李統(tǒng)華, 馮中紅, 楊成德

(甘肅農業(yè)大學植物保護學院/甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

植物內生細菌(endophytic bacteria)指生活史中某一階段或全部階段生活在健康植物組織內又不對植物組織造成病害的細菌[1]。內生細菌存在于植物的根、莖、葉、花、果實等部位，是一類巨大的微生物資源。通過溶磷、固氮和分泌IAA等增進宿主植物生長發(fā)育，提高宿主植物的產量、抗寒、耐熱和抗病蟲害等抵抗逆境的能力[2-3]。Rashid等[4]報道了內生細菌分泌IAA等促進植物生長，江緒文等[5]報道了藿香內生細菌HX-2能使藿香種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率以及藿香幼苗的株高、根長、葉面積、鮮重、干重、葉綠素含量和根系活力顯著提高。東祁連山位于青藏高原邊緣，甘肅、青海交界處[6]，特殊的地理位置和氣候條件，形成了獨具特色的高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)，高寒草甸牧草及內生菌是其重要組成部分，維持著生態(tài)系統(tǒng)的平衡，牧草內生細菌因其特殊的生境和在生態(tài)系統(tǒng)中的作用，具有分泌IAA、溶磷和固氮等特點[7-8]。目前，國內外農藥的病害主要依靠化學農藥，盡管效果可觀，但化學農藥的使用會引起植物病原菌產生抗藥性、農藥殘留、環(huán)境污染和生態(tài)破壞等問題[9]，而生物防治既可取得良好的防治效果，又能克服以上缺點，已成為目前研究熱點[10]。但有關特殊生境高寒草甸牧草內生細菌的研究報道較少[11]，優(yōu)良菌株開發(fā)潛力值得人們深入探討。本試驗對菌株261MY6抑菌譜、溶磷、固氮和分泌IAA能力等進行了測定，旨在為高寒草甸牧草內生細菌開發(fā)利用提供理論依據(jù)，也為植物病害生物防治提供菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料

供試病原細菌：番茄丁香假單胞葉斑病菌(Pseudomonassyringa)；病原真菌：馬鈴薯炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)、馬鈴薯枯萎病菌(Fusariumavenaceum)、馬鈴薯褐腐病菌(Stysanusstemonitis)、黃瓜枯萎病菌(F.oxysporum)、小麥根腐病菌(Bipolarissorokiniana)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、番瓜根腐病菌(Fusariumsp.) 和孜然根腐病菌(F.Solani)；拮抗菌株：分離自高寒草甸牧草健康根、莖、葉、花部位內生細菌120株。以上菌株均由甘肅農業(yè)大學植物保護學院植物病原細菌及生物多樣性實驗室提供。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基NA[11]、PDA培養(yǎng)基[11]、King培養(yǎng)基[11]、PKO培養(yǎng)基[11]、孟金娜培養(yǎng)基[11]和阿須貝培養(yǎng)基[11]。

試劑：Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(購于天根生化科技有限公司)；引物：

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，

UP-1：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCATGCCGGTGGAAAGTTCGA-3′，

UP-2：5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAG-CCATCTACGTCAGCGTCAGTCAT-3′；DL2000 Marker、2×Power Taq Mixture均購于上海生工生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1拮抗菌株篩選 采用含菌平板抑菌圈測定法[12]篩選優(yōu)良拮抗菌株。以番茄丁香假單胞葉斑病菌作為指示菌，將其含菌量為108CFU·mL-1菌液加至滅菌后的NA培養(yǎng)基中混勻制成含菌平板，在平板上分別等距離點接不同的拮抗菌株，每株3次重復，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d后測量并記錄抑菌帶寬度。

1.2.2生物功能的測定[13]抑菌譜測定：采用平板對峙法[10]，于PDA平板中央分別接種8種供試病原真菌菌餅(D=0.5 cm)，與其等距離(2.5 cm)處點接拮抗菌株，以點接無菌NA培養(yǎng)液為對照，于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待對照指示菌滿皿后量取待測菌落直徑，計算抑菌率。

固氮能力測定：將待測菌株用劃線法接于阿須貝培養(yǎng)基上，以接無菌水為對照，28℃培養(yǎng)，在第3和7 d檢查其生長情況，在培養(yǎng)基上明顯生長者記為陽性，繼代培養(yǎng)3代仍為陽性，則認為具有固氮能力。

2.2和肽素水平隨心功能分級增高依次加大,心功能II、III級和IV級患者的和肽素含量均顯著高于未發(fā)生心衰患者及心功能I級患者(P<0.05)

溶磷能力測定：將待測菌株分別點接在PKO和孟金娜平板培養(yǎng)基上，同時，用無菌水點接作為對照，28℃培養(yǎng)3～5 d，菌落周圍出現(xiàn)透亮溶磷圈的記錄為陽性，否則為陰性。

產IAA能力測定：采用Salkowski法篩選具有產植物生長激素能力的內生細菌。將待測菌株接于King培養(yǎng)液中，置于28℃，120 rpm搖床中連續(xù)培養(yǎng)12 d。取菌液0.05 mL滴于白色陶瓷板上，并加入等量比色液。以加0.05 mL IAA的比色液作對照；在室溫下10～15 min內目測其顏色變化，紅色為陽性，其它為陰性。

以上處理與對照均3次重復。

1.3 菌株鑒定

形態(tài)觀察：采用劃線法將所篩選的拮抗菌株接于NA培養(yǎng)基上，于28℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d后，觀察菌落的形態(tài)特征并描述；將培養(yǎng)12 h后的新鮮菌體進行革蘭氏染色[14]，拍照。

生理生化測定：碳源利用試驗、甲基紅試驗、V-P試驗、硝酸鹽還原試驗、精氨酸雙水解酶試驗、接觸酶試驗、氧化酶試驗、產吲哚試驗、產H2S試驗、果聚糖產生試驗、糖、醇類發(fā)酵試驗、明膠液化、淀粉水解、Tween80水解、運動性試驗，相關培養(yǎng)基配方與試驗方法參考方中達[14]和東秀株等[15]的方法。

16S rDNA與gyrB基因序列鑒定：采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株DNA。16S rDNA與gyrB的擴增分別利用引物27F/1492R[16]和UP-1/UP-2[11]。16S rDNA的PCR擴增條件：95℃預變性5 min，94℃變性1 min，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)30次；再在72℃延伸8 min，4℃保存。擴增反應體系總體積為50 μl，其中2×PowerTaqMixture 25 μl，27 F 2 μl，1492 R 2 μl，Target DNA 1 μl，ddH2O 20 μl。gyrB的擴增條件：95℃預變性5 min；94℃變性1min，5℃退火1 min，72℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴增體系中引物為UP-1/UP-2，其它同16S rDNA。后經(jīng)凝膠電泳檢測將有特異性條帶的擴增產物送生工生物(上海)有限公司進行測序。將測定的序列在GenBank中與已知序列進行Blast同源性比對分析，并用Mega(7.0)軟件進行多重序列比較，用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確拮抗菌株的系統(tǒng)發(fā)育學地位。

1.4 室內盆栽對番茄丁香假單胞葉斑病防效

將拮抗菌株和番茄丁香假單胞葉斑病分別經(jīng)NA搖瓶液體培養(yǎng)24 h后，先將病原菌通過傷口接種法接種于健康的番茄植株葉片上，24 h后接種生防菌菌懸液，保濕24 h后在室內條件下待其發(fā)病，10 d后觀察發(fā)病情況，計算發(fā)病率、病情指數(shù)及生防菌對番茄葉斑病的相對防治效果。

1.5 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2010和SPSS19.0等軟件進行試驗設計與數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株篩選

從供試內生細菌中篩選出10株有明顯抑菌帶的拮抗細菌，其抑菌圈直徑介于0.75～1.22 cm，抑菌帶寬介于0.20～0.65 cm，經(jīng)復篩對拮抗效果較強且穩(wěn)定的菌株261MY6進行后續(xù)研究(圖1)。

圖1 生防菌株261MY6的篩選Fig.1 Screening of antagonistic strain 261MY6

2.2 抑菌譜測定

結果表明，菌株261MY6對馬鈴薯炭疽病病菌、番茄灰霉病病菌、小麥根腐病病菌、馬鈴薯褐腐病病菌、孜然根腐病菌、黃瓜枯萎病菌、馬鈴薯枯萎病菌和番瓜根腐病菌的抑制率均在50%以上，其中對馬鈴薯褐腐病菌抑制率高達96.10% (表1、圖2)。

表1 261MY6的抑菌譜測定Table 1 The inhibition rate of antagonistic strains against pathogenic fungi

圖2 拮抗菌株的抑菌譜測定Fig.2 Antagonistic strains confront eight kinds of pathogenic fungi photos注：1:馬鈴薯枯萎病菌; 2:孜然根腐病菌; 3:小麥根腐病菌; 4:馬鈴薯褐腐病菌; 5:馬鈴薯炭疽病菌; 6:黃瓜枯萎病菌; 7:番茄灰霉病菌; 8:番瓜根腐病菌。A1至A8為處理Note：1:F. avenaceum; 2: F. Solani; 3: B. sorokiniana; 4: S. stemonitis; 5: C. coccodes; 6: F. oxysporum; 7: B. cinerea; 8: Fusarium sp. A1 to A8 for processed

2.3 生物功能測定

2.3.1固氮能力測定 菌株261MY6在無氮阿須貝培養(yǎng)基上能生長，且在7 d后連續(xù)培養(yǎng)的3代也能在無氮培養(yǎng)基上形成明顯的菌落，說明菌株261MY6具有穩(wěn)定的固氮作用。

2.3.2溶磷能力測定 溶磷能力采用溶磷圈法，在PKO培養(yǎng)基上菌株261MY6周圍有溶磷圈(圖3)，孟金娜培養(yǎng)基上無溶磷圈，表明菌株261MY6只能溶解無機磷。

圖3 溶磷能力定性測定Fig.3 Phosphorus-solubilizing capacity determination of antagonistic strain 261MY6

2.3.3產IAA能力測定 含色氨酸和不含色氨酸的培養(yǎng)液中分別加入比色液，菌株261MY6在陶瓷板上均變色，表現(xiàn)為淡紅色和血紅色的陽性反應，說明菌株261MY6有產IAA的能力(圖4)。

圖4 產IAA能力的定性測定Fig.4 IAA-producing capacity determination of the antagonistic strain 264ZY7注：A:CK+PC (不含色氨酸); B: CK+PC (含色氨酸);C: 261MY6+PC (不含色氨酸)； D: 261MY6+PC (含色氨酸)。Note: A:CK+PC (No Tryptophan); B: CK+PC (Tryptophan);C: 261MY6+PC (No Tryptophan)；D: 261MY6+PC (Tryptophan)。

2.4 拮抗菌株的鑒定

2.4.1形態(tài)學觀察 菌株261MY6菌落呈圓形，中央稍陷，乳白色，不透明，菌落大小約為2 mm，菌體呈短桿狀，革蘭氏染色陽性，0.61×1.61 μm～0.71×2.04 μm (圖5)。

圖5 菌株261MY6的菌落形態(tài)和革蘭氏染色Fig.5 The colony morphology and gram staining of antagonistic strain 261MY6

2.4.2生理生化測定 由表2知，菌株261MY6甲基紅試驗為陰性，V-P測定為陽性，能夠還原硝酸鹽，精氨酸雙水解酶和氧化酶反應為陰性，接觸酶、淀粉水解和Tween 80水解試驗均為陽性反應，具有產吲哚和H2S的能力，明膠液化為陽性，能利用L-阿拉伯糖、甘露糖、山梨糖、乙醇和甘露醇等多種糖、醇類進行發(fā)酵產酸，對蘋果酸、乳酸和丙酸的利用為陽性。

表2 菌株261MY6生理生化特性測定Table 2 Determination of physiological and biochemical characteristics of antagonistic strain 261MY6

2.4.3基因序列分析鑒定 1)菌株261MY6的16S rDNA基因為1194個堿基，其基因序列與GenBank中已知序列進行Blast同源性比對與解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens(KC692163.1，MH934926.1)的相似度較高。經(jīng)建立系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株261MY6與解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens(KC692163.1，MH934926.1)聚在一起(圖6)。因此，初步將其鑒定為解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens。

2)菌株261MY6的gyrB基因為595個堿基，其基因序列在GenBank中與已知序列進行Blast同源性比對，與解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens(KT265087.1)的相似度較高。經(jīng)建立系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株261MY6與解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens(KT265087.1)聚在一起(圖7)，結合形態(tài)學特征、生理生化特性和16SrDNA序列分析，將菌株261MY6鑒定為解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens。

圖6 菌株261MY6 16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 6S rDNA phylogenetic tree of antagonistic strain 261MY6

圖7 菌株261MY6 gyrB系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 gyrB phylogenetic tree of antagonistic strain 261MY6

2.5 室內盆栽對番茄丁香假單胞葉斑病的防效

經(jīng)盆栽試驗，菌株261MY6接種10 d后，發(fā)病率為58.18%，病情指數(shù)為21.82，對照組發(fā)病率和病情指數(shù)分別為94.38%和55.06，對番茄丁香假單胞葉斑病的防效為68.71%，說明該菌株對番茄葉斑病表現(xiàn)出較好的防治效果，具備良好的開發(fā)潛力。

3 討論與結論

內生細菌在寄主植物體內不易受外界環(huán)境條件的影響，且能長期穩(wěn)定繁殖，安全性高，利用其防治植物病害有得天獨厚的優(yōu)勢。為實現(xiàn)新時代生態(tài)文明建設，全面推動綠色發(fā)展，越來越多專家學者對有巨大開發(fā)潛力的有益內生細菌開始研究和開發(fā)，裴淑蘭等[18]報道野生酸棗內生菌中對梨黑斑病菌和黃瓜枯萎病菌有拮抗作用；喬俊卿等[19]報道枯草芽孢桿菌Bs916對番茄青枯病具有較好的防病效果。本試驗從高寒草甸牧草中分離篩選到一株對病原細菌和真菌都具有良好拮抗作用的內生細菌261MY6，經(jīng)分子生物學16S rDNA和gyrB基因序列相似性分析，并結合形態(tài)學、生理生化特性將菌株261MY6鑒定為解淀粉芽胞桿菌Bacillusamyloliquefaciens。芽胞桿菌是自然界分布廣泛的一種生防細菌，因具有超強的繁殖力，穩(wěn)定的理化性質，廣泛的抑菌譜，在科研和生產中應用較多，譙天敏等[20]報道解淀粉芽孢桿菌能夠有效定殖于山茶葉片表面及內部，且對山茶灰斑病具有顯著的生物防治效果；楊曉云等[21]報道解淀粉芽孢桿菌B1619對設施番茄土傳病害具有良好防治效果。本試驗中，菌株261MY6對馬鈴薯炭疽病菌、馬鈴薯褐腐病菌、馬鈴薯枯萎病菌、番茄灰霉病菌、小麥根腐病菌、孜然根腐病菌、黃瓜枯萎病菌和番瓜根腐病菌的抑制率均在50%以上，其中對馬鈴薯褐腐病菌抑制率高達96.10%。室內盆栽對番茄丁香假單胞葉斑病的防效達68.71%，說明該生防細菌具備良好的開發(fā)潛力，但菌株261MY6的作用機理及發(fā)酵條件還需進一步探討。