黃明遠(yuǎn)，范 晶，唐 梅，劉忠和，李 軍

（1.樂山師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，四川 樂山 614000；2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041）

綬草（Spiranthes sinensis（Pers.）Ames）為蘭科綬草屬多年生宿根性草本地生蘭，是世界上最小的蘭花[1-2]。因其花序呈螺旋狀如綬帶，植株矮小，故得名綬草。在20～30 a 前，綬草曾廣布于全國各地及世界多個國家，由于大氣環(huán)境變化、土地過度開發(fā)與藥用采掘，現(xiàn)在全國乃至全球綬草處于瀕危狀態(tài)，已被列入《瀕危野生動植物物種國際貿(mào)易公約》（CITES）的附錄Ⅱ中，并被列入我國《國家重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄（第二批）》中，為Ⅱ級保護(hù)植物[3]。綬草植株玲瓏，花形別致奇特，有淡雅的香味，可引入園林觀賞。綬草肉質(zhì)根似人參，廣為民間藥用，稱為盤龍參，具有滋陰涼血、益氣生津、補(bǔ)氣助陽、清熱解毒、消腫散結(jié)之功效。它在臨床上用于病后體虛、神經(jīng)衰弱、肺結(jié)核咯血、咽喉腫痛、小兒夏季熱、糖尿病、白帶、腰酸、頭暈、遺精；外用可治療蛇咬傷、瘡瘍癰腫[4]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，綬草對S180肉瘤有較明顯的抑制作用[5]，綬草中所含的阿魏酸二十八醇酯（octacosyl ferulate）已被證實(shí)有抗腫瘤作用[6]。

綬草開發(fā)利用的前景看好，是具有發(fā)展?jié)摿Φ臑l危植物。由于綬草在野外只有散生分布，無純?nèi)郝?，植株矮小，?shù)量稀少，制約了這一植物的研究與開發(fā)。因此，進(jìn)行綬草的野生變家種及半野生栽培，探索其生長習(xí)性及遺傳特性等系列研究，值得重視。在綬草引種栽培與繁殖試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，綬草的野生性較強(qiáng)，種子細(xì)小如沙，發(fā)芽率極低，人工繁殖栽培具有難度。丁蘭等[7]首次成功實(shí)現(xiàn)了綬草的非共生萌發(fā)和種苗的快繁，但認(rèn)為盤龍參種子的萌發(fā)率仍然很低，特別是能夠萌發(fā)且發(fā)育形成種苗的更低，因此，仍需進(jìn)行與之相關(guān)的深入研究。當(dāng)前我國綬草栽培與繁殖研究尚處于初期階段[8-11]，綬草的栽培繁殖技術(shù)尚需深入探索。關(guān)于對綬草生長與繁殖較深入的研究未見報(bào)道。

本研究對影響綬草栽培與繁殖的主要因素進(jìn)行試驗(yàn)探索，以獲得其有效的培養(yǎng)繁殖條件，對保存與繁衍這一瀕危物種具有現(xiàn)實(shí)意義，旨在為瀕危植物綬草的引種栽培擴(kuò)大繁殖起到拋磚引玉作用。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

把2006年來在四川樂山、峨嵋、峨邊、淋川等地收集的野生綬草進(jìn)行半野生種植，經(jīng)選育種子繁殖的生長基本一致的1年生幼苗作為試驗(yàn)栽培材料。

綬草益生菌液為自制。用改良PDA 培養(yǎng)配方，通過液體培養(yǎng)，從綬草植株中分離多種內(nèi)生菌培養(yǎng)的混合菌液，檢測為3.24×105cfu/mL[12-14]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同土壤及施綬草益生菌液對綬草生長與繁殖的影響 按王良信[15]的方法，在四川樂山市沙灣區(qū)葫蘆鎮(zhèn)，選用丘陵低段（海拔537 m）棕黃色山地土、壩區(qū)（海拔486 m）褐黃色草坪土、大渡河灘（海拔432 m）沙壤土設(shè)立試驗(yàn)地，試驗(yàn)面積各為90 m2，共為270 m2。周圍土地為同一栽培與管理水平的蔬菜。4月初在各試驗(yàn)地規(guī)劃受試區(qū)組位段、重復(fù)及隔離帶，平整土地，做1.25 m 寬的土廂，廂溝深15 cm 左右，供綬草栽培。試驗(yàn)處理分別為：A.棕黃色山地土組；B.褐黃色草坪土組；C.壩區(qū)沙壤土組；As.棕黃色山地土組+綬草益生菌液；Bs.褐黃色草坪土組+綬草益生菌液；Cs.壩區(qū)沙壤土組+綬草益生菌液。綬草益生菌試驗(yàn)組在供試土廂地段土壤上，于16∶30 將3.24×105cuf/mL 綬草益生菌液稀釋100 倍，每組取3 000 mL 均勻噴施后，再進(jìn)行栽培。每組栽培綬草（1年生同等大小植株，塊根帶3.5 cm×4.0 cm 原栽培土）60 株，按25 cm×25 cm株行距在土廂上進(jìn)行栽培，進(jìn)行一致的地間管理。連續(xù)2 a 觀察其生長狀況。

1.2.2 溫度與光照對綬草生長與繁殖的影響 把1年生綬草栽培于15 cm×15 cm 塑料營養(yǎng)杯中，栽培基質(zhì)采用褐紫色草坪土+綬草益生菌液。設(shè)4 個處理：Ⅰ.自然，放置于室外草坪中（30 盆）；Ⅱ.大棚，置于棚內(nèi)（30 盆）；Ⅲ.植物組培室，置于組培架上（30 盆），溫度與光照（光源為LED）模擬自然；Ⅳ.光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)（30 盆），溫度與光照（光源為LED）模擬接近自然設(shè)置。4 個處理進(jìn)行常規(guī)日常管理，觀察其1 a 中生活史狀況。光照培養(yǎng)箱型號MGC-300A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司制造。

1.2.3 遮光度對綬草生長與繁殖的影響 該因素試驗(yàn)在葫蘆鎮(zhèn)壩區(qū)（海拔486 m）褐黃色草坪土試驗(yàn)地實(shí)施，試驗(yàn)面積為360 m2，栽培方式及噴灑綬草益生菌液按照1.2.1。設(shè)4 個處理組：裸栽（0%遮光度，裸栽出現(xiàn)雜草即除）；10%左右遮光度，即利用禾本科草坪禾草類進(jìn)行控制遮光；20%遮光度（用遮陽網(wǎng)）；30%遮光度（用遮陽網(wǎng)）。各受試組栽培綬草按要求進(jìn)行日常地間管理。并觀察其1 a 生長狀況。

1.2.4 水肥條件對綬草生長與繁殖的影響 水肥試驗(yàn)采用褐紫色草坪土+綬草益生菌液，1年生綬草在春季栽培于15 cm×15 cm 塑料營養(yǎng)杯中進(jìn)行，各處理為30 盆。土壤相對含水量設(shè)3 個處理，分別為：30%～40%，50%～60%，70%～80%，觀察其生長狀況。肥料試驗(yàn)營養(yǎng)杯土壤相對含水量控制在60%左右，肥料采用腐殖質(zhì)、雞糞、麻枯餅（質(zhì)量比為5∶3∶2）配比，經(jīng)半年的密閉堆漚，充分腐熟，施用時按質(zhì)量濃度稀釋成1∶1 000，每次按钚定量施50 mL。共設(shè)3 個施肥處理：綬草春季出苗后施1 次肥；綬草春季出苗后與夏初花葶出芥時各施1 次肥；綬草春季與初秋前后出苗苗高2 cm 時和夏初花葶出芥時各施1 次肥。以用清水50 mL（不加肥）為對照。來年夏季盛花期收獲全株，進(jìn)行質(zhì)量比較。

1.2.5 栽培方式對綬草植?？剐缘挠绊?試驗(yàn)在沙灣區(qū)加農(nóng)鎮(zhèn)（海拔463 m）實(shí)施，供試綬草均為1年生。按園林設(shè)計(jì)布局把綬草引入城鎮(zhèn)綠化草坪中，與禾本科草坪混栽，受試草坪面積為721 m2；地栽采用褐紫色草坪土+綬草益生菌液，栽培方式按照1.2.1，試驗(yàn)地面積為100 m2。日常管理分別按園林草坪管理方式與藥材種植地間管理方式進(jìn)行。持續(xù)2 a 觀察其生長抗性狀況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行質(zhì)量比較，數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 以及Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種土壤與施綬草益生菌液對綬草生長與繁殖的影響

綬草入藥生長年限要3 a 以上，長勢好的2 a亦可，故本研究以1年生的綬草種苗栽培2 a，設(shè)為1 個試驗(yàn)栽培周期。綬草盡管螺旋狀無限花序產(chǎn)生的可孕育蒴果較多（通常20～40 個，花序上部孕育的瘦癟蒴果，種子不育，未統(tǒng)計(jì)），每個蒴果有數(shù)粒細(xì)小如沙的種子，種子具雙翼；成熟的蒴果開裂，種子散落土中，發(fā)芽率很低。由于種子太小，容易失水喪失萌發(fā)力；且種子無胚乳，胚發(fā)育不完全，胚要經(jīng)過后熟階段才能完成胚的分化，形成胚根與胚芽，并需有土壤中一定的萌發(fā)菌[16]參與。種子發(fā)芽率低，而且種子出芽后僅少數(shù)能成長為植株，繁殖率極低，故表1種子繁殖用植株的增殖比體現(xiàn)。綬草為蘭科綬草屬草本植物，并不是在同一土壤類型及氣候環(huán)境下就能生長，生存的前提條件是土壤環(huán)境必須有一定量的綬草益生菌，故移栽時，根際周圍要帶原生長土，這種土含有綬草益生菌。

表1 3 種栽培土壤及綬草益生菌液使用對綬草生長與繁殖的影響（2年生植株，n＝3）

由表1可知，3 種土壤中，綬草從栽培到繁殖，褐黃色草坪土栽培最佳，壩區(qū)沙壤土稍次，再次為棕黃色山地土。從肉質(zhì)根長度看，壩區(qū)沙壤土栽培最長，其次為褐黃色草坪土，再次為棕黃色山地土，這與土壤質(zhì)地有關(guān)。壩區(qū)沙壤土疏松，表層沙土蒸發(fā)快，故肉質(zhì)根易往下扎。這種土雖宜水透氣，但保水保肥性不強(qiáng)。棕黃色山地土雖保水保肥性能強(qiáng)，但偏黏重，土壤透氣性較差，故肉質(zhì)根長勢不如另2 種土壤。褐黃色草坪土團(tuán)粒結(jié)構(gòu)較好，土壤透氣濕潤，宜水性較好，草類根系自身產(chǎn)生的內(nèi)生真菌，根際間的交流在土壤中可能衍生出有利于綬草生長的有益微生物[17]，雖肉質(zhì)根長度比壩區(qū)沙壤土稍短，但更肥壯、肉質(zhì)根簇狀分支數(shù)更多、鮮質(zhì)量更高，植株長勢、繁殖好于其他2 種土壤。3 種土壤添加綬草益生菌液后，生長勢與繁殖率提高，這是因?yàn)橹仓昱c土壤中的綬草益生菌有共生關(guān)系，這些益生菌在土壤中生活與繁殖過程能為綬草提供所需營養(yǎng)元素，促進(jìn)土壤礦質(zhì)元素轉(zhuǎn)化，幫助其對營養(yǎng)元素的吸收，產(chǎn)生對植株生長有益的如赤霉素、細(xì)胞分裂素等代謝產(chǎn)物，促進(jìn)植株健壯，提高其抗逆能力。

2.2 溫度與光照對綬草生長與繁殖的影響

綬草在當(dāng)?shù)?，通?月底5 ℃左右開始冒芽，8 ℃以上新葉伸出。幼葉發(fā)育至成葉（4月下旬），白天溫度在8～28 ℃，午時光照強(qiáng)度在3 000～15 000 lx。4月中旬花芽從葉基部伸出，5月上旬至中旬為花期，白天溫度在20～32 ℃，午時光照強(qiáng)度在15 000～50 000 lx。5月下旬至6月上旬為果期，白天溫度在23～36 ℃，午時光照強(qiáng)度在 17 000～55 000 lx。6月中下旬，蒴果種子散發(fā)完后，地上部分逐漸枯萎，綬草進(jìn)入夏眠越夏。夏季至初秋，當(dāng)?shù)貧鉁乜蛇_(dá)37 ℃以上。季節(jié)與天氣是變化的，故溫度與光照是隨之變化的。2—6月為綬草生長與繁殖最重要的階段。夏眠后初秋左右，在溫度與光照適宜時再出苗，在初冬（大約11月上旬）溫度在11～17 ℃，午時光照強(qiáng)度在2 500～9 000 lx，綬草地上部分枯萎，進(jìn)入冬季休眠，第2年春季又出苗，完成其1 a 的生活史。

溫度與光照的Ⅰ～Ⅳ處理，在1 a 中綬草的生長勢如圖1所示。Ⅰ處理在室外自然（8～37 ℃）狀態(tài)下，生長良好，花葶發(fā)育健壯，螺旋狀花序長，蒴果多而飽滿；Ⅱ處理田間大棚（9～36 ℃）幼苗前期長勢比Ⅰ處理好，花葶發(fā)育正常，螺旋狀花序長，蒴果正常，但蒴果飽滿度比Ⅰ處理略差；Ⅲ處理植物組培室與Ⅳ處理光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，幼苗前期生長發(fā)育均優(yōu)于Ⅰ與Ⅱ處理植株；在成苗后期與進(jìn)入生殖生長期，二者生長勢從漸差到更差，表現(xiàn)為植株及花葶變細(xì)長，花果少，種子瘦癟，基本無發(fā)芽能力。Ⅲ與Ⅳ處理比較，Ⅲ處理優(yōu)于Ⅳ處理植株。Ⅳ處理花果少，種子瘦癟。究其原因，Ⅲ與Ⅳ處理為LED光源，光譜特征與日光有所不同；其次與自然的風(fēng)霜雪雨等潤育因素有關(guān)，Ⅳ處理的植物體呼吸交換空間小，故Ⅳ處理比Ⅲ處理差。綬草生活史表明，其在進(jìn)化繁衍中適應(yīng)了四季溫度等自然條件，就繁殖器官發(fā)育而言，一定的日光積累才有利于綬草花序的發(fā)育，使蒴果大而飽滿。從試驗(yàn)結(jié)果看，植物組培室及光照培養(yǎng)箱的利用，適用于育種幼苗培育，到成苗中期后，移置或移栽于室外，可獲得生長健壯的植株；在室內(nèi)怎樣才能培育出具有果多、繁殖力強(qiáng)、生長勢好的優(yōu)良植株，還需進(jìn)行探索。

2.3 遮光度對綬草生長與繁殖的影響

由表2可知，在綬草的生長中，幼苗期喜較陰的環(huán)境，成苗期需要向陽微陰的環(huán)境，花果孕育需較強(qiáng)陽光，花序才能發(fā)育健壯，達(dá)到一定的光積累后蒴果才會充實(shí)飽滿。其種子表現(xiàn)為趨弱光敏性。綬草的種子細(xì)小如沙，種子無胚乳分化，自然萌發(fā)力低。蒴果彈射出的種子，若失水后很快失去活力，故陽光過強(qiáng)，土壤干燥，種子很難發(fā)芽；但光照不夠，綬草品質(zhì)退化，花果發(fā)育差，果實(shí)瘦癟，種子無發(fā)芽力。

表2 遮光度對綬草生長與繁殖的影響（2年生植株）

綬草裸栽，在遮光度為0 時，光照太強(qiáng)，會造成植株灼傷，表現(xiàn)為葉尖焦枯，花期提前，夏眠時間延長，不利于光合產(chǎn)物的積累與種子萌發(fā)；遮光度小于或等于10%，利于植株健壯生長與種子的孕育；遮光度再增加，有利因素為：夏眠時間縮短，有利于光合產(chǎn)物的積累，夏眠后植株出苗增多，有利于種子萌發(fā)。但其不利因素為：植株地上部分向增高變軟變?nèi)蹀D(zhuǎn)化；花、果、種子的孕育向變劣轉(zhuǎn)化。表2結(jié)果顯示，綬草春季初苗至成苗期遮光度以10%～20%為佳，孕果期遮光度以小于或等于10%為佳，夏眠后秋季出苗時，遮光度以30%為佳，然后隨秋苗長大與季節(jié)變化光照減低而減少遮光度。

2.4 水肥條件對綬草生長與繁殖的影響

綬草根部喜偏濕、透氣。由圖2可知，栽培綬草土壤的相對濕度控制在60%～70%為宜，植株的營養(yǎng)生長與生殖生長呈現(xiàn)出最佳狀態(tài)。土壤濕度過低，植株發(fā)育不良，花少果小，種子入土后很難發(fā)芽。土壤濕度過大，可造成根部腐爛，繼而莖葉衰亡；種子入土后，發(fā)芽胚根伸入土中，透氣性差，致呼吸不暢死亡。

綬草春分（2月中下旬）至夏至（5月中下旬）是關(guān)鍵性的生長與繁殖階段，其次是初秋前后出苗至深秋初冬消苗前的生長階段。新葉與花葶出芥時施肥可促進(jìn)其生長，故施肥時考慮在苗期與花期初期階段進(jìn)行。在綬草施肥后第2年的夏季盛花期收獲全株，進(jìn)行鮮質(zhì)量（圖3）比較，結(jié)果表明，初春苗期施1 次肥的綬草，單株平均鮮質(zhì)量9.8 g，單株平均肉質(zhì)根鮮質(zhì)量5.3 g；初春苗期與夏初花葶出芥時各施1 次肥的綬草，單株平均鮮質(zhì)量11.2 g，單株平均肉質(zhì)根鮮質(zhì)量6.1 g；初春苗期、夏初花葶出芥、秋季出苗各施1 次肥的綬草，單株平均鮮質(zhì)量12.8 g，單株平均肉質(zhì)根鮮質(zhì)量6.9 g；CK 的綬草單株平均鮮質(zhì)量為7.4 g，單株平均肉質(zhì)根鮮質(zhì)量為3.9 g。與CK相比較，3 次施肥增產(chǎn)最顯著，單株平均鮮質(zhì)量增加72.97%，單株平均肉質(zhì)根鮮質(zhì)量增加76.92%；其次為2 次施肥，單株平均鮮質(zhì)量增加51.35%，單株平均肉質(zhì)根鮮質(zhì)量增加56.41%；再次為1 次施肥，單株平均鮮質(zhì)量增加32.43%，單株平均肉質(zhì)根鮮質(zhì)量增加35.90%。由此可見，在營養(yǎng)生長與生殖生長階段的初期施肥，綬草植株的產(chǎn)量提高顯著（P＜0.01）。

2.5 栽培方式對綬草植?？剐缘挠绊?/h3>

綬草主要病害為根腐病與立枯病。根腐病病原主要為尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）侵染所致，立枯病病原主要為立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）侵染所致。蟲害主要為蠐螬（本地基本為銅綠麗金龜子（Anomala corpulenta）幼蟲）、華北螻蛄（Gryllotalpa unispina）、小地老虎（Agrotis ypsilon）。近年種植發(fā)現(xiàn)，土廂栽培剛開始綬草病蟲害幾乎沒有，栽培時間愈久，綬草病蟲害就愈嚴(yán)重，必須進(jìn)行有效的防治。而草坪混栽，幾乎無農(nóng)藥使用，管理粗放，綬草生長植物學(xué)遺傳性狀整體表現(xiàn)情況良好，植株數(shù)量擴(kuò)大，多點(diǎn)采樣挖掘地下肉質(zhì)根發(fā)育良好至較好。草坪混栽，從地上部分蔭蔽度調(diào)節(jié)到地下根際微生態(tài)有共生關(guān)系，并形成對病蟲害的拮抗機(jī)制。

3 結(jié)論與討論

本研究進(jìn)行了綬草栽培土壤及綬草益生菌液、溫度與光照、遮光度、濕度與施肥、地栽與草坪混栽及植?？剐詭追N因素的探討。綬草喜濕潤、疏松、透氣性好的土壤，植株與土壤中的綬草益生菌有共生關(guān)系，栽培繁殖以褐紫色草坪土＋綬草益生菌液為佳，壩區(qū)沙壤土+綬草益生菌液稍次。綬草在不同的生長與繁殖階段所需溫度與光照是不同的，苗期—果期綬草生長適溫范圍在8～37 ℃；綬草春季初苗至成苗期遮光度以10%～20%為宜，孕果期的遮光度以小于或等于10%為宜，夏眠后初秋前后出苗時，遮光度以30%為宜；土壤相對濕度控制在60%～70%為宜；供肥以春季出苗后與夏初花葶出芥、秋季出苗后各施1 次肥為佳。土廂栽培要做好植保防控工作，栽植于草坪中的綬草對病蟲害的拮抗性強(qiáng)，其病蟲害受抑制的機(jī)制還應(yīng)深入進(jìn)行研究。

自然光照與溫度條件下，綬草在自然土地與地間大棚（均為自然光照）種植，在生殖生長階段光積累能形成飽滿果實(shí)，產(chǎn)生可育種子；但綬草在組培室與光照培養(yǎng)箱（均為LED 光源）中，模擬自然溫度與光照強(qiáng)度進(jìn)行培養(yǎng)，在生殖生長階段不能形成飽滿果實(shí)，產(chǎn)生的種子基本不育。究其原因?yàn)?，LED光源與自然光源在光譜特征上不同所產(chǎn)生，LED光源不同的光質(zhì)可影響植物體的生理生化及生長發(fā)育過程[18-19]。綬草野生性強(qiáng)，就室內(nèi)培養(yǎng)而言，今后應(yīng)考慮光源的光色、光波等怎樣合理搭配問題，同時晝夜溫度應(yīng)該是貼切自然的變化，光照、濕度等影響因子也應(yīng)該是變化的科學(xué)合理搭配，才能摸索出成功的育種繁殖技術(shù)。

多次試驗(yàn)表明，綬草種子繁殖率極低，在栽培中可采用盤龍參（即綬草）植種保護(hù)自然限播裝置[20]，來提高種子發(fā)芽率與出苗成活率。同時，需進(jìn)一步開展提高綬草種子發(fā)芽率與出苗成活率的研究。