張新霞 陳正行 王 莉

(1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

大米蛋白是最接近FAO/WHO理想模式的植物蛋白，氨基酸組成配比合理，生物價(jià)高，過(guò)敏性低，是一種優(yōu)質(zhì)谷物蛋白[1]。近年研究[2-3]發(fā)現(xiàn)，大米蛋白具有重要保健功能，如抗糖尿病、抗膽固醇、抗癌變等。盡管大米蛋白的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健價(jià)值已被認(rèn)可，但低溶解性嚴(yán)重限制了其在工業(yè)中的應(yīng)用。酶解改性可以較好地改善大米蛋白的溶解性，使水解產(chǎn)物具有各種生物活性[4]。然而，大米蛋白分子結(jié)構(gòu)緊密，具有高疏水性，對(duì)蛋白酶的水解作用有較強(qiáng)的抵抗力，現(xiàn)有資料[5-8]顯示，在適宜的酶解條件下，利用不同的蛋白酶水解大米蛋白，其水解度為10%～20%，制約了大米蛋白酶解改性的實(shí)際效果，也導(dǎo)致利用酶法制備活性肽時(shí)產(chǎn)率較低。因此，尋求大米蛋白高效水解技術(shù)是大米蛋白酶法改性的關(guān)鍵。目前很多學(xué)者通過(guò)物理手段提高酶解效率，如超聲波[5,9]、微波[10-11]、超高壓[12-13]和電子束輻照[14-15]等。

電子束輻照(electron beam irradiation,EBI)是一種新型的冷處理改性技術(shù)，與其他物理手段相比，EBI技術(shù)參數(shù)簡(jiǎn)單(只需控制處理劑量)，易控制且操作簡(jiǎn)便，非常適合工業(yè)化應(yīng)用。EBI作用可使蛋白質(zhì)表面微觀結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象發(fā)生改變。林松毅等[14]發(fā)現(xiàn)EBI處理劑量為3.24 kGy 時(shí)，玉米蛋白的表面完整性明顯降低，緊密結(jié)構(gòu)被打開(kāi)。Lv等[16]研究了EBI變性處理對(duì)肌原纖維蛋白的影響，結(jié)果表明1 kGy處理劑量使α-螺旋含量下降，但繼續(xù)增加EBI處理劑量，α-螺旋含量增加。Zhao等[17]發(fā)現(xiàn)EBI處理劑量為0～15 kGy時(shí)，核桃蛋白的非結(jié)晶結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化，但其表面完整性下降，熱穩(wěn)定性增加。Wang等[18]利用EBI變性技術(shù)處理小麥胚芽蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EBI變性處理能降低小麥胚芽蛋白的表面疏水性，并使其二級(jí)結(jié)構(gòu)中的有序α-螺旋結(jié)構(gòu)向無(wú)規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)化。上述研究表明EBI變性處理能改變蛋白結(jié)構(gòu)，但可能會(huì)對(duì)蛋白酶解產(chǎn)生影響。然而，目前關(guān)于EBI技術(shù)對(duì)蛋白酶解敏感性的報(bào)道較少[14]，而關(guān)于EBI變性處理改變蛋白質(zhì)酶解效果的構(gòu)效關(guān)系尚未見(jiàn)報(bào)道。

大米蛋白是植物蛋白中疏水性最強(qiáng)者，本研究擬以大米蛋白為例，研究新型EBI冷處理蛋白質(zhì)變性技術(shù)，探索其提高酶解性能的作用機(jī)理，為植物蛋白的開(kāi)發(fā)利用提供新途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

大米蛋白：無(wú)錫金農(nóng)生物科技有限公司；

堿性蛋白酶：13.8萬(wàn)U/g，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；

中性蛋白酶：7.5萬(wàn)U/g，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；

復(fù)合蛋白酶：12.5萬(wàn)U/g，諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司；

胰蛋白酶：8.7萬(wàn)U/g，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；

其他試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

電子加速器：5.0 MeV型，無(wú)錫愛(ài)邦電子加速器公司；

氨基酸分析液相色譜儀：L-8800型，日本Hitachi公司；

掃描電鏡：TM-3030型，日本Hitachi公司；

FTIR光度計(jì)：Nicolet iS10型，美國(guó)ThermoFisher公司；

熒光光度計(jì)：F-7000型，日本Hitachi公司。

1.2 方法

1.2.1 EBI變性處理大米蛋白 將大米蛋白粉裝入自封袋(聚乙烯)中，使其鋪平后厚度約為1 cm。采用 5.0 MeV 電子加速器進(jìn)行輻照，束流2 mA，傳送速率6 m/min，輻照吸收劑量分別為5，10，20，30，40 kGy，輻照后的樣品儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 大米蛋白酶解 選用4種蛋白酶進(jìn)行水解，其各自最適酶解條件由商家提供，堿性蛋白酶(pH 8.5，55 ℃)，中性蛋白酶(pH 7.0，45 ℃)，復(fù)合蛋白酶(pH 7.0，50 ℃)，胰蛋白酶(pH 8.0，50 ℃)。蛋白酶的最適添加量通過(guò)前期預(yù)試驗(yàn)確定。將大米蛋白配成5 g/100 mL 懸液，在4種酶的最適酶解條件下攪拌30 min，使其充分分散。然后加入蛋白酶進(jìn)行水解120 min。蛋白酶與大米蛋白的比例為1∶100(質(zhì)量比)。通過(guò)加入1 mol/L NaOH溶液控制水解過(guò)程中溶液pH。反應(yīng)結(jié)束后，沸水浴中滅酶10 min。將水解液pH調(diào)至中性后，10 000 r/min離心20 min。上清液冷凍干燥后儲(chǔ)存于-20 ℃?zhèn)溆?。水解過(guò)程中的水解度按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

B——消耗的氫氧化鈉溶液的體積，mL；

Mb——?dú)溲趸c溶液的濃度，mol/L；

α——蛋白平均的解離程度，1/α=1.01；

Mp——水解的蛋白質(zhì)的質(zhì)量，g；

htot——蛋白質(zhì)基質(zhì)肽鍵總數(shù)(對(duì)于大米蛋白取7.4 mmol/g)。

1.2.3 多肽產(chǎn)率測(cè)定 取步驟1.2.2中離心后上清液，與等體積10 g/100 mL三氯乙酸充分混合，4 ℃靜置30 min，8 000 r/min 離心5 min，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液中多肽含量。多肽產(chǎn)率為上清液中多肽的質(zhì)量與原料蛋白中蛋白的量的比值。

1.2.4 電子掃描電鏡 將蛋白樣品置于導(dǎo)電膠表面，進(jìn)行噴金處理。采用掃描電鏡觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)。

1.2.5 傅里葉紅外光譜(FTIR) 稱(chēng)取2～3 mg粉末樣品與適量KBr混合并充分研磨，用壓片機(jī)壓成透明小塊，采集FTIR圖譜。采集參數(shù)為分辨率2 cm-1，掃描范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)32次。利用PeakFit 4.12對(duì)FTIR圖譜中酰胺Ⅰ區(qū)(1 700～1 600 cm-1)進(jìn)行解析，得到蛋白質(zhì)4種二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.2.6 紫外光譜 用0.01 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液配制終濃度為2.0 mg/mL蛋白溶液。用紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)采集紫外光譜。采集參數(shù)為波長(zhǎng)范圍200～400 nm，步長(zhǎng)2.0 nm，速度60 nm/min，以磷酸緩沖液作空白。

1.2.7 內(nèi)源熒光光譜 用0.01 mol/L pH 8.0磷酸緩沖液配制終濃度為0.04 mg/mL蛋白溶液，采集內(nèi)源熒光光譜。采集參數(shù)為波長(zhǎng)范圍300～500 nm，激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，步長(zhǎng)2.5 nm，速度10 nm/s，以磷酸緩沖液作空白。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)形式均為均值±SD。采用SPSS對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Duncan多范圍測(cè)試分析顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EBI變性處理對(duì)大米蛋白水解度的影響

由圖1可知，EBI處理組大米蛋白初始水解速率快，DH值明顯增加，堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶水解過(guò)程中，DH值隨EBI處理劑量的升高快速增加。而中性蛋白酶和胰蛋白酶水解過(guò)程中，隨著EBI處理劑量的增加，DH值增長(zhǎng)比較緩慢。EBI處理劑量30 kGy，水解120 min時(shí)，不同蛋白酶對(duì)大米蛋白的水解度均達(dá)到最大值，DH值分別增加(19.02±0.37)%(堿性蛋白酶)，(16.71±0.48)%(復(fù)合蛋白酶)，(11.44±0.39)%(中性蛋白酶)，(7.26±0.50)%(胰蛋白酶)。在相同的EBI處理劑量下，不同種類(lèi)的蛋白酶水解的大米蛋白的DH值增加程度不同，與蛋白酶的特異性有關(guān)。堿性蛋白酶和中性蛋白酶是非特異性?xún)?nèi)切酶，酶切位點(diǎn)廣泛；復(fù)合蛋白酶含有內(nèi)切蛋白酶和外切肽酶，作用位點(diǎn)較多；胰蛋白酶是特異性?xún)?nèi)切酶，只作用于Lys和Arg殘基中的羧基端，酶切位點(diǎn)有限。當(dāng)大米蛋白在EBI作用下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，作為底物，與具有廣泛特異性的酶的相互作用效果比與限制性?xún)?nèi)切酶的作用效果要好。

圖1 EBI處理劑量和蛋白酶種類(lèi)對(duì)大米蛋白酶解進(jìn)程的影響Figure 1 Effect of irradiation does and enzyme type on enzymatic hydrolysis of rice protein

2.2 EBI變性處理對(duì)多肽產(chǎn)率的影響

由表1可知，采用堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對(duì)大米蛋白進(jìn)行水解，變性處理劑量為10～30 kGy時(shí)，多肽產(chǎn)率隨EBI變性處理劑量的增加而顯著上升，變性處理劑量為30 kGy時(shí)，多肽產(chǎn)率分別增加(13.5±0.29)%和(8.19±0.38)%，當(dāng)變性處理劑量繼續(xù)增加時(shí)，多肽產(chǎn)率無(wú)顯著性變化。而采用中性蛋白酶和胰蛋白酶對(duì)大米蛋白進(jìn)行水解，變性處理劑量為5，10 kGy時(shí)，多肽產(chǎn)率增加效果不顯著(P>0.05)，當(dāng)變性處理劑量為30 kGy時(shí)，大米蛋白多肽產(chǎn)率由(53.62±0.89)%(中性蛋白酶)和(64.16±1.21)%(胰蛋白酶)分別顯著提高至(55.73±1.05)%和(66.92±1.12)%。

2.3 EBI變性處理對(duì)大米蛋白表面形態(tài)的影響

由圖2可知，大米蛋白的微觀表面結(jié)構(gòu)在EBI變性處理前后發(fā)生了明顯的變化。未經(jīng)EBI變性處理的大米蛋白為致密的球狀結(jié)構(gòu)，表面凹凸不平，存在細(xì)小的裂痕和孔隙，但整體完整性較好。經(jīng)EBI變性處理的大米蛋白表面結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的變化。當(dāng)變性處理劑量增加至30 kGy時(shí)，大米蛋白微觀表面完整性被破壞，大量小球形顆粒附著于大顆粒上，顆粒變的疏松?？赡苁荅BI產(chǎn)生的能量使蛋白質(zhì)分子間的氫鍵和范德華力發(fā)生斷裂，破壞蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)。結(jié)果表明，隨著EBI變性處理劑量的增加，大米蛋白致密的球狀結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，比表面積增加。由于表面的孔隙和小顆粒數(shù)量的增加，大米蛋白作為底物在酶解過(guò)程中與蛋白酶接觸的表面積增加，使其更容易被水解。另外，孔隙結(jié)構(gòu)也有利于蛋白酶進(jìn)入底物顆粒內(nèi)部，使肽鍵斷裂，產(chǎn)生更多小分子肽[19]。掃描電鏡的結(jié)果可從宏觀角度解釋EBI變性處理提高大米蛋白水解度的原理。

表1 EBI變性處理劑量對(duì)不同酶水解產(chǎn)物多肽產(chǎn)率的影響?Table 1 Effect of irradiation does on peptide production of rice protein hydrolysates obtained by various enzyme (n=3) %

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖2 不同EBI變性處理劑量下大米蛋白掃描電子顯微鏡圖Figure 2 The SEM picture of rice protein pretreated with different irradiation

2.4 EBI變性處理對(duì)大米蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

1 700～1 600 cm-1的FTIR圖譜為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征振動(dòng)峰，通過(guò)軟件對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析(表2)發(fā)現(xiàn)，大米蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量在EBI變性處理前后發(fā)生了明顯的變化。當(dāng)變性處理劑量為5～30 kGy時(shí)，EBI變性處理組的大米蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量隨變性處理劑量增加顯著下降，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量呈上升趨勢(shì)。EBI變性處理劑量為30 kGy時(shí)，α-螺旋結(jié)構(gòu)含量降低了75.73%，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的含量分別增加了16.63%，10.70%，24.77%。繼續(xù)增加變性處理劑量，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化不顯著(P>0.05)。在蛋白質(zhì)的4種二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋為致密的有序結(jié)構(gòu)，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角屬于相對(duì)舒展的有序結(jié)構(gòu)，而無(wú)規(guī)則卷曲則為無(wú)序結(jié)構(gòu)[16,20]。EBI變性處理使大米蛋白中致密的α-螺旋結(jié)構(gòu)向相對(duì)舒展的β結(jié)構(gòu)以及無(wú)序的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，說(shuō)明EBI作用破壞了大米蛋白緊密的分子結(jié)構(gòu)，使分子結(jié)構(gòu)變動(dòng)靈活疏松，更有利于蛋白質(zhì)與酶接觸，從而增強(qiáng)酶解效果。

2.5 紫外可見(jiàn)光光譜分析

由圖3(a)可知，EBI作用后，大米蛋白的特征紫外吸收峰隨變性處理劑量的增加呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，但都遠(yuǎn)大于變性處理前的水平。說(shuō)明EBI變性處理使大米蛋白分子展開(kāi)，內(nèi)部顯色團(tuán)外露，但當(dāng)變性處理劑量增加到一定程度時(shí)，蛋白質(zhì)分子出現(xiàn)重新聚集的趨勢(shì)，導(dǎo)致吸收峰強(qiáng)度下降。200 nm處的特征吸收峰由肽鍵貢獻(xiàn)[21]，EBI變性處理后，其吸收強(qiáng)度增加，表明大米蛋白經(jīng)EBI變性處理后其肽鍵的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，更多的肽鍵暴露到分子表面參與酶解反應(yīng)。

表2 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)百分含量?Table 2 Results of secondary structure analysis by FTIR (n=3) %

? 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

圖3 EBI變性處理前后蛋白質(zhì)的紫外可見(jiàn)光光譜分析Figure 3 The UV spectra of protein with or without EBI treatment

由圖3(b)可知，當(dāng)氨基酸殘基所處的微環(huán)境疏水性下降時(shí)，其紫外吸收二階導(dǎo)光譜特征峰向低波數(shù)遷移(藍(lán)移)[22]。270～282 nm處吸收峰歸屬于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨基酸殘基，其λmax從279 nm藍(lán)移至276 nm(30 kGy)；288 nm處吸收峰由色氨酸和酪氨酸殘基共同貢獻(xiàn)，EBI作用使其發(fā)生3 nm藍(lán)移(30 kGy)。吸收峰的藍(lán)移說(shuō)明EBI變性處理后的大米蛋白分子展開(kāi)，芳香族氨基酸殘基所處的微環(huán)境更加親水，與蛋白酶作用的空間位阻下降，從而使酶解效率提高。

2.6 內(nèi)源熒光光譜分析

由圖4可知，隨著EBI變性處理劑量的增加，大米蛋白的最大吸收波長(zhǎng)向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移動(dòng)，在變性處理劑量為30 kGy時(shí)，紅移程度最大(由335 nm紅移至347 nm)。紅移程度越大，說(shuō)明蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的變化程度越大，蛋白質(zhì)分子更加伸展[23-24]。結(jié)合圖3(b)表明大米蛋白的空間構(gòu)象發(fā)生變化，EBI作用使蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象展開(kāi)，內(nèi)部疏水區(qū)的酶切位點(diǎn)暴露，參與酶解反應(yīng)。

圖4 EBI變性處理前后蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光光譜Figure 4 The intrinsic fluorescence spectrum of protein with or without EBI treatment

3 結(jié)論

EBI變性處理能有效提高大米蛋白的酶解效率和多肽產(chǎn)率。不同蛋白酶對(duì)EBI變性大米蛋白的水解度不同：堿性蛋白酶>復(fù)合蛋白酶>中性蛋白酶>胰蛋白酶，其中EBI輔助堿性蛋白酶水解效果最好，大米蛋白水解度提高(19.02±0.37)%，多肽產(chǎn)率提高(13.50±0.29)%。表面形態(tài)分析表明，EBI變性處理使致密的大米蛋白顆粒變得疏松，顆?；潭仍黾?；此外，EBI變性技術(shù)使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生重組，致密的α-螺旋結(jié)構(gòu)向舒展的β結(jié)構(gòu)和無(wú)序結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，使蛋白分子靈活性增加；紫外光譜和內(nèi)源熒光光譜分析表明，EBI變性技術(shù)使大米蛋白分子空間構(gòu)象展開(kāi)，暴露出更多包埋在內(nèi)部疏水區(qū)域的活性基團(tuán)。EBI變性處理導(dǎo)致的大米蛋白結(jié)構(gòu)的變化，既增加了蛋白質(zhì)與酶接觸的比表面積，又釋放出更多的酶切位點(diǎn)，從而提高了酶解效率。目前，對(duì)動(dòng)植物蛋白進(jìn)行適度酶解是改善其溶解性、乳化性、起泡性以及抗氧化性等生理活性的重要手段。通過(guò)酶法改性能夠提高蛋白資源的利用率，提升其資源價(jià)值。但隨著水解程度的加深，蛋白酶解物的功能性質(zhì)和生理活性不會(huì)無(wú)限增加，當(dāng)水解度達(dá)到一定程度時(shí)，其功能性質(zhì)和生理活性出現(xiàn)下降的趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)EBI變性處理能有效提高大米蛋白的酶解效率，提高多肽產(chǎn)率，因此，后續(xù)可對(duì)經(jīng)過(guò)EBI變性處理的大米蛋白酶解物的功能性質(zhì)和生理活性進(jìn)行深入研究，以擴(kuò)大大米蛋白的利用率。