左麗麗 任婷婷 勾文哲 富校軼 王舒然

(吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林 吉林 132013)

21世紀(jì)，輻射已經(jīng)滲透到人們生活的各個領(lǐng)域，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生一系列疾病[1-2]，加強(qiáng)對輻射損傷的防護(hù)，減輕放射性疾病已經(jīng)成為當(dāng)今社會亟待解決的重要課題[3-4]。人工合成輻射防護(hù)劑大都存在價格昂貴、毒副作用強(qiáng)，不能長期服用等一系列缺點(diǎn)，因此開發(fā)安全、健康、高效、無毒或低毒的天然抗輻射制劑或食品越來越受到關(guān)注[5-7]。狗棗獼猴桃是東北地區(qū)的野生漿果，含有豐富的多酚、黃酮、維生素等多種天然活性成分[8-10]，表現(xiàn)出很好的抗氧化和抗輻射活性[11-12]。因此開發(fā)狗棗獼猴桃抗輻射制劑或產(chǎn)品對于接觸輻射的人群具有重要意義。有研究[13-15]顯示水果、蔬菜中多酚、黃酮、多糖等活性成分都表現(xiàn)出很好的抗輻射活性，但是這些活性成分的分離純化及制備工藝復(fù)雜，成本高，應(yīng)用于市場有一定的局限性，因此，開發(fā)天然、健康的狗棗獼猴桃抗輻射產(chǎn)品勢在必行。而狗棗獼猴桃壓縮餅干具有營養(yǎng)成分豐富、體積小，便于攜帶、成本低等一系列優(yōu)點(diǎn)，因此，研究其抗輻射功能，對于接觸輻射的普通人群，尤其對于航天、軍隊以及醫(yī)用工作者具有重要的意義，同時也為狗棗獼猴桃產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狗棗獼猴桃壓縮餅干：吉林醫(yī)藥學(xué)院食品工藝實(shí)驗(yàn)室制備；

RPMI Medium 1640：500 mL，美國Hyclone公司；

胰酶：酶活≥180 U/mg，?；锟萍加邢薰荆?/p>

噻唑藍(lán)MTT：分析純，北京索萊寶科技有限公司；

二甲基亞礬DMSO：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

青霉素—鏈霉素雙抗溶液(100×)：?；锟萍加邢薰?；

RNaseA：酶活≥50 U/mg，北京索萊寶科技有限公司；

碘化丙啶PI：純度≥95%，北京索萊寶科技有限公司；

胎牛血清：優(yōu)級，無支原體，浙江天杭生物科技有限公司；

乙醇：分析純，天津奧普升化工有限公司；

細(xì)胞凋亡試劑盒(100rxn)：諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 儀器及設(shè)備

超聲波清洗儀：KQ500B型，上海越眾儀器設(shè)備；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-300型，上海亞榮生化儀器廠；

水浴鍋：DK-98-IIA+型，天津市泰斯特儀器公司；

CO2培養(yǎng)箱：CLASS100型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；

酶標(biāo)儀：Epoch型，美國伯騰儀器有限公司；

流式細(xì)胞儀：C6型，美國BD公司；

超凈臺：SW-CJ-2G型，上海市索域試驗(yàn)設(shè)備公司；

低速離心機(jī)：SC-3612型，安徽中科中佳科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 狗棗獼猴桃壓縮餅干的制備 通過正交試驗(yàn)獲得狗棗獼猴桃壓縮餅干的制備工藝：狗棗獼猴桃4 g，低筋面粉28 g，奶粉3.5 g，白砂糖15 g，食用油7 g，飲用水7 g。充分混勻調(diào)配，壓塊，上火180 ℃，下火190 ℃，烤制7 min，冷卻至室溫。

1.3.2 樣品前處理 稱取一定量的狗棗獼猴桃壓縮餅干以及空白對照餅干(即不加狗棗獼猴桃粉制作的壓縮餅干)，將其粉碎，以1∶10(g/L)的料液比加入60%的乙醇，混勻后在超聲波清洗儀上進(jìn)行提取(50 ℃，30 min)，過濾，濾渣按照上述方法重復(fù)提取2次，合并濾液，50 ℃條件下通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至一定體積，即得加藥組和藥物空白組提取物，分裝后置于-20 ℃冰箱備用。

1.3.3 建立紫外輻射誘導(dǎo)的氧化損傷模型 選擇生長狀況良好的肝細(xì)胞HL-7702，胰酶消化制成細(xì)胞懸浮液，利用血球計數(shù)板計數(shù)，達(dá)到2.5×105個/mL即可鋪入96孔板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后使用紫外燈進(jìn)行梯度照射(0，5，10，15，20，25，30，35，40，45 min)，輻射后立即放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入10 μL MTT溶液，于37 ℃ 繼續(xù)孵育4 h終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)溶液，然后每孔加入150 μL的DMSO，振蕩使沉淀溶解，使用酶標(biāo)儀檢測吸光度[16-18]，計算各組相對于輻射對照組的細(xì)胞損傷情況，確定輻射模型的時間。

1.3.4 狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分對輻射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞增殖能力的影響

(1)防護(hù)組：選擇生長狀況良好的肝細(xì)胞HL-7702，胰酶消化制成細(xì)胞懸浮液，細(xì)胞數(shù)量達(dá)到2.5×105個/mL即可鋪入96孔板，待細(xì)胞貼壁生長后加入不同濃度的狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分(0，10，20，30，40，50，60，70，80 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，根據(jù)輻射模型時間進(jìn)行紫外燈照射，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)結(jié)束后按照上述方法用酶標(biāo)儀測定吸光度，計算各組相對于輻射對照組的細(xì)胞損傷[19-20]。

(2)修復(fù)組：在同樣條件下，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行紫外燈的照射，培養(yǎng)一段時間后加入不同濃度的狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分，繼續(xù)培養(yǎng)，之后同防護(hù)組。

1.3.5 狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分對輻射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞周期的影響

(1)防護(hù)組：選擇生長狀況良好的肝細(xì)胞HL-7702，胰酶消化制成細(xì)胞懸浮液，達(dá)到2.5×105個/mL即可鋪入6孔板，每孔2 mL，設(shè)置模型組、加藥組、藥物空白組和空白組，每組3個平行，于37 ℃，5% CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后根據(jù)輻射模型時間對模型組、加藥組、藥物空白組進(jìn)行紫外燈照射，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，加藥組每孔加入不同濃度的狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分(低、中、高3個劑量)，藥物空白組以低劑量形式加入6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。分別收集各組的細(xì)胞，用PBS溶液洗滌2次，加入預(yù)冷的75%乙醇固定，4 ℃過夜。固定后的細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入終濃度為100 μg/mL的RNA酶和PI染色液，4 ℃條件下避光染色60 min，用200目篩網(wǎng)對其進(jìn)行過濾，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布情況，ModFit LT軟件分析細(xì)胞周期[21-22]。

(2)修復(fù)組：在同樣條件下，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行紫外燈的照射，培養(yǎng)一段時間后加入不同濃度的狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分，同時進(jìn)行藥物空白組試驗(yàn)，繼續(xù)培養(yǎng)，之后同于防護(hù)組。

1.3.6 狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分對輻射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的影響

(1)防護(hù)組：選擇生長狀況良好的肝細(xì)胞，利用血球計數(shù)板計數(shù)，達(dá)到2.5×105個/mL即可鋪入6孔板，每孔2 mL，設(shè)置模型組、加藥組、藥物空白組和空白組，加藥組根據(jù)確定的最佳加入量設(shè)計低、中、高3個劑量加入到6孔板中，藥物空白組以低劑量形式加入6孔板中，培養(yǎng)2 h 后模型組、加藥組、藥物空白組紫外照射20 min，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。用胰酶(不含EDTA)消化收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，棄上清后，首先在3個空白樣品中各加入100 μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，其中2個空白樣中1個加入5 μL的Annexin V-FITC，另1個加入5 μL 的PI，避光，室溫反應(yīng)10 min后各加入400 μL的1×Binding Buffer，混勻后用200 目的絹布過濾，用流式細(xì)胞儀檢測。其他樣品中分別加入100 μL的1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，再加入Annexin V-FITC和PI溶液各5 μL，室溫下避光反應(yīng)10 min后加入400 μL的1×Binding Buffer混勻，用200目的絹布過濾，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的情況[23-25]。

(2)修復(fù)組：在同樣條件下，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行紫外燈的照射，培養(yǎng)2 h后加入不同濃度的狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分，同時進(jìn)行藥物空白組試驗(yàn)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用胰酶(不含EDTA)消化收集各組細(xì)胞，之后同防護(hù)組。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)中測定結(jié)果進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，最后結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差表示。結(jié)果采用統(tǒng)計分析軟件SPSS、Origin 8.5進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 輻射誘導(dǎo)的氧化損傷模型

如圖1所示，隨著輻射時間的延長肝細(xì)胞的增殖率逐漸降低，當(dāng)輻射時間為20 min時，細(xì)胞增殖率下降到50%以下，表明紫外輻射誘導(dǎo)的氧化損傷模型建立成功。因此，確定20 min 為后期輻射損傷時間。

圖1 輻射誘導(dǎo)的氧化損傷模型Figure 1 Radiation induced oxidative damage model

2.2 MTT試驗(yàn)

2.2.1 防護(hù)組 如圖2所示，隨著加藥量的增加，HL-7702肝細(xì)胞的增殖率也逐漸增加，表明防護(hù)作用在逐漸加強(qiáng)，加藥量達(dá)到70 mg/mL時，增殖率達(dá)到64.8%，效果最佳，繼續(xù)增大加藥量，細(xì)胞增殖率變化不大，故確定70 mg/mL為預(yù)防作用的最佳加藥量。

2.2.2 修復(fù)組 如圖3所示，隨著加藥量的增加，治療作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)加藥量達(dá)到60 mg/mL時，增殖率達(dá)到113.98%，效果最佳，繼續(xù)增大加藥量，細(xì)胞增殖率出現(xiàn)下降趨勢，故確定60 mg/mL為治療作用的最佳加藥量。

圖2 防護(hù)作用Figure 2 Protetive effect

圖3 修復(fù)作用Figure 3 Therapeutical effect

2.3 細(xì)胞周期試驗(yàn)

2.3.1 狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分對輻射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞周期預(yù)防作用的影響 如表1和圖4所示，對比空白組和模型組，模型組的G2/M期的細(xì)胞比例(21.85±0.48)明顯大于空白組的G2/M期細(xì)胞比例(12.91±0.76)，同時模型組的G0/G1期的細(xì)胞比例比空白組有所下降，表明輻射損傷引起肝細(xì)胞阻滯在G2/M期，使其不能進(jìn)入下一階段。同時進(jìn)行藥物空白試驗(yàn)，壓縮餅干提取物中一定濃度的大分子物質(zhì)對輻射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞周期有一定的影響，但效果不及狗棗獼猴桃壓縮餅干提取物。加入不同濃度的狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分后G2/M期的細(xì)胞比例存在減小的趨勢，在一定程度上控制了輻射引起的細(xì)胞周期阻滯，防止肝細(xì)胞的輻射損傷，使其逐步恢復(fù)肝細(xì)胞的增殖能力?？梢?，狗棗獼猴桃壓縮餅干對輻射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞有一定的預(yù)防作用。

2.3.2 對輻射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞細(xì)胞周期治療作用的影響

如表2和圖5所示，與空白對照組(8.70±2.22)相比，模型組G2/M期的細(xì)胞比例(17.36±1.29)顯著增加，表明紫外輻射會引起細(xì)胞阻滯在G2/M期，使其不能進(jìn)入下一階段。與模型組相比，不同濃度的加藥組G2/M期的細(xì)胞比例存在減小的趨勢，一定程度上控制了輻射引起的細(xì)胞周期阻滯，保護(hù)肝細(xì)胞由輻射引起的損傷，使其逐步恢復(fù)肝細(xì)胞增殖能力。同時進(jìn)行藥物空白組試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)壓縮餅干中的大分子物質(zhì)對輻射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞周期有一定的影響，但效果不及狗棗獼猴桃壓縮餅干提取物。

圖4 餅干活性成分對輻射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞周期的預(yù)防作用Figure 4 The protetive effect of biscuit active ingredients on hepatocyte cell cycle induced by radiation

表1餅干活性成分對輻射誘導(dǎo)肝細(xì)胞周期的預(yù)防作用?
Table 1 The protetive effect of biscuit active ingredients on hepatocyte cell cycle induced by radiation

組別G0/G1SG2/M空白組62.47±0.6924.63±1.4512.91±0.76模型組50.64±1.8227.52±1.3421.85±0.48藥物空白組56.76±1.8426.27±1.4016.97±0.44加藥組(300 mg/mL)56.34±0.0323.93±0.3919.73±0.35加藥組(500 mg/mL)51.06±3.4026.65±1.2222.27±2.14加藥組(700 mg/mL)53.51±0.3726.72±0.6819.78±0.32加藥組(900 mg/mL)53.55±3.5425.78±3.1420.69±0.39

? 藥物空白組為不加狗棗獼猴桃粉制作的壓縮餅干提取物。

表2餅干活性成分對輻射誘導(dǎo)肝細(xì)胞周期的治療作用?
Table 2 The repair effect of biscuit active ingredients on hepatocyte cell cycle induced by radiation

組別G0/G1SG2/M空白組58.02±1.1333.28±3.358.70±2.22模型組61.98±2.0920.64±0.8617.36±1.29藥物空白組61.11±0.9324.07±0.7614.83±0.17加藥組(200 mg/mL)60.97±0.9321.20±1.4117.84±0.47加藥組(400 mg/mL)62.12±1.6420.54±0.2817.35±1.92加藥組(600 mg/mL)63.37±2.8219.82±3.3716.82±0.54加藥組(800 mg/mL)63.23±1.4119.51±0.7017.27±0.72

? 藥物空白組為不加狗棗獼猴桃粉制作的壓縮餅干提取物。

圖5 餅干活性成分對輻射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞周期的治療作用Figure 5 The repair effect of biscuit active ingredients on hepatocyte cell cycle induced by radiation

2.4 細(xì)胞凋亡試驗(yàn)

2.4.1 狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分對肝細(xì)胞凋亡的預(yù)防作用 如表3和圖6所示，與空白對照組(1.25±1.77)相比，輻射模型組細(xì)胞凋亡率(13.42±1.30)顯著上升，表明輻射對肝細(xì)胞造成一定程度的損傷，而加入一定量狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分，隨著濃度的提高，肝細(xì)胞凋亡率逐漸下降，表明了狗棗獼猴桃壓縮餅干對輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡存在顯著的抑制作用。同時進(jìn)行藥物空白組試驗(yàn)，結(jié)果表明壓縮餅干中的大分子物質(zhì)對輻射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡有少許的抑制作用，但效果不及狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分。即狗棗獼猴桃壓縮餅干有一定的抗輻射作用。

2.4.2 狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分對肝細(xì)胞凋亡的修復(fù)作用 如表4和圖7所示，與空白對照組(1.65±0.07)相比，模型組細(xì)胞凋亡率(11.75±1.91)顯著上升，表明輻射對肝細(xì)胞造成一定程度的損傷；隨著加藥濃度的提高，肝細(xì)胞凋亡率逐漸下降，表明狗棗獼猴桃壓縮餅干對輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡存在顯著的抑制作用。同時進(jìn)行藥物空白組試驗(yàn)，檢驗(yàn)壓縮餅干中大分子物質(zhì)對輻射的影響，結(jié)果表明其中的大分子物質(zhì)對輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有少許抑制作用，但作用效果不及狗棗獼猴桃壓縮餅干中的活性成分，即研制的狗棗獼猴桃壓縮餅干具有一定的輻射防護(hù)作用。

表3餅干活性成分對輻射誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡率的預(yù)防作用?
Table 3 The protective effect of biscuit active components on the apoptosis rate of hepatocytes induced by radiation

%

? 藥物空白組為不加狗棗獼猴桃粉制作的壓縮餅干提取物。

圖6 餅干活性成分對輻射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的預(yù)防作用Figure 6 The protective effect of biscuit active components on radiation-induced hepatocyte apoptosis

圖7 餅干活性成分對輻射誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡的治療作用Figure 7 The repair effect of biscuit active components on radiation-induced hepatocyte apoptosis

表4餅干活性成分對輻射誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡率的治療作用?
Table 4 The repair of biscuit active components on the apoptosis rate of hepatocytes induced by radiation

%

? 藥物空白組為不加狗棗獼猴桃粉制作的壓縮餅干提取物。

3 結(jié)論

本研究通過MTT試驗(yàn)、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡試驗(yàn)，結(jié)果表明狗棗獼猴桃壓縮餅干具有一定的抗輻射功能，對紫外輻射誘導(dǎo)的損傷有一定的預(yù)防和修復(fù)效果，加藥量達(dá)到70 mg/mL時狗棗獼猴桃壓縮餅干預(yù)防作用最佳，而加藥量達(dá)到60 mg/mL時修復(fù)作用較好。一定量的狗棗獼猴桃壓縮餅干活性成分能夠有效抑制輻射引起的細(xì)胞周期阻滯，使其恢復(fù)肝細(xì)胞的增殖能力，同時能夠有效降低輻射引起的細(xì)胞凋亡，保護(hù)細(xì)胞不受損傷。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了狗棗獼猴桃壓縮餅干的抗輻射功能，為航天、軍隊、醫(yī)用工作者以及日常接觸輻射的人群提供了安全保障，同時也為后續(xù)進(jìn)一步深入研究其抗輻射作用機(jī)制提供了一定的科學(xué)依據(jù)。