耿思宇，張姍姍，徐培林，王景雪

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；2.中山大學(xué)教育部基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275）

油菜是我國(guó)重要的油料作物，其外植體高效再生系統(tǒng)的建立對(duì)于油菜的遺傳改良、基因功能研究等都具有重要的意義。以往的研究認(rèn)為，基因型、激素等對(duì)外植體的高效再生都具有重要作用。油菜不同品種在外植體再生能力方面存在著明顯的基因型依賴(lài)性，且多數(shù)品種的分化能力并不理想。因此，在油菜基因轉(zhuǎn)化中，針對(duì)不同材料優(yōu)化培養(yǎng)基，建立高效外植體再生系統(tǒng)是進(jìn)行高效轉(zhuǎn)化的前提。

油菜中外植體的植株再生一般是通過(guò)器官發(fā)生的方式實(shí)現(xiàn)的。在蕓苔屬中已有用不同外植體如下胚軸[1]、子葉[2]、花莖[3]、葉片[4]、表皮及亞表皮細(xì)胞的薄細(xì)胞層[5]、根系[6]、花藥、小孢子[7-8]、原生質(zhì)體[9-10]等獲得再生植株的報(bào)道。植物組織培養(yǎng)涉及因素較多，并且各因素間具有復(fù)雜的相互作用，因此，經(jīng)驗(yàn)的積累尤為重要。前人雖然已對(duì)影響植株再生的諸多因素如培養(yǎng)基、基因型[11-13]、不同外植體之間的差異以及所使用植物激素的數(shù)量[14]等進(jìn)行了研究，但是所用的植物激素僅限于少數(shù)幾種，并且多數(shù)是根據(jù)所用材料選擇高效的植物激素組合，對(duì)于不同激素組合的比較研究較少。

對(duì)于一個(gè)高效的再生體系而言，除了選擇最適宜的培養(yǎng)基和外植體外，還必須保證用于組織培養(yǎng)的供試材料處于良好的生理?xiàng)l件。一般來(lái)說(shuō)，來(lái)源于溫室生長(zhǎng)的植株以及在無(wú)菌條件下生長(zhǎng)的無(wú)菌苗是較好的外植體來(lái)源。OVESNA 等[15]研究表明，供體植株的年齡也會(huì)影響外植體的再生能力。對(duì)不同遺傳背景材料的植株再生能力的研究表明，不同的遺傳背景對(duì)植株的再生能力具有一定的影響，Brassica oleracea 基因組最容易再生，而B(niǎo)rassica rapa最難轉(zhuǎn)化[16]。

本試驗(yàn)利用3 種不同的油菜基因型材料，對(duì)6-BA，NAA，GA3等植物激素以及 AgNO3在下胚軸植株再生中的作用進(jìn)行研究，以明確不同激素種類(lèi)在外植體再生中的作用，并根據(jù)所選用材料對(duì)不同培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，選出了最佳的培養(yǎng)基，進(jìn)而建立甘藍(lán)型油菜的高效外植體下胚軸高效再生體系。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試油菜品種為甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）湘油 14 號(hào)、湘油 15 號(hào)和 Y03-211，其種子由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)油料研究所提供。

供試培養(yǎng)基分為2 種，即誘導(dǎo)油菜再生植株分化培養(yǎng)基（主要成分列于表1）和誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基（以附加和不附加植物激素，組成4 種不同的誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基，即：RM1.1/2 MS；RM2.MS＋0.2 mg/L NAA；RM3.MS＋0.1 mg/L NAA；RM4.MS＋0.2 mg/L IAA）。

1.2 試驗(yàn)方法

油菜種子用 0.1%（m/V）HgCl2消毒 8 min，無(wú)菌水沖洗 5～6 次，置于 MS 固體培養(yǎng)基上，23～25 ℃，16 h/8 h（白天/黑夜）光照條件下發(fā)芽，制備成無(wú)菌苗。將5～6 d 苗齡的無(wú)菌苗下胚軸切成約0.5～1.0 cm 的切段，將下胚軸切段分別置于表1所列的培養(yǎng)基上，以誘導(dǎo)外植體在切口處形成愈傷組織和分化再生芽苗。下胚軸切段接種后，觀察不同培養(yǎng)基上外植體開(kāi)始形成愈傷組織的時(shí)間、外植體的出愈率、外植體分化芽苗總數(shù)以及外植體上分化正常苗數(shù)。試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)處理接種的外植體數(shù)不小于30 個(gè)。

表1 誘導(dǎo)油菜再生植株分化培養(yǎng)基主要成分

2 結(jié)果與分析

2.1 激素對(duì)再生芽苗誘導(dǎo)的影響

下胚軸外植體接種到各種培養(yǎng)基上后，經(jīng)1～2 d，大多數(shù)外植體在切口處開(kāi)始膨大；到3～4 d 時(shí)，切口處開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織；到7 d 時(shí)，外植體切口處愈傷組織誘導(dǎo)基本完成。愈傷組織開(kāi)始出現(xiàn)時(shí)是松散狀的，以后逐漸長(zhǎng)成致密狀。從表2可以看出，在供試的培養(yǎng)基中，所有材料都能獲得80%以上的出愈率。說(shuō)明這些培養(yǎng)基均可以高效地誘導(dǎo)愈傷組織。

表2 不同基因型、不同激素組合的出愈率 %

大約在外植體接種20 d 后，在致密型愈傷組織上先出現(xiàn)綠色小芽點(diǎn)，繼而發(fā)育成小芽苗。從表3可以看出，培養(yǎng)基中植物激素對(duì)外植體再生芽苗的分化有重要影響。其中，6-BA 對(duì)油菜再生植株分化是必需的，3 個(gè)品種在無(wú)6-BA 的MN 培養(yǎng)基中，雖然都得到了90%以上的出愈率，但均未獲得再生苗，說(shuō)明6-BA 是油菜下胚軸芽苗再生所必需的。對(duì)不同激素組合的研究發(fā)現(xiàn)，不同基因型對(duì)激素組合的要求不同，多數(shù)情況下6-BA 與GA3的組合優(yōu)于6-BA 和NAA 的組合。就3 個(gè)基因型平均分化率而言，MBG 培養(yǎng)基的平均分化率（11.56%）大于MBN 培養(yǎng)基（5.81%）；MB3G 培養(yǎng)基的平均分化率（9.58%）大于MB3N 培養(yǎng)基（1.14%）。

表3 不同基因型、不同激素組合的分化率 %

不同基因型最適合的激素組合不盡相同，如湘油15 號(hào)、Y03-211 最適合的培養(yǎng)基為MBG，而湘油14 號(hào)最適合的培養(yǎng)基組合為MBN。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加GA3，雖然能夠提高再生植株分化率，但是也顯著提高了再生植株中玻璃苗的比例。如湘油15 號(hào)在MB3A 培養(yǎng)基上，總分化率為26.00%，其中，正常苗分化率為22.29%；而在MB3AG 培養(yǎng)基上，總分化率為56.51%，其中，正常苗分化率為37.94%。即添加GA3后，總分化率增加30.51%，但是正常苗分化率卻僅增加了15.65%。

2.2 AgNO3在芽苗分化中的作用

表4 AgNO3對(duì)不同基因型、不同激素組合分化率的影響 %

從表4可以看出，幾乎在所有的培養(yǎng)基中添加AgNO3都能夠顯著提高正常芽苗分化率。其中，最為明顯的是湘油15 號(hào)，其在MBG 培養(yǎng)基上正常芽苗分化率為11.83%，而在MBGA 培養(yǎng)基上正常芽苗分化率為38.29%，較MBG 培養(yǎng)基提高了26.46 百分點(diǎn)；湘油14 號(hào)在MB3G 培養(yǎng)基上正常芽苗分化率為7.95%，而在MB3GA 培養(yǎng)基上正常芽苗分化率則為32.05%，較MB3G 培養(yǎng)基提高了24.10 百分點(diǎn)。

通過(guò)對(duì)16 種含有6-BA 培養(yǎng)基上的不同品種正常芽苗分化率比較發(fā)現(xiàn)，供試培養(yǎng)基中，MBGA（MS＋2 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L GA3＋20 μmol/L Ag-NO3）培養(yǎng)基最有利于誘導(dǎo)再生植株分化，3 個(gè)供試品種的最高正常芽苗分化率（湘油15 號(hào)為38.29%；Y03-211 為20.00%；湘油14 號(hào)為32.63%）均是在該培養(yǎng)基上得到的（圖1）。因此，將MBGA 培養(yǎng)基作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后再生植株誘導(dǎo)培養(yǎng)基。3 個(gè)供試品種下胚軸外植體在MBGA 培養(yǎng)基上再生植株分化情況如圖2所示。

2.3 基因型對(duì)芽苗分化的影響

從表2，3 可以看出，不同品種再生植株分化能力不同。在培養(yǎng)基成分相同時(shí)，3 個(gè)供試品種中具有不同的芽苗分化率，說(shuō)明基因型對(duì)芽苗分化具有重要影響。整體來(lái)說(shuō)，湘油14 號(hào)再生能力較強(qiáng)，Y03-211 號(hào)次之，湘油15 較差。湘油14 號(hào)對(duì)培養(yǎng)基的適應(yīng)性要比湘油15 號(hào)強(qiáng)一些，但是試驗(yàn)中觀察到湘油14 號(hào)在供試培養(yǎng)基上再生苗的玻璃化比湘油15 號(hào)嚴(yán)重。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，除了培養(yǎng)基成分對(duì)玻璃苗的發(fā)生有較大影響外，不同品種在是否容易產(chǎn)生玻璃苗上也表現(xiàn)不同。3 個(gè)品種中，玻璃苗發(fā)生最多的是湘油14 號(hào)。分化出的玻璃苗表現(xiàn)為葉片水漬狀，葉色是不正常的綠色，葉片發(fā)脆易斷，不能誘導(dǎo)生根。所以，玻璃苗是無(wú)效的分化苗，在組織培養(yǎng)過(guò)程中應(yīng)該盡量減少其生成。

2.4 生根培養(yǎng)基的選擇

油菜芽苗再生后，要經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)生根才能成為完整的再生植株。因此，生根培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果直接影響轉(zhuǎn)化后抗性芽苗發(fā)育成完整的再生植株的概率。一個(gè)高效率的生根培養(yǎng)基對(duì)提高轉(zhuǎn)化效果十分重要。大約3 cm 長(zhǎng)的油菜芽苗移入生根培養(yǎng)基后，10 d 后開(kāi)始有白色的根狀突起出現(xiàn)，之后根狀突起發(fā)育為不定根；經(jīng)過(guò)30 d 左右的生長(zhǎng)，發(fā)育為生長(zhǎng)良好的根系。

從表5可以看出，油菜生根使用植物生長(zhǎng)素NAA 誘導(dǎo)比使用IAA 誘導(dǎo)或不使用植物激素誘導(dǎo)生根效果要好；不同培養(yǎng)基生根率不同，在4 種培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)油菜生根效果最好的培養(yǎng)基是MS＋0.2 mg/L NAA，生根率可以達(dá)到90%。

表5 不同生根培養(yǎng)基比較

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)不同激素組合培養(yǎng)基的篩選發(fā)現(xiàn)，基因型、激素組合以及培養(yǎng)基中AgNO3的添加對(duì)再生植株的分化都具有重要影響。培養(yǎng)基中6-BA 對(duì)油菜芽苗分化是必要的，當(dāng)培養(yǎng)基中缺少6-BA時(shí)，3 個(gè)品種均無(wú)芽苗分化。而NAA 對(duì)于愈傷組織的形成和芽苗生根非常重要，培養(yǎng)基中增加NAA時(shí)，下胚軸的出愈率明顯增加，這與前人的研究結(jié)果相同[17-18]。已往的研究表明，AgNO3對(duì)于包括油菜在內(nèi)的蕓薹屬作物的再生植株分化具有顯著的促進(jìn)作用[19-22]。一般認(rèn)為，AgNO3對(duì)芽分化的促進(jìn)作用是AgNO3抑制了植物組織培養(yǎng)中乙烯的生成。本試驗(yàn)中，AgNO3對(duì)于所選用的材料再生植株的高頻率分化具有明顯的促進(jìn)作用；NAA 對(duì)誘導(dǎo)愈傷組織和芽苗生根具有重要作用。

油菜的芽苗分化是通過(guò)器官分化的途徑發(fā)生的。本研究表明，細(xì)胞分裂素6-BA 對(duì)誘導(dǎo)外植體的芽苗分化是必需的，6-BA 與GA3的組合優(yōu)于6-BA與NAA 的組合。在本試驗(yàn)所選用的油菜材料和培養(yǎng)基組成中，MBGA（MS＋2 mg/L 6-BA＋0.5 mg/L GA3＋20 μmol/L AgNO3）培養(yǎng)基最有利于誘導(dǎo)再生植株分化；RM2（MS＋0.2 mg/L NAA）培養(yǎng)基最有利于誘導(dǎo)再生芽苗生根。本研究利用不同的油菜材料建立并完善了高效的外植體再生系統(tǒng)，為建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜高效遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定了一定的基礎(chǔ)。