王世峰，郭 燁，李梅蘭，侯雷平，王文嬌

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.山西省蔬菜產(chǎn)業(yè)管理站，山西 太原 030000）

植物表皮蠟質(zhì)是覆蓋在陸生植物表皮的一種保護(hù)層[1]。它在保護(hù)植物抵御紫外線灼傷、病蟲侵害、水分散失[2-3]等方面發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，植物蠟質(zhì)層的化學(xué)成分非常復(fù)雜，在不同植物、組織器官和生長(zhǎng)階段中的形態(tài)結(jié)構(gòu)、含量和組成不同[4-6]。

目前關(guān)于擬南芥蠟質(zhì)合成途徑研究的比較透徹，分為3 個(gè)階段：在質(zhì)體中合成C16 和C18 脂肪酸并轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，作為參與超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成底物；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，C16 和C18 脂肪酸延長(zhǎng)為超長(zhǎng)鏈脂肪酸，其中大部分用于形成表皮蠟；在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，長(zhǎng)鏈脂肪酸由2 種途徑（合成醛、烷、仲醇以及酮類的烷類合成途徑；合成伯醇和酯類的伯醇合成途徑[7-11]）被修飾成各種主要的蠟質(zhì)成分。

在擬南芥中，AtCER10 起著編碼烯酰輔酶A 還原酶的作用，在各個(gè)組織部位均有表達(dá)，并且在超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成中也起重要作用[12]。cer10 突變體中的蠟質(zhì)含量下降到野生型的40%，并且在UV-B輻射下，蠟質(zhì)總量及桿狀晶體結(jié)構(gòu)明顯減少，莖稈表面出現(xiàn)無(wú)規(guī)則片狀、膜狀結(jié)構(gòu)[13-14]。

前人通過(guò)熒光定量在黃瓜中已經(jīng)篩選出可能與蠟質(zhì)合成及運(yùn)輸相關(guān)的候選基因：CsCER1，CsWAX2，CsCER4，CsCER6，CsCER8 和 CsCER10，并且已經(jīng)研究鑒定了CsCER1 和CsWAX2 在黃瓜蠟質(zhì)合成中的功能，而CsCER10 目前尚未被研究[15-16]。

本試驗(yàn)主要研究CsCER10 在黃瓜中的表達(dá)模式及生物學(xué)信息，旨在為蠟質(zhì)形成的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)選用的黃瓜品種為中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的3407。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料種植 先將黃瓜種子置于55 ℃水中消毒15 min，然后在室溫下靜置4 h，之后將種子鋪在帶有濕潤(rùn)紗布的培養(yǎng)皿中，并在28 ℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)2 d。將發(fā)芽的種子播種在配好的營(yíng)養(yǎng)土中，并將培養(yǎng)箱條件設(shè)定為：光周期16 h 光照、8 h 黑暗，晝夜溫度分別為 25，18 ℃[17]。

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取生長(zhǎng)至三葉一心的黃瓜幼苗進(jìn)行鹽脅迫、干旱及低溫處理。在鹽脅迫處理中，分別用不同濃度的 NaCl 溶液（0（CK），50，100，150 mmol/L）灌溉幼苗7 d[18]。在干旱處理中，在10%的 PEG-6000 中，將幼苗分別浸泡 0（CK），1，2，3 h[19]。低溫處理為 12 ℃低溫中分別放置 0（CK），24，48 h。在每個(gè)處理后，將葉片取下，用液氮迅速冷凍并儲(chǔ)存于 -80 ℃中（3 次重復(fù)），用于提取 RNA[20]。在同一天采集根、莖、莖表皮、葉片、雄花、雌花以及花后7 d 的果實(shí)和果皮，樣品取下后用液氮迅速冷卻，存儲(chǔ)于-80 ℃中，用于提取RNA。

1.2.3 RNA 提取及cDNA 反轉(zhuǎn)錄 RNA 提取使用TIANGEN 公司的RNA 提取試劑盒，使用TaKaRa 公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA[21]。

1.2.4 熒光定量PCR 選擇TUA 為內(nèi)參基因，以cDNA 為模板，用購(gòu)于TaKaRa 的熒光定量試劑盒在型號(hào)為7500 RT-PCR 機(jī)器上進(jìn)行試驗(yàn)，相對(duì)表達(dá)量根據(jù) 2-ΔΔCt計(jì)算獲得[22]。PCR 體系設(shè)定為：95 ℃預(yù)變性 30 min；95 ℃變性 30 s，52 ℃退火 30 s，40 個(gè)循環(huán)。CsCER10 引物為 5′-GGCAAAGGCTAACTCT TCCCG-3′和 5′-CCTTGAAGACAACGGTTATGCTG-3′。TUA 引物為 5′-ACGCTGTTGGTGGTGGTAC-3′和 5′-GAGAGGGGTAAACAGTGAATC-3′。

1.2.5 序列比對(duì)與進(jìn)化樹分析 使用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中的 BLAST 分析功能，輸入CsCER10 序列會(huì)得到不同物種的氨基酸序列。運(yùn)用DNAMAN 將得到的相關(guān)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)；系統(tǒng)進(jìn)化樹運(yùn)用MEGA5 軟件中的鄰位相連法構(gòu)建。

1.2.6 理化性質(zhì)分析 本研究采用ExPASy 中的ProtParam 功能分析CsCER10蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)。

1.2.7 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 同源建模法是基于序列同源比對(duì)的一種蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法，是目前比較有效且最常用的方法。本研究將CsCER10蛋白序列在SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）中構(gòu)建模型，下載 PDB 格式，導(dǎo)入SPDBV 軟件進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)分析。

1.2.8 跨膜區(qū)預(yù)測(cè) CsCER10蛋白的跨膜區(qū)是使用 TMHMM server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進(jìn)行預(yù)測(cè)的。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsCER10在黃瓜中的表達(dá)模式

通過(guò)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)CsCER10 在黃瓜不同組織部位中表達(dá)模式的研究結(jié)果顯示，CsCER10在所采集的各個(gè)組織部位中均有表達(dá)，且在葉、雌花及果皮中表達(dá)量較高（圖1），在果皮中的表達(dá)水平是果實(shí)中的14 倍。

2.2 不同非生物脅迫對(duì)CsCER10表達(dá)的影響

野生型黃瓜幼苗在不同非生物脅迫處理下qRT-PCR 結(jié)果顯示，CsCER10 的表達(dá)水平在干旱、鹽脅迫及低溫脅迫下均呈上升趨勢(shì)，其中，鹽脅迫處理尤為明顯。從圖2可以看出，隨著NaCl處理濃度的增加，CsCER10 的表達(dá)量升高，在100，150 mmol/L 處理下的表達(dá)量分別為對(duì)照的7 倍與26 倍。干旱處理的結(jié)果顯示，隨著處理時(shí)間的增加，CsCER10 的表達(dá)量上升，當(dāng)處理達(dá)到3 h 時(shí)，CsCER10 的表達(dá)量達(dá)到了對(duì)照的8 倍（圖3）。低溫處理結(jié)果顯示，低溫處理時(shí)間與CsCER10 的表達(dá)量成正比，處理48 h 時(shí)CsCER10 的表達(dá)量是對(duì)照的19 倍（圖4）。

2.3 CsCER10蛋白序列比對(duì)及進(jìn)化樹分析

為了進(jìn)一步分析CsCER10與其他物種的同源關(guān)系，將其與擬南芥、苦瓜、蘋果和蘆筍的序列進(jìn)行比對(duì)，一致性在81.61%～93.55%（圖5）。

構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)一步分析CsCER10 與其他同源蛋白之間的進(jìn)化關(guān)系。此進(jìn)化樹包含12 個(gè)物種，有擬南芥、苦瓜、蘆筍等。其中，CsCER10與AtCER10 處于同一進(jìn)化支上，此結(jié)果說(shuō)明，CsCER10 屬于與蠟質(zhì)合成的CER 家族（圖6）。

2.4 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析

CsCER10蛋白的cDNA 全長(zhǎng)為933 bp，包含有1 個(gè)開放閱讀框，編碼了310 個(gè)氨基酸。相對(duì)分子質(zhì)量為78 827.12，等電點(diǎn)PI 為5.09，分子式為C2888H4845N933O1224S206，不穩(wěn)定系數(shù)為51.76，屬于不穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為25.29，總親水性為0.704，為水溶性蛋白。其氨基酸組成如表1所示，丙氨酸與蘇氨酸的含量較高。

表1 CsCER10 蛋白序列氨基酸組成 %

2.5 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)分析結(jié)果（圖7）顯示，CsCER10蛋白具有16 個(gè) α 螺旋，4 個(gè) β 折疊。

2.6 跨膜區(qū)預(yù)測(cè)分析

從圖8可以看出，預(yù)測(cè)的跨膜螺旋數(shù)為3，膜內(nèi)螺旋氨基數(shù)為68.688 8，而膜內(nèi)螺旋數(shù)大于18 時(shí)表明該蛋白有跨膜區(qū)域，故CsCER10蛋白有跨膜區(qū)域，在前60 個(gè)氨基酸中有39.887 5 個(gè)膜內(nèi)螺旋氨基數(shù)，表明CsCER10 編碼的蛋白質(zhì)可能是一個(gè)信號(hào)肽。

3 討論

3.1 CsCER10可能參與黃瓜表皮細(xì)胞發(fā)育

本研究在不同組織中的熒光定量結(jié)果表明，CsCER10 在黃瓜表皮細(xì)胞的發(fā)育中起著重要作用。

3.2 CsCER10受非生物脅迫誘導(dǎo)

本試驗(yàn)中非生物脅迫處理后熒光定量PCR 結(jié)果顯示，CsCER10 基因在遭受干旱、鹽脅迫及低溫時(shí)表達(dá)量均呈上升的趨勢(shì)。有研究表明，水稻中與蠟質(zhì)合成相關(guān)的基因OsGL1，在干旱和低溫處理中表達(dá)量均上升[23]。王文嬌等[15-16]研究表明，參與蠟質(zhì)合成的CsCER1 和CsWAX2 均可以被NaCl、低溫及干旱等非生物脅迫誘導(dǎo)且表達(dá)水平均呈上升趨勢(shì)。因此，CsCER10 與 CsCER1 和 CsWAX2 一樣，能夠受非生物脅迫的誘導(dǎo)。

3.3 CsCER10可能參與黃瓜蠟質(zhì)合成

在擬南芥中，AtCER10 是一種烯酰輔酶A 還原酶（ECR），這是超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成中的關(guān)鍵因素。本研究中，CsCER10 與AtCER10 蛋白處于同一進(jìn)化支上，說(shuō)明CsCER10 屬于蠟質(zhì)合成的CER 家族，且可能在超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成中起著重要的作用。熒光定量結(jié)果顯示，CsCER10 在葉片和果表皮中的表達(dá)量比較高，且其在果皮中的表達(dá)量是果實(shí)中的14 倍。劉小鳳等[24]研究結(jié)果表明，與蠟質(zhì)合成相關(guān)的CsCER7 在黃瓜各個(gè)組織部位均有表達(dá)，且果表皮的表達(dá)量高于果實(shí)，這與CsCER10 的研究結(jié)果一致。前人研究表明，蠟質(zhì)合成部位在植物的表皮細(xì)胞[25]，因此，推斷CsCER10 可能與黃瓜蠟質(zhì)合成相關(guān)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)綜合研究了CsCER10 在黃瓜不同組織中的表達(dá)模式，并且對(duì)其生物學(xué)信息進(jìn)行分析。結(jié)果表明，CsCER10 受非生物脅迫誘導(dǎo)，其表達(dá)量在黃瓜葉片和果皮中較高，并且CsCER10蛋白與AtCER10 蛋白處于同一進(jìn)化支上，因此，推斷CsCER10 可能參與蠟質(zhì)的合成，但其具體的分子機(jī)制需進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。