王振濤，解靜芳，李 萌，陳佳月

（1.山西大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，山西 太原 030006；2.中國科學(xué)院上海硅酸鹽研究所，上海 200050）

酸雨（Acid rain，AR）是指 pH 值小于 5.6 的降水[1]，可造成土壤酸化、傷害動植物、腐蝕建筑物等[2-3]。鎘（Cadmium，Cd）是含有毒性的重金屬元素[4]，環(huán)境中存在的Cd 會對植物產(chǎn)生毒害效應(yīng)，干擾植物新陳代謝，嚴(yán)重時(shí)會導(dǎo)致植物枯萎甚至死亡[5-6]。土壤中Cd 的溶解度隨AR 強(qiáng)度的增大而增加，而AR 和Cd 復(fù)合脅迫會破壞植物的生長環(huán)境[7]。有研究表明，短期不同濃度Cd 脅迫誘使紅樹根系分泌的有機(jī)酸含量增多[8]，Cd 誘導(dǎo)菠菜多種氨基酸、多種糖類物質(zhì)、蘋果酸和檸檬酸含量升高[9]，AR 會對植物光合系統(tǒng)、呼吸作用及物質(zhì)代謝產(chǎn)生影響[10]。

AR 與Cd 作為2 種重要的環(huán)境污染物，均會對植物的生長和代謝造成影響。目前，國內(nèi)外對AR和Cd 的相關(guān)研究多集中于二者復(fù)合脅迫對植物生長、生理及光合作用等的影響方面[11-12]，而從代謝的角度分析二者復(fù)合脅迫對玉米幼苗的作用機(jī)制還未見報(bào)道。氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）方法具有高分離效能的毛細(xì)管色譜柱和高靈敏度的質(zhì)譜檢測定性能力[13]，其對于代謝物的鑒定具有一定的優(yōu)勢，樣品進(jìn)行衍生化處理后，可以檢測到的代謝物包括糖類、氨基酸、有機(jī)酸等極性較大的化合物，也能檢測到極性較小的化合物如脂肪酸。

本試驗(yàn)通過GC-MS 方法研究AR 單一脅迫和AR 與Cd 復(fù)合脅迫對玉米幼苗代謝物的影響，以期厘清其影響作用機(jī)制，為AR 與Cd 聯(lián)合污染對作物生長的干預(yù)和土壤污染修復(fù)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

供試玉米品種為大豐30。氯化鎘CdCl2·2.5H2O（分析純）購自天津市化學(xué)試劑二廠；CP224C 電子天平（奧豪斯儀器有限公司，常州），高速冷凍離心機(jī)（Hermle Z-36HK，德國），超純水機(jī)（上海力康生物醫(yī)療科技控股有限公司），制冰機(jī)（Scotsman，上海），滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股價(jià)有限公司），DSQ 單四級桿氣相色譜質(zhì)譜儀（GC-MS，美國Thermo Fisher 公司）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)分設(shè)單一AR 和AR 與Cd 聯(lián)合染毒2 個(gè)大組，其中，單一AR 染毒組分為5 組，即空白組（CK）、A 組（pH＝5 的酸雨）、B 組（pH＝4 的酸雨）、C 組（pH＝3 的酸雨）、D 組（pH＝2 的酸雨）；AR 與Cd 聯(lián)合染毒組也分為5 組，即E 組（Cd2+染毒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5 mg/kg）、F 組（pH＝5 且 Cd2+染毒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5 mg/kg 的酸雨）、G 組（pH＝4 且 Cd2+染毒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5 mg/kg 的酸雨）、H 組（pH＝3 且 Cd2+染毒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5 mg/kg 的酸雨）、I 組（pH＝2 且 Cd2+染毒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg/kg 的酸雨）,每組4 盆，每盆種8 粒玉米，每盆土壤質(zhì)量為180 g。待幼苗發(fā)芽率達(dá)到75%后[14]，通過定時(shí)澆灌噴灑方式完成染毒，染毒量為50 mL，染毒連續(xù)14 d，取幼苗進(jìn)行代謝物的測定。

1.3 代謝物分析

1.3.1 樣品前處理 稱取液氮研磨后的幼苗60 mg于2 mL EP 中，加入1 mL 甲醇和水混合溶液（體積比為1∶1），超聲提取30 min，樣品在3 000 r/min條件下離心10 min，取50 μL 上清液于進(jìn)樣小瓶中，在真空冷凍干燥器中吹干。在吹干后的殘?jiān)屑尤胭|(zhì)量濃度為20 g/L 的鹽酸甲氧胺吡啶溶液50 μL（含正二十四烷0.1 g/L），37 ℃反應(yīng)90 min，再加入50 μL N- 甲基 -N-（三甲基硅烷） 三氯乙酰胺（MSTFA）＋1%三甲基氯硅烷（TMMCS）溶液，37 ℃反應(yīng) 30 min[15]，0.22 μm 有機(jī)相膜過濾，待測。

1.3.2 GC-MS 分析條件 用Thermo Fisher DSQ 對待測物進(jìn)行1.0 μL 不分流進(jìn)樣，接著用DB-5MS 毛細(xì)管柱進(jìn)行色譜分離，進(jìn)樣口溫度為280 ℃，載氣為氦氣，載氣流速為1.0 mL/min，柱溫初始為80 ℃，保持2 min，接著以10 ℃/min 的升溫速率升溫至140 ℃，保持 1 min，再以 4 ℃/min 的升溫速率升溫至240 ℃，保持2 min，最后以5 ℃/min 的升溫速率升溫至300 ℃，并保持3 min，設(shè)溶劑延遲為8 min。質(zhì)譜儀采用電子碰撞（EI）模式（70 eV）離子化[9]，傳輸線溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，數(shù)據(jù)采集掃描模式為全掃描，掃描質(zhì)核比范圍為50～650。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SIMCA 14.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析（PCA），采用偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）模型和t 檢驗(yàn)法對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理下玉米幼苗代謝物的識別

GC-MS 結(jié)果分析，對代謝物進(jìn)行庫識別，篩選匹配度大于70%的化合物作為目標(biāo)代謝物（匹配度表示檢索物質(zhì)與庫中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相似程度，用百分?jǐn)?shù)表示），共篩選出76 種代謝物，再通過篩選質(zhì)量控制樣品中RSD＜30%的代謝物作為后續(xù)分析的代謝物，一共49 種。

2.2 不同處理下玉米幼苗差異代謝物的篩選

對AR 單一處理和AR 與Cd 復(fù)合脅迫處理的玉米幼苗代謝物進(jìn)行PCA 分析（圖1），t[1]為第1主成分，t[2]為第2 主成分，試驗(yàn)結(jié)果顯示，AR 單一處理和AR 與Cd 復(fù)合脅迫處理后2 個(gè)系列表現(xiàn)分離良好，分別為圖1中實(shí)線圈與虛線圈；不同濃度酸雨的單一處理結(jié)果顯示，組間分離良好（CK，A，B，C，D 組），不同濃度 AR 與 Cd 復(fù)合脅迫處理結(jié)果顯示，組間亦分離良好（E，F(xiàn)，G，H，I 組），因此，不同濃度的酸雨在單一脅迫和與Cd 復(fù)合脅迫均會對玉米幼苗造成不同程度的損傷。

通過OPLS-DA 模型分析，通過變量的載荷大小尋找差異代謝物，載荷越大說明對樣本點(diǎn)分類貢獻(xiàn)越大。本研究以變量重要性投影（variable import ance in the projection，VIP）＞1.0 和 t 檢驗(yàn)（P＜0.05）為差異代謝物選擇標(biāo)準(zhǔn)，與CK 組相比，A 組、B 組、C 組和 D 組分別篩選出 11，11，10，11 種差異代謝物（表1）；與 E 組相比，F(xiàn) 組、G 組、H 組和 I 組分別篩選出 10，13，13，9 種差異代謝物（表2）。

表1 酸雨脅迫后玉米幼苗差異代謝物VIP 值

表2 酸雨與鎘復(fù)合脅迫后玉米幼苗差異代謝物VIP 值

2.3 不同處理下玉米幼苗差異代謝物的變化

2.3.1 氨基酸代謝 AR 單一暴露后，與空白對照組相比，甘氨酸、脯氨酸、絲氨酸、丙氨酸和β-丙氨酸含量顯著升高。復(fù)合脅迫與同強(qiáng)度AR 單一脅迫相比，玉米幼苗代謝物與AR 單一暴露一致（表3）。

表3 酸雨與鎘復(fù)合脅迫后玉米幼苗差異代謝物含量 μg/mg

2.3.2 有機(jī)酸代謝 AR 單一脅迫時(shí)，與空白對照相比，玉米幼苗有機(jī)酸代謝物中檸檬酸顯著升高；乳酸和蘋果酸含量顯著降低。復(fù)合脅迫與同強(qiáng)度AR 單一脅迫相比，有機(jī)酸代謝物變化同AR 單一脅迫一致?？傮w來看，2 種脅迫對玉米幼苗有機(jī)酸含量的影響是一致的（表3）。

2.3.3 糖類代謝 與對照組相比，AR 單一脅迫誘導(dǎo)玉米幼苗中蔗糖和葡萄糖含量隨著酸雨pH 值減小而顯著上升，AR 與Cd 復(fù)合脅迫后玉米幼苗中蔗糖和葡萄糖含量同樣隨著酸雨pH 值減小而升高，與同強(qiáng)度AR 單一脅迫相比，復(fù)合脅迫對玉米幼苗中蔗糖和葡萄糖含量顯著升高?？傮w來看，單一與復(fù)合脅迫均誘導(dǎo)玉米幼苗中大部分糖類含量升高，總糖類含量增加（表3）。

2.3.4 抗逆物質(zhì)代謝 與空白對照相比，AR 單一脅迫對玉米幼苗中抗逆物質(zhì)腐胺含量的變化顯著升高；與同強(qiáng)度AR 單一脅迫相比，復(fù)合脅迫對玉米幼苗中抗逆物質(zhì)含量的變化有腐胺和肌醇，其中，肌醇含量先降后升，是復(fù)合脅迫的特有差異代謝物（表3）。

3 討論

3.1 不同處理對玉米幼苗氨基酸代謝的影響

環(huán)境脅迫會對植物體內(nèi)氨基酸代謝造成影響。甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸和絲氨酸是糖異生的前體氨基酸[16]，在植物體內(nèi)乙醇酸代謝過程中磷酸乙醇酸被氧化為甘氨酸，然后甘氨酸在線粒體中轉(zhuǎn)化為絲氨酸，絲氨酸在四氫葉酸代謝中至關(guān)重要，主要調(diào)節(jié)-CH3的運(yùn)輸[17]，且絲氨酸的積累是植物老化加速的一個(gè)信號[18]。單一和復(fù)合脅迫均誘導(dǎo)這2 種氨基酸含量升高，表明玉米幼苗體內(nèi)蛋白質(zhì)分解水平增加，糖異生途徑水平增高，AR 與Cd 復(fù)合脅迫使玉米幼苗光呼吸受到抑制，氨循環(huán)受阻。脯氨酸含量在一定程度上可反映植物的抗逆性。胡雁春[19]研究發(fā)現(xiàn)，隨AR 強(qiáng)度的增大，三葉草脯氨酸含量呈遞增趨勢；孫盛等[20]研究表明，隨Cd 處理濃度的增大，黃瓜幼苗葉片脯氨酸含量增加。這與本研究中AR 單一脅迫、AR 與Cd 復(fù)合脅迫均誘導(dǎo)玉米幼苗脯氨酸含量增加的結(jié)果一致，表明脯氨酸可抵御Cd 的毒害作用。同時(shí)，AR 可誘導(dǎo)植物體內(nèi)蛋白質(zhì)溶解酶活性增強(qiáng)，蛋白質(zhì)分解加快，促使脯氨酸含量升高。

3.2 不同處理對玉米幼苗有機(jī)酸代謝的影響

植物在呼吸過程中，通過三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cycle，TCA）形成一系列有機(jī)酸。重金屬脅迫下，植物體會分泌大量的草酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸等有機(jī)酸[21]。蘋果酸和檸檬酸是植物TCA中2 種重要的有機(jī)酸。本研究中，單一脅迫下，蘋果酸含量降低而檸檬酸含量升高，說明植株體TCA處于較穩(wěn)定的狀態(tài)；復(fù)合脅迫下，蘋果酸和檸檬酸含量均顯著增加，表明復(fù)合脅迫阻礙了TCA 的正常運(yùn)行，玉米幼苗生理情況遭到破壞，TCA 遭到破壞主要是由Cd2+造成的。乳酸累積在細(xì)胞內(nèi)，會使胞質(zhì)溶膠酸化，影響酶代謝。本研究結(jié)果顯示，2 種脅迫均誘導(dǎo)乳酸含量降低，且2 種脅迫乳酸含量下降程度相差不大，表明玉米幼苗乳酸含量的降低主要是由酸雨造成的。

3.3 不同處理對玉米幼苗糖類代謝的影響

糖類是植物光合作用和呼吸作用的重要碳化合物，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用。在代謝過程中，葡萄糖為植物抗逆提供能量。本研究結(jié)果表明，2 種脅迫均誘導(dǎo)玉米幼苗葡萄糖含量增加，啟動了糖異生途徑中多種氨基酸和有機(jī)酸含量的增加，同時(shí)，葡萄糖的大量積累提示玉米幼苗的光合作用受到影響[22]。復(fù)合脅迫與同強(qiáng)度AR 單一脅迫相比，葡萄糖、蔗糖含量均顯著升高，表明Cd2+的存在加大了酸雨對糖類的積累，更大強(qiáng)度地破壞了玉米幼苗的光合作用，抑制其生長，這與KIEFFE 等[23]研究得出的糖類物質(zhì)的積累是Cd 抑制植物生長的一個(gè)重要因素的結(jié)果一致。

3.4 不同處理對玉米幼苗抗逆物質(zhì)的影響

腐胺屬于多胺類物質(zhì)，可增強(qiáng)植物對環(huán)境的耐受力[24]。本研究結(jié)果顯示，2 種脅迫均誘導(dǎo)腐胺含量增加，表明單一脅迫和復(fù)合脅迫均會導(dǎo)致玉米幼苗通過調(diào)節(jié)腐胺的增加來完成對幼苗的自我保護(hù)。肌醇在植物體內(nèi)主要作用是合成細(xì)胞壁存儲能量[25]，試驗(yàn)結(jié)果表明，在復(fù)合脅迫下，肌醇含量的升高說明玉米幼苗已經(jīng)通過自我增加肌醇來對抗惡劣的生長環(huán)境。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，2 種脅迫均導(dǎo)致玉米幼苗中氨基酸代謝物發(fā)生紊亂，說明機(jī)體通過調(diào)節(jié)氨基酸來對抗逆境；單一脅迫下蘋果酸含量降低而檸檬酸含量升高，說明玉米幼苗體內(nèi)TCA 穩(wěn)定，復(fù)合脅迫下蘋果酸和檸檬酸的含量均顯著升高，表明復(fù)合脅迫可導(dǎo)致玉米幼苗體內(nèi)TCA 受阻；2 種脅迫均導(dǎo)致糖類化合物的積累，說明酸雨和鎘均會導(dǎo)致玉米幼苗的光合作用途徑發(fā)生紊亂；通過對腐胺、肌醇等抗逆物質(zhì)的研究可知，2 種脅迫均對玉米幼苗產(chǎn)生了毒性，從而導(dǎo)致抗逆物質(zhì)積累以抵抗逆境。