肖 妍 劉蕓宏 高貴田,2 曹 凡 馬燕萍 趙武奇 雷玉山

(1.陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119；2.陜西省獼猴桃工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710404；3.陜西省農(nóng)村科技開發(fā)中心，陜西 西安 710054)

獼猴桃潰瘍病是由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)引起的細(xì)菌性病害[1]，嚴(yán)重影響獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前，該病菌的檢測主要采用PCR技術(shù)，但是常規(guī)的PCR技術(shù)不能區(qū)分樣品中病原菌的生活狀態(tài)，在對(duì)活菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增的同時(shí)，也會(huì)擴(kuò)增自由狀態(tài)的DNA或者死菌的DNA[2]，檢測產(chǎn)生假陽性，無法確定Psa的生活狀態(tài)，無法對(duì)潰瘍病的發(fā)生趨勢(shì)作出科學(xué)預(yù)測，也無法對(duì)消毒、防治效果做出科學(xué)判斷。

疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)是一種能和DNA共價(jià)交聯(lián)的熒光染料。PMA可以通過死菌損傷的細(xì)胞膜進(jìn)入死菌細(xì)胞，并且光照可使PMA的光敏基團(tuán)轉(zhuǎn)化為氮賓自由基，與死菌DNA發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，從而抑制后續(xù)DNA擴(kuò)增[3-6]；活菌細(xì)胞膜完整，PMA不能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；剩下的少量游離在溶液中的PMA則可與溶液中的水分子結(jié)合形成羥胺(—NH—OH)，失去與DNA結(jié)合的活性；PMA-qPCR技術(shù)就是利用這一特性，實(shí)現(xiàn)了只擴(kuò)增活細(xì)胞的DNA，而不擴(kuò)增死細(xì)胞的DNA[4]。

近年來，PMA-qPCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種微生物活死菌的鑒別檢測[7]，但該技術(shù)用于鑒別陜西獼猴桃潰瘍菌優(yōu)勢(shì)病原菌仍鮮見報(bào)道。于小龍等[8]建立的PMA-qPCR方法，能有效對(duì)包括VBNC狀態(tài)在內(nèi)的青枯菌活菌進(jìn)行檢測；溫書香等[9]通過優(yōu)化PMA處理?xiàng)l件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)結(jié)核桿菌活菌的快速檢測；於穎等[10]在PMA濃度30 μg/mL下，曝光5 min，可實(shí)現(xiàn)對(duì)金黃色葡萄球菌活菌篩選的作用。

世界Psa主要分為三大類群，中國流行的獼猴桃潰瘍病的Psa與最近在意大利、新西蘭、西班牙、法國、葡萄牙等國流行的Psa為同一類群[11]。由于其同屬的Pseudomonassyringaepv.theae和Pseudomonasavellanae與Psa的親緣關(guān)系非常近，常規(guī)的分子標(biāo)記技術(shù)很難將它們區(qū)分開[12]。Gallelli等[13]根據(jù)獼猴桃潰瘍菌的hrpW基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)P3F/P5R1引物，不僅能區(qū)分Pseudomonassyringaepv.theae和Pseudomonasavellanae，也可以準(zhǔn)確區(qū)分出強(qiáng)致病力菌株(Psa-V)與弱致病力菌株，朱丹等[14]克隆了陜西獼猴桃優(yōu)勢(shì)Psa的hrpW基因保守區(qū)，其序列與Psa-V同源性為99%。

因此本研究擬利用陜西獼猴桃優(yōu)勢(shì)Psa的hrpW的P3F/P5R1為引物，建立PMA-qPCR檢測方法，研究PMA濃度、暗孵育時(shí)間及曝光時(shí)間等對(duì)Psa擴(kuò)增的影響，并將死菌和活菌按一定的比例混合，對(duì)PMA-qPCR方法在實(shí)際檢測中的可行性進(jìn)行分析。為陜西獼猴桃潰瘍病的快速檢測、準(zhǔn)確診斷及病情預(yù)測提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae，Psa)：為陜西獼猴桃潰瘍病優(yōu)勢(shì)病原菌[15]，西北農(nóng)林科技大學(xué)植保學(xué)院黃麗麗教授惠贈(zèng)；

PMA：美國Biotium公司；

Psa質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品：生工生物工程(上海)股份有限公司；

Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒、即用PCR擴(kuò)增試劑盒：上海生工生物工程有限公司；

SYBR Green I試劑盒：天根生化科技有限公司；

鹵素?zé)簦?00 W，飛利浦燈具有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Psa菌懸液的制備 挑取Psa單菌落于King’s B液體培養(yǎng)基，24 ℃、190 r/min恒溫震蕩12 h，無菌水調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×107CFU/mL。

1.2.2 Psa菌膜損傷時(shí)間的確定 吸取500 μL菌懸液于1.5 mL的離心管中，沸水浴(98.3 ℃)分別處理10，11，12，13，14，15 min后立即在冰上冷卻至室溫，對(duì)照組未經(jīng)沸水浴處理。吸取100 μL涂布于King’s B固體培養(yǎng)基上，24 ℃培養(yǎng)，3 d后統(tǒng)計(jì)單菌落數(shù)，無菌落生長視為全部是死菌，該時(shí)間為膜損傷菌的處理時(shí)間。

1.2.3 DNA提取 吸取500 μL菌液，8 000 r/min離心2 min 棄上清，按照DNA Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒的說明書提取DNA。

1.2.4 qPCR檢測 qPCR引物根據(jù)Gallelli等[13]，修改如下，引物序列為：GGTTTCGGACACCGCAGGTTCTACCGAG和CTTCCTGATCCCCGTTACCCATCGA-C，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反應(yīng)總體系為10 μL，DNA模板1.0 μL，SYBR PCR premix 5.0 μL，引物P3F、P5R1各0.6 μL，ddH2O補(bǔ)足至反應(yīng)總體積。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，72 ℃退火20 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸20 s。

1.2.5 PMA處理的條件

(1)PMA工作液的制備：1 mg PMA于8 000 r/min離心2 min，加入20%二甲基亞砜(DMSO)溶液200 μL充分溶解，得到5 μg/μL PMA儲(chǔ)備液，于-20 ℃避光保存。

(2)抑制死菌擴(kuò)增的PMA最小濃度：分別吸取6份膜損傷的死菌懸液500 μL于1.5 mL離心管，加入PMA，使PMA的終濃度分別為0，90，95，100，105，110 μg/mL，顛倒混勻，暗孵育8 min，將樣品置于冰上，離心管口朝上，置于距樣品20 cm的500 W鹵素?zé)粝拢毓馓幚?0 min，提取樣品DNA，用qPCR檢測，從而確定能夠完全抑制死菌擴(kuò)增的PMA最小濃度。

(3)不影響活菌擴(kuò)增的PMA最大濃度：吸取4份活菌懸液500 μL于1.5 mL離心管中，加入PMA，使PMA的終濃度分別為0，105，110，120 μg/mL，顛倒混勻，暗孵育8 min，將樣品置于冰上，離心管口朝上，置于距樣品20 cm 的500 W鹵素?zé)粝?，曝光處?0 min，提取樣品DNA，用qPCR分別檢測，研究不抑制活菌擴(kuò)增的PMA最大濃度。

(4)暗孵育時(shí)間的優(yōu)化：分別吸取5份膜損傷的死菌懸液500 μL于1.5 mL離心管，加入確定的最佳PMA工作液濃度，分別暗孵育5，6，7，8，9，10 min，將樣品置于冰上，離心管口朝上，置于距樣品20 cm的500 W鹵素?zé)粝拢毓馓幚?0 min，未加PMA的樣品作為陽性對(duì)照，提取DNA，用qPCR檢測，研究完全抑制死菌擴(kuò)增的最佳暗孵育時(shí)間。

(5)曝光時(shí)間的優(yōu)化：分別吸取6份膜損傷的死菌懸液500 μL于1.5 mL離心管，用確定的最佳PMA工作液濃度和最佳暗孵育時(shí)間進(jìn)行處理，將樣品置于冰上，離心管口朝上，置于距樣品20 cm的500 W鹵素?zé)粝?，分別曝光處理5，10，15，20，25 min，未加PMA的樣品作為陽性對(duì)照，確定能夠完全抑制死菌擴(kuò)增的最佳曝光時(shí)間。

(6)PMA對(duì)不同比例活菌/死菌樣品的檢測效果：將培養(yǎng)至107CFU/mL的活菌和死菌按照表1進(jìn)行混合，經(jīng)合適條件的PMA處理提取DNA，進(jìn)行PMA-qPCR反應(yīng)，以未加PMA處理的樣品作為對(duì)照。

表1 不同比例的活死菌樣品Table 1 Proportion of different live and dead bacteria

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取已知濃度的Psa質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(由生工生物工程〔上海〕股份有限公司完成)，根據(jù)式(1)換算成基因拷貝數(shù)。

(1)

式中：

A——質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)，拷貝/μL；

C——DNA濃度，ng/μL；

M——片段大小；

NA——阿伏伽德羅常數(shù)，6.02×1023。

將Psa質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋至101，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，以拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值和所得Ct值為橫、縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 PMA-qPCR的靈敏度 菌液10倍梯度稀釋至101，經(jīng)合適條件的PMA處理提取DNA，進(jìn)行PMA-qPCR的靈敏度分析。

1.2.8 獼猴桃枝條樣品活菌檢測

(1)枝條樣品的染菌：取無菌的獼猴桃枝條，切成25 g 的小塊，碾碎后放入無菌均質(zhì)杯中，加入225 mL無菌水，8 000 r/min均質(zhì)2 min，制成樣品勻液。分別加入101～107CFU/mL的潰瘍菌活菌懸液，作為人工染菌的樣品。

(2)采用合適條件的PMA處理提取DNA，進(jìn)行PMA-qPCR檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到基因拷貝數(shù)，與平板計(jì)數(shù)的結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.9 數(shù)據(jù)分析 采用DPS 7.05對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)，P<0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 Psa膜損傷時(shí)間的確定

本試驗(yàn)采用食品上較常使用的高溫滅菌方式制備死菌懸液[16]。菌懸液濃度為1×107CFU/mL，熱處理不同時(shí)間，稀釋一定濃度后涂布，24 ℃培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)結(jié)果如表2 所示，熱處理時(shí)間越長，對(duì)活菌的滅活效率越高，當(dāng)膜損傷時(shí)間為13 min時(shí)，無菌落生長，因此，以13 min的沸水浴處理作為活菌的全部致死時(shí)間。

表2 時(shí)間對(duì)菌液滅活效率的影響Table 2 Effect of heat-treatment time on sterilizing rate

2.2 PMA處理?xiàng)l件的確定

2.2.1 PMA濃度的優(yōu)化

(1)抑制死菌擴(kuò)增的PMA最小濃度：由圖1可知，隨著PMA濃度的增大，Ct值逐漸增大，PMA的濃度為100 μg/mL時(shí)，Ct值增大比較小，當(dāng)PMA濃度為105 μg/mL 時(shí)，對(duì)死菌DNA擴(kuò)增抑制達(dá)到最大，PMA濃度為110 μg/mL時(shí)，Ct值幾乎無變化，與PMA濃度為105 μg/mL相比，無顯著性差異(P>0.05)，因此，確定抑制死菌DNA擴(kuò)增最小PMA濃度為105 μg/mL。

PMA是一種能和死菌DNA共價(jià)交聯(lián)的熒光染料，活菌的完整細(xì)胞膜可阻止PMA進(jìn)入，從而達(dá)到檢測活菌效果。但是，PMA濃度過高可能對(duì)活菌的細(xì)胞產(chǎn)生影響，導(dǎo)致假陰性的檢測結(jié)果[17]。趙麗青等[18]在PMA濃度2 μg/mL下，500 W鹵素?zé)羝毓?5 min可達(dá)到檢測金黃色葡萄球菌活菌的目的。曹夢(mèng)琪等[19]在PMA濃度15 μg/mL 下，650 W鹵鎢燈曝光5 min，可達(dá)到檢測青枯菌活菌的目的。於穎等[10]在PMA濃度30 μg/mL下，650 W鹵素?zé)羝毓? min可達(dá)到篩選金黃色葡萄球菌活菌的作用，并且試驗(yàn)中的菌懸液濃度均在108CFU/mL。本研究得到的Psa的最佳PMA濃度為105 μg/mL，菌懸液濃度為107CFU/mL。細(xì)菌的細(xì)胞膜差異很大，革蘭氏陰性菌比革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜薄，對(duì)PMA的通透性好[20]，PMA使用濃度應(yīng)該較低，但本研究得到的Psa的最佳PMA濃度與已有文獻(xiàn)相差較大，可能與陜西獼猴桃優(yōu)勢(shì)病原菌本身對(duì)外界環(huán)境的抵抗能力有關(guān)，其對(duì)PMA產(chǎn)生抵抗的詳細(xì)機(jī)理還需更深層次的探究。

圖1 PMA濃度對(duì)膜損傷菌的影響Figure 1 Effect of PMA concentration on heat-treated bacteria

(2)不影響活菌擴(kuò)增的PMA最大濃度：由圖2可知，活菌DNA的Ct值隨PMA濃度的增大而增大，PMA濃度為105 μg/mL時(shí)，與未加PMA的Ct值無顯著性差異(P>0.05)，說明此濃度不會(huì)對(duì)活菌DNA的擴(kuò)增產(chǎn)生較大影響，但是當(dāng)PMA使用濃度>105 μg/mL時(shí)，與未加PMA的Ct值有顯著性差異(P<0.05)，說明PMA濃度>105 μg/mL對(duì)活菌有一定的影響，因此，選擇PMA濃度為105 μg/mL作為不影響活菌擴(kuò)增的PMA最大濃度。

2.2.2 暗孵育時(shí)間的確定 由圖3可知，隨著暗孵育時(shí)間的延長，Ct值逐漸增大，暗孵育時(shí)間為7 min，Ct值增大比較小，當(dāng)暗孵育時(shí)間延長至8 min，對(duì)死菌DNA擴(kuò)增抑制達(dá)到最大，暗孵育時(shí)間>8 min，Ct值幾乎無變化，與暗孵育時(shí)間8 min相比，無顯著性差異(P>0.05)，8 min 的暗孵育時(shí)間可完全抑制死菌DNA擴(kuò)增，因此確定最佳的暗孵育時(shí)間為8 min。

圖2 PMA濃度對(duì)活菌的影響Figure 2 Effect of PMA concentration on live bacteria

抑制膜損傷菌DNA擴(kuò)增除PMA濃度外，最佳的暗孵育時(shí)間也至關(guān)重要。PMA在光照條件下，與水分子結(jié)合生成羥胺，羥胺不能和DNA分子結(jié)合，從而無法抑制死菌的DNA，因此，在樣品中加入PMA要避光處理合適的時(shí)間，而暗孵育時(shí)間的長短受樣品菌濃度、PMA濃度、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等因素影響。結(jié)果表明，8 min的暗孵育時(shí)間可充分使PMA與DNA結(jié)合，曝光處理后與DNA結(jié)合形成不可逆的共價(jià)交聯(lián)結(jié)構(gòu)，抑制死菌DNA擴(kuò)增。未與DNA結(jié)合的PMA曝光時(shí)可與水分子反應(yīng)生成羥胺而失去活性[21-22]。

圖3 暗孵育時(shí)間對(duì)膜損傷菌的影響Figure 3 Effect of incubation time on heat-treated bacteria

2.2.3 曝光時(shí)間的確定 由圖4可知，隨著曝光時(shí)間的延長，Ct值逐漸增大，曝光時(shí)間為15 min，Ct值增大比較小，當(dāng)曝光時(shí)間延長至20 min，對(duì)死菌DNA擴(kuò)增抑制達(dá)到最大，曝光時(shí)間為25 min，Ct值幾乎無變化，與曝光時(shí)間20 min相比，無顯著性差異(P>0.05)。因此，20 min 的曝光時(shí)間可完全抑制死菌DNA擴(kuò)增，確定最佳的曝光時(shí)間為20 min。

圖4 曝光時(shí)間對(duì)膜損傷菌的影響Figure 4 Effect of light exposure time on heat-treated bacteria

曝光時(shí)間是影響活菌檢測的另一個(gè)重要因素，光照時(shí)間不充分，PMA不能完全被鈍化，部分殘留在菌懸液中，提取DNA時(shí)，活細(xì)胞的細(xì)胞膜被破壞，暴露出的DNA被PMA分子結(jié)合，使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性。鹵鎢燈的選擇也會(huì)影響到曝光的時(shí)間，650 W鹵鎢燈雖然能降低耗時(shí)，但同時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量的熱量，有可能造成管口附近菌體的死亡。所以本研究選用500 W的鹵鎢燈距離20 cm，曝光20 min，一方面使與DNA結(jié)合的PMA與DNA分子進(jìn)一步充分交聯(lián)，同時(shí)使游離的PMA完全被鈍化。

2.2.4 PMA對(duì)不同比例活菌和膜損傷菌影響 PMA對(duì)不同比例活菌和死菌的影響如表3所示，當(dāng)樣品全部為死菌時(shí)(活菌比例0%)，未加PMA處理的Ct值為16.21，加PMA處理后Ct值為23.28，差異極顯著(P<0.01)，活菌的比例為25%，50%，75%，未加PMA處理的樣品Ct值明顯低于加入PMA樣品的Ct值，說明PMA有抑制死菌DNA擴(kuò)增的作用。當(dāng)樣品中活菌比例達(dá)到100%時(shí)，未加PMA樣品的Ct值與加入PMA處理樣品的Ct值無顯著性差異(P>0.05)，說明加入的PMA對(duì)活菌的擴(kuò)增幾乎無影響。同時(shí)，活菌比例的增大導(dǎo)致Ct值相應(yīng)的減少，說明經(jīng)PMA處理后死菌DNA被PMA抑制不能擴(kuò)增，可以消除死菌對(duì)PCR的擴(kuò)增，降低假陽性結(jié)果出現(xiàn)的可能性。

表3 不同比例活菌樣品PMA-qPCR結(jié)果?Table 3 PMA-qPCR Results of different live bacteria proportion

? △Ct=PMA處理組-對(duì)照組。

2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品初始拷貝數(shù)為6.39×108拷貝/μL。將其進(jìn)行10倍梯度稀釋，使?jié)舛确秶?×101～1×108拷貝/μL。以拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值和所得Ct值為橫、縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖5?？梢钥闯鰞烧叽嬖趯?duì)應(yīng)線性關(guān)系，r2=0.995 5，斜率為-3.220 4，該方法最低能夠檢出6.39×102拷貝/μL的潰瘍菌。

2.4 PMA-qPCR的靈敏度

菌液10倍梯度稀釋至101，102，103，104，105，106，107，經(jīng)合適條件的PMA處理提取DNA，進(jìn)行PMA-qPCR反應(yīng)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到定量結(jié)果見表4，PMA-qPCR方法最低可檢出2.38×102拷貝/μL的潰瘍菌見圖6。

2.5 獼猴桃枝條樣品活菌檢測

染菌樣品經(jīng)PMA處理提取DNA，進(jìn)行PMA-qPCR檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到基因拷貝數(shù)，與平板計(jì)數(shù)的結(jié)果進(jìn)行比較，顯示兩者無顯著性差異(P>0.05)(表5)。

圖5 Psa質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 5 Plasmid standard curve

表4 不同稀釋梯度菌液的PMA-qPCR結(jié)果?Table 4 PMA-qPCR results of different dilution bacteria

? UD表示未測得。

1～5分別為稀釋至107，106，105，104，103的菌懸液擴(kuò)增曲線，最低可檢出2.38×102拷貝/μL的潰瘍菌

圖6 PMA-qPCR靈敏度分析
Figure 6 PMA-qPCR sensitivity analysis

表5 染菌樣品PMA-qPCR結(jié)果與平板計(jì)數(shù)結(jié)果比較?Table 5 Compare results of PMA-qPCR with plate count

? UD表示未測得。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以獼猴桃潰瘍菌為研究對(duì)象，通過優(yōu)化PMA處理?xiàng)l件，實(shí)現(xiàn)檢測陜西獼猴桃潰瘍病優(yōu)勢(shì)病原菌活菌的目的。結(jié)果表明，PMA與死菌共價(jià)交聯(lián)的最佳濃度為105 μg/mL，最佳暗孵育時(shí)間為8 min，最佳曝光時(shí)間為20 min，在此條件下，Psa死菌擴(kuò)增被抑制，而活菌的擴(kuò)增未受影響。同時(shí)，雖然優(yōu)化后的PMA濃度對(duì)活菌的擴(kuò)增未產(chǎn)生影響，但是該濃度相對(duì)此類文獻(xiàn)而言還是偏高，所以對(duì)于陜西獼猴桃潰瘍病優(yōu)勢(shì)病原菌是否對(duì)PMA具有更強(qiáng)的抵抗力，還需要進(jìn)一步研究。