shù)抗生素具有良好凈化的效果，應(yīng)用最為廣泛。Wang等[34]建立了同時(shí)檢測(cè)果蔬中春雷霉素和井岡霉素A的HPLC-TOF-MS/MS方法：樣品經(jīng)乙腈/水(體積比70∶30，pH 5.5)提取，再經(jīng)HLB與SCX串聯(lián)小柱凈化，目標(biāo)物回收率較好(81.7%～108%)。Aldeek等建立了柑桔[35]和橙汁[21]中的青霉素G及其代謝物殘留檢測(cè)方法：樣品經(jīng)PBS提取，HLB柱凈化，UPLC-MS/MS檢測(cè)，回收率為82%～120%。此外，一些納米材料因其獨(dú)特的理化性質(zhì)也被用作SPE填料。石墨烯是一種二維平面的碳納米材料，比表面積較大，分子易在其表面被吸附和洗脫。采用石墨烯凈化蔬菜中SAs，其效果較C18硅膠和多壁碳納米管好[31]。

QuEChERS法是一種集提取與凈化于一體的方法，其常用的凈化劑是乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、十八烷基甲硅烷基(C18)和石墨化炭(GCB)。Yu等[36]利用QuEChERS-UPLC-MS/MS法同時(shí)檢測(cè)了葉菜中20種抗生素殘留，平均回收率為57%～91%。Hu等[24]也建立了同時(shí)檢測(cè)葉菜類(lèi)蔬菜中26種殺菌劑抗生素殘留的QuEChERS-HPLC-MS/MS法，結(jié)果表明大部分抗生素的回收率為60.0%～98.0%。盡管QuEChERS法的凈化效果不如SPE，并且一些凈化劑如GCB的使用會(huì)降低部分抗生素的回收率，但因其操作簡(jiǎn)便，無(wú)需特殊儀器設(shè)備，有機(jī)溶劑用量較少，環(huán)境友好等，仍成為目前處理大批量樣品中抗生素多殘留檢測(cè)常用方法。

DLLME是一種能夠?qū)崿F(xiàn)快速萃取富集的微型化LLE，具有操作簡(jiǎn)單、有機(jī)溶劑用量少、富集倍數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)。Pirsaheb等[37]利用懸浮固化—分散液液微萃取(DLLME-SFO)檢測(cè)了蘋(píng)果中的阿維菌素，二嗪農(nóng)和毒死蜱殘留：以乙腈為分散劑，1-十一烷醇為萃取劑，HPLC-UV檢測(cè)，回收率為68%～82%。由于所用的萃取劑多為含氯有機(jī)化合物(如氯仿和二氯甲烷)，毒性較大，揮發(fā)性強(qiáng)，易對(duì)操作人員和環(huán)境造成較大毒害[38]，而且DLLME除雜能力較弱，難以應(yīng)對(duì)復(fù)雜基質(zhì)的植物源性食品，故應(yīng)用較少。

MSPD是在SPE基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的集樣品勻漿、提取、凈化和富集于一體的方法，具有省時(shí)省力、快速高效的特點(diǎn)。Zhang等[39]將大米樣品與堿性氧化鋁1∶2混合研磨，再轉(zhuǎn)入MSPD柱中洗脫，同時(shí)用微波輔助萃取，得到阿維菌素回收率為88.6%～91.0%。微波可使樣品溫度升高，從而加快MSPD進(jìn)程，并提高目標(biāo)物的回收率，因此，該方法用于大米中阿維菌素的檢測(cè)具有顯著的優(yōu)越性。

表1列出了近年來(lái)有關(guān)植物源性食品中抗生素的前處理和檢測(cè)的方法。

3.3 植物源性食品基質(zhì)效應(yīng)

植物源性食品基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effects，ME)與前處理方法、食品種類(lèi)、部位及抗生素種類(lèi)和性質(zhì)等因素有關(guān)。不同凈化方式對(duì)果蔬中抗生素基質(zhì)效應(yīng)不同。用HLB柱凈化后，果蔬基質(zhì)對(duì)春雷霉素和井岡霉素A的抑制效應(yīng)較強(qiáng)(ME為-80.4%～-34.2%)，用SCX柱凈化后，基質(zhì)效應(yīng)明顯降低(ME為-31.4%～5.23%)，而用HLB柱串接SCX柱后，基質(zhì)效應(yīng)可忽略(ME為-11.2%～6.11%)[34]。同一種或同一類(lèi)抗生素在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)不同。在葉菜、根菜和果菜類(lèi)基質(zhì)中，TCs有增強(qiáng)也有抑制效應(yīng)，但基質(zhì)干擾程度較低；SAs總體表現(xiàn)為抑制效應(yīng)且在白蘿卜上表現(xiàn)強(qiáng)烈(ME為-72.3%～-51.6%)；大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)、截短側(cè)耳素類(lèi)抗生素在大部分基質(zhì)中表現(xiàn)為抑制效應(yīng)，而林可酰胺類(lèi)抗生素卻表現(xiàn)為較低的增強(qiáng)效應(yīng)；氟喹諾酮類(lèi)抗生素除恩諾沙星和二氟沙星無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng)外，其他均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的增強(qiáng)或抑制效應(yīng)(ME為50.9%～75.5%和-75.3%～-50.5%)[33]。同一種基質(zhì)對(duì)于不同抗生素表現(xiàn)出不同的基質(zhì)效應(yīng)，葉菜類(lèi)蔬菜對(duì)氟喹諾酮類(lèi)抗生素的基質(zhì)效應(yīng)較小(ME為-20%～29%)，對(duì)SAs有中等程度的抑制作用(ME為-60%～-14%)，而對(duì)TCs中的四環(huán)素基本無(wú)基質(zhì)效應(yīng)(ME為-7%)，但對(duì)土霉素和金霉素卻有強(qiáng)烈的增強(qiáng)效應(yīng)(ME分別為74%和63%)[40]。此外，作物不同部位的基質(zhì)效應(yīng)也稍有差異。水稻不同部位對(duì)井岡霉素A的抑制程度有所差別，為稻殼(ME為-82.0%)>糙米(-74.6%)>稻草(-72.4%)[50]。目前很多研究[21,26,36]評(píng)估了樣品分析過(guò)程中基質(zhì)效應(yīng)的大小，但在其影響因素、作用機(jī)理等方面還需深入研究。

4 色譜方法

目前關(guān)于食品中抗生素檢測(cè)以色譜法為主，而液相色譜更是植物源性食品中抗生檢測(cè)的主流方法，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)也采用液相色譜法測(cè)定植物源性食品中阿維菌素[51-52]和井岡霉素[53]。此外，還有少量用酶聯(lián)免疫法(ELISA)的報(bào)道[16,54]。

表1植物源性食品中抗生素的檢測(cè)方法
Table 1 Detection of antibiotics in plant-derived foods

續(xù)表1

4.1 高效液相色譜

測(cè)定植物源性食品中抗生素殘留所用色譜柱主要是C18柱，少數(shù)用C8柱[19]。流動(dòng)相多為乙腈—水[35]、甲醇—水[37]，少數(shù)為乙腈—甲醇—水[22]。為改善峰型和提高分離度，常在水相中加入乙酸銨[49]、甲酸[36]、乙酸[43]等，添加量一般為0.05%～0.50%。檢測(cè)器主要是紫外吸收檢測(cè)器(UV)、熒光檢測(cè)器(FLD)，少數(shù)是光電二級(jí)管陣列檢測(cè)器(DAD)[55]。利用HPLC-UV檢測(cè)蘋(píng)果[34]、柑桔[42]、龍眼[56]中阿維菌素的LOD分別為0.7，30.0，5.0 μg/kg；檢測(cè)蔬菜中SAs的LOD為6.3～21.1 ng/L[32]。FLD的靈敏度比UV高，但被測(cè)物需有強(qiáng)的熒光反應(yīng)，若被測(cè)物沒(méi)有產(chǎn)熒光基團(tuán)，則需進(jìn)行衍生化作用，操作步驟較繁瑣。利用HPLC-FLD檢測(cè)果蔬中阿維菌素類(lèi)LOD為0.1～10.0 μg/kg[17,23]，SAs的LOD為1～5 μg/kg[16]；檢測(cè)黃瓜、大白菜中鏈霉素的LOD為10 μg/kg[47]。

4.2 液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用

液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合了色譜的高分離性和質(zhì)譜的高鑒別能力的優(yōu)點(diǎn)，是植物源性食品中抗生素殘留檢測(cè)的主要方法。因串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)的靈敏度和選擇性要顯著高于單級(jí)質(zhì)譜(MS)，目前普遍采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC-MS/MS)，其中以三重四極桿質(zhì)譜(QQQ)和四極桿線性離子阱質(zhì)譜(Q-Trap)應(yīng)用最為廣泛[21,24,49]。采用HPLC-MS/MS(QQQ)測(cè)定，植物源性食品中阿維菌素、春雷霉素、SAs、QNs等抗生素的LOD在0.09～30.00 μg/kg(或μg/L)[13,40,43,57]，其中泰妙菌素的LOD可達(dá)0.005 μg/kg[24]。以HPLC-MS/MS(Q-Trap)檢測(cè)植物源性食品中的多殺菌素、多抗霉素D、青霉素G及其兩種代謝物等抗生素的LOD分別為2～29[44]，50[26]，0.1[21]μg/kg。與QQQ和Q-Trap相比，四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(Q-TOF)分辨率較高(>10 000)，質(zhì)量范圍較寬(上限約15 000道爾頓)，因此在高相對(duì)分子質(zhì)量分析中具有重要作用，但其線性范圍較窄、靈敏度較低且成本較高，在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室或日常定量檢測(cè)中使用相對(duì)有限?？紤]到Q-TOF的高選擇性，相信未來(lái)其將逐漸成為食品中抗生素殘留測(cè)定的重要工具。

5 展望

目前已有少許果蔬、糧谷等農(nóng)產(chǎn)品中抗生素殘留檢測(cè)方法的報(bào)道[29,31,36]，但主要是儀器檢測(cè)法，方法較為單一。由于植物源性食品的保鮮及儲(chǔ)藏問(wèn)題，開(kāi)發(fā)如膠體金試紙條等現(xiàn)場(chǎng)快檢方法和Q-TOF等實(shí)驗(yàn)室快速篩查方法將是今后植物源性食品抗生素殘留檢測(cè)研究的一個(gè)重點(diǎn)方向。同時(shí)，目前關(guān)于植物中抗生素的分析方法多關(guān)注于某一種或一類(lèi)抗生素的檢測(cè)，方法的適用面較窄，并且對(duì)代謝產(chǎn)物的檢測(cè)分析研究較少。因此為全面準(zhǔn)確地評(píng)估人類(lèi)通過(guò)膳食的暴露風(fēng)險(xiǎn)，需要加強(qiáng)對(duì)多類(lèi)型抗生素同時(shí)檢測(cè)和對(duì)其代謝物的檢測(cè)研究。另外，在基質(zhì)效應(yīng)的主要影響因素、形成機(jī)理等方面還需要進(jìn)一步研究。這些問(wèn)題的研究和解決，有助于進(jìn)一步建立高效快捷、靈敏穩(wěn)定、自動(dòng)化程度更高的抗生素多殘留檢測(cè)技術(shù)。