祁金玉,鄧?yán)^峰,尹大川,蔡立新,劉冬萍,張麗麗,林 梅

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 沈陽 110866

油松(Pinustabulaeformis)為中國特有樹種。它適應(yīng)性強,根系發(fā)達(dá),耐干旱耐瘠薄,是我國北方地區(qū)最主要造林樹種[1],依賴菌根來吸收水分和養(yǎng)分以適應(yīng)不良的環(huán)境條件[2- 3]。外生菌根具有促進(jìn)油松生長,增強油松抗逆性的作用[4- 6]。

植物根系將植物固定在土壤中支撐著植物的地上部分,是植物吸收水分和養(yǎng)分的主要器官,根系的空間分布特征對其吸收水分養(yǎng)分的能力、根系生物量/根系生產(chǎn)力和根系動態(tài)變化有重要影響[7-8]。外生菌根真菌(Ectomycorrhizal fungi；簡稱ECMF)侵染植株根系后,增加了植株根系的適應(yīng)性,拓寬了植株獲取營養(yǎng)的渠道。吳小芹等[9]研究接種黃色須腹菌(Rhizopogenluteous)、彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius)和美味牛肝菌(Boletusedulis)均能增加黑松(P.thunbergii)根系直徑、吸收根的分布范圍等根系參數(shù)。翟帥帥等[10]研究褐環(huán)乳牛肝菌(S.luteus)接種馬尾松顯著增加了馬尾松根系總長度、表面積、體積等根系參數(shù),擴(kuò)展了根系分布范圍。目前對油松根系的研究,主要有不同光照、施用有機碳肥等條件下油松根系變化情況,以及建立油松根系的三維靜態(tài)模型[11- 13]。對于不同種類的外生菌根真菌接種后油松幼苗根系構(gòu)型報道較少。

本研究通過對油松接種褐環(huán)乳牛肝菌(S.luteus)和紅汁乳菇(L.hatsudake),以期促進(jìn)油松幼苗苗高地徑的增長,提高苗木理化性質(zhì),探討兩種ECMF對油松根系構(gòu)型的促生效應(yīng),為培育優(yōu)良的油松菌根苗木,提高造林成活率,提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

油松種子由撫順林業(yè)局提供。供試菌種：紅汁乳菇(L.hatsudake)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈；褐環(huán)乳牛肝菌(S.luteus)分離自遼寧省彰武縣章古臺實驗林場。

1.2 試驗準(zhǔn)備

種子催芽：2016年4月20日播種,選取大小一致的油松種子,預(yù)先用0.5%高錳酸鉀消毒30 min,無菌水沖洗數(shù)次后,用滅菌濕紗布包裹保濕,置于25℃人工氣候箱中催芽,每天早、晚用無菌水各沖洗1次,直至出芽。

無菌土制備：試驗用盆為營養(yǎng)缽(15 cm×12 cm×13 cm)。缽內(nèi)預(yù)先裝入121℃下高溫高壓滅菌2 h的混合土(草炭土∶蛭石∶河沙=2∶1∶1),每盆土量重約500 g。

菌劑制備：用直徑5 mm的無菌打孔器,切取在平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的褐環(huán)乳牛肝菌、紅汁乳菇,分別接種于盛有250 mL PD液體培養(yǎng)基(配方：葡萄糖20 g,馬鈴薯200 g,KH2PO43 g,MgSO4·7H2O 1.5 g,H2O 1000 mL)的三角瓶中,每瓶接種3片菌餅。置于搖床上(25℃、160 r/min)振蕩培養(yǎng),得到液體菌劑。使用前按照菌劑和水體積為1∶3的比例混合,用攪碎機將菌絲體攪碎做勻漿處理,備用。

1.3 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置3種處理方式：

處理1：接種無菌PD培養(yǎng)基(CK)；

處理2：接種紅汁乳菇(LH)；

處理3：接種褐環(huán)乳牛肝菌(SL)。

待幼苗成活定株后,采取打孔灌根接種的方式接種紅汁乳菇和褐環(huán)乳牛肝菌,每盆接種50 mL菌劑。CK施以等量無菌PD培養(yǎng)基。每個處理10次重復(fù),每盆5株苗,共30盆,150株苗。

1.4 測定方法

1.4.1菌根侵染率

在苗木生長4個月后,每處理隨機挖取油松幼苗10株,在體式鏡下觀察菌根形態(tài),測定菌根侵染率。

外生菌根侵染率采用統(tǒng)計計算法。將根樣剪成1 cm等長的根段,隨機選取根樣,每樣100個根段,在體視鏡下觀察外生菌根侵染率。

1.4.2苗木生長指標(biāo)測定

每處理隨機取樣10株,輕輕抖掉表面土,流水沖掉根部附著土,用卷尺和游標(biāo)卡尺分別測量植株的苗高、地徑；用吸水紙吸干水分電子天平稱取鮮重,80℃烘干至恒重稱取干重。

1.4.3苗木抗氧化酶活性

分別選取不同處理油松苗相同部位針葉和根系取樣,利用南京建成試劑盒測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性。

1.4.4苗木根系參數(shù)測定

根系生長：掃描儀對不同處理的根系進(jìn)行掃描、分級。用萬深LA-S植物根系分析系統(tǒng)對根系長度、投影面積、表面積、體積、平均直徑、根尖數(shù)、分枝數(shù)、交叉數(shù)等指標(biāo)進(jìn)行分析。

根系空間構(gòu)型：測定一級側(cè)根與主根的夾角,根據(jù)吳小芹[11]方法將一級側(cè)根分為3類(Ⅰ：<60°側(cè)根；Ⅱ：60°—80°側(cè)根；Ⅲ：80°—90°側(cè)根),計算各類角度側(cè)根占一級側(cè)根總數(shù)的比例。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)用SPSS進(jìn)行單因素差異顯著性分析,α=0.05,并用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 油松幼苗的菌根侵染率及形態(tài)觀察

油松幼苗菌根侵染率見表1,菌根形態(tài)見圖1。由表1可知,兩種外生菌根菌均能與油松形成外生菌根,其中褐環(huán)乳牛肝菌與油松菌根合成率最高為68.62%,紅汁乳菇與油松菌根合成率為62.12%,二者差異不顯著。

褐環(huán)乳牛肝菌與油松可形成棒狀和二叉狀分支的菌根；紅汁乳菇與油松形成的菌根中只觀察到棒狀菌根。形成菌根的苗木根系前端有膨大增粗,呈盾圓形。對照未形成菌根根系前端平齊。

圖1 形成菌根形態(tài)(20×)Fig.1 The formation of mycorrhizal synthesis(20×)CK：對照Control check；LH：紅汁乳菇Lactarius hatsudake；SL：褐環(huán)乳牛肝菌Suillus luteus

2.2 不同外生菌根菌對油松幼苗生長的影響

對照油松生長纖細(xì),針葉稀疏,接種紅汁乳菇和褐環(huán)乳牛肝菌處理油松幼苗生長健壯,針葉較對照茂密,其中接種褐環(huán)乳牛肝菌油松針葉尤其茂盛。

接種處理均能顯著提高油松的苗高、地徑；地上和地下部分的鮮重、干重。不同接種處理只有地徑差異不顯著(P>0.05),接種褐環(huán)乳牛肝菌相比接種紅汁乳菇的苗木苗高增加12.17%；地上和地下部分的鮮重增加37.68%、60.68%;地上和地下部分的干重增加40.11% 、61.64%。

表1 不同處理對幼苗生長的影響

CK：對照Control check；LH：紅汁乳菇Lactariushatsudake；SL：褐環(huán)乳牛肝菌Suillusluteus

2.3 不同外生菌根菌對油松幼苗抗氧化酶活性的影響

不同處理油松幼苗抗氧化酶活性見表2。接種外生菌根菌的油松幼苗針葉和根系SOD、POD、CAT 3種抗氧化酶活性均大于不接種處理,經(jīng)方差分析接種處理與對照CK存在顯著差異。接種褐環(huán)乳牛肝菌幼苗針葉的抗氧化酶活性均大于接種紅汁乳菇幼苗,其中SOD活性比接種紅汁乳菇的高14.77%,POD活性高20.77%,CAT活性高34.68%；根系中抗氧化酶活性也均大于接種紅汁乳菇幼苗,分別高出8.54%,4.34%,33.31%。

表2 不同處理對幼苗針葉和根系抗氧化酶活性的影響/(U g-1s-1)

2.4 不同外生菌根菌對油松幼苗根系構(gòu)型的影響

2.4.1根系參數(shù)

不同處理根系生長參數(shù)測定結(jié)果見表3。接種處理顯著提高了油松根系長度、表面積、體積、平均直徑、根尖數(shù)、分叉數(shù)。接種褐環(huán)乳牛肝菌和紅汁乳菇處理與對照相比,根系長度分別增加12.82%和19.15%；表面積分別增加70.37%、69.81%；根系體積分別增加92.34%、92.61%；根系平均直徑均增加66.67%；根尖數(shù)分別增加92.24%、88.13%；分叉數(shù)分別增加79.29%、80.41%。

表3 不同處理幼苗根系生長參數(shù)

2種接種處理根系參數(shù)中根系長度增加幅度較小,在10.00%—20.00%之間；其余指標(biāo)均增加60.00%以上。方差分析表明接種處理與對照均存在顯著差異,兩種接種處理間只有根尖數(shù)存在顯著差異,其他根系參數(shù)指標(biāo)均差異不顯著。

2.4.2油松不同菌根幼苗根系空間構(gòu)型

不同處理油松幼苗的根系分布情況見圖2、圖3。

圖2 不同處理油松根系形態(tài)Fig.2 Pinus tabulaeformisroot morphology under different treatments

圖3 油松不同外生菌根苗木根系不同角度一級側(cè)根所占比例 Fig.3 The occupation of primary lateral roots in the different angle of branch under different the mycorrhizal inoculation

由圖2可見接種褐環(huán)乳牛肝菌的油松根系構(gòu)型明顯優(yōu)于接種紅汁乳菇和對照。由圖3可見接種褐環(huán)乳牛肝菌幼苗根沿主根分支成80°—90°的一級側(cè)根占23.81%,60°—80°的一級側(cè)根占16.65%,<60°的一級側(cè)根占59.54%；接種紅汁乳菇幼苗根沿主根分支成80°—90°的一級側(cè)根占13.3%,60°—80°的一級側(cè)根占17.34%,<60°的一級側(cè)根占69.36%；對照幼苗根沿主根分支成80°—90°的一級側(cè)根僅占2.41%,60°—80°的一級側(cè)根占4.91%,<60°的一級側(cè)根占92.68%。其中褐環(huán)乳牛肝菌80°—90°的一級側(cè)根最多,紅汁乳菇次之,對照根系中所占比例最少,因而接種褐環(huán)乳牛肝菌幼苗的根系沿根圍不同方向生長范圍最廣,對照根系中80°—90°的一級側(cè)根少,限制了根系的橫向生長。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明,在實驗室條件下選用的兩種外生菌根菌均能與油松合成典型的外生菌根,菌根侵染率超過60%。低于劉強[14]褐環(huán)乳牛肝菌與油松的菌根合成率和翟帥帥等[10]褐環(huán)乳牛肝菌與馬尾松菌根合成率,這可能是因為不同采集地點菌株差異、不同寄主植物間差異或菌劑施用濃度的差異。褐環(huán)乳牛肝菌與油松主要形成棒狀和二叉狀菌根；紅汁乳菇與油松主要形成棒狀菌根,試驗中未觀察到其他形態(tài)菌根。研究結(jié)果同時表明,兩種外生菌根接種處理均顯著提高了油松幼苗的苗高、地徑、干重、鮮重。

CAT、POD 和 SOD 是植物體內(nèi)主要的抗氧化酶系,通過它們的變化程度可以反映植物的抗逆性[15]。SOD作為植物抗氧化系統(tǒng)的第一道防線在生物體中普遍存在,它將超氧陰離子自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫,控制細(xì)胞膜脂過氧化,接著由 CAT 和 POD 立即將過氧化氫分解為無害的水[16- 17]。在正常的條件下,植物體內(nèi)酶彼此協(xié)調(diào),防御系統(tǒng)中酶的活性高低就成為控制傷害的決定因素,也能較好地反映植物對逆境的適應(yīng)能力[18]。本研究中接種外生菌根油松幼苗的針葉和根系3種抗氧化酶(SOD、CAT、POD)活性顯著高于不接種處理,兩種外生菌根菌處理間褐環(huán)乳牛肝菌針葉和根系抗氧化酶活性均高于紅汁乳菇處理,其中只有根系POD活性間無顯著差異,其余均具有顯著差異。

生長指標(biāo)可以直接評價苗木生長的好壞程度。油松接種兩種外生菌根菌后,苗高、地徑等生長指標(biāo)有了顯著提高,說明選用的兩種外生菌根菌均具有促進(jìn)苗木生長的作用。褐環(huán)乳牛肝菌與松科合成菌根的研究較多,紅汁乳菇研究報道較少,周崇蓮等[19]報道了紅汁乳菇與馬尾松形成菌根促進(jìn)生長；薛振文等[20]研究了與馬尾松接種適宜的紅汁乳菇菌劑量；李小利[21]研究了紅汁乳菇與黑松能形成菌根,其他大多是野外調(diào)查紅汁乳菇與松科植物的菌根情況[22]。本研究證明紅汁乳菇也能在人工條件下與油松形成菌根,并促進(jìn)油松生長。但研究結(jié)果表明接種褐環(huán)乳牛肝菌對油松幼苗生長及生物量的積累作用優(yōu)于紅汁乳菇,同時,接種褐環(huán)乳牛肝菌的油松苗木針葉和根系中保護(hù)酶活性均高于紅汁乳菇接種苗木。生長健壯的苗木,其體內(nèi)抗氧化酶系也相應(yīng)的高,進(jìn)一步從生理角度證明適宜接種褐環(huán)乳牛肝菌培育油松壯苗。

根系長度、表面積和體積是衡量植物根系分布范圍的重要參數(shù),接種紅汁乳菇和褐環(huán)乳牛肝菌增加了油松根系總長度、表面積和體積。平均根系直徑、根尖數(shù)、分叉數(shù)是衡量根系吸收功效的重要參數(shù),接種紅汁乳菇和褐環(huán)乳牛肝菌增加了油松根系平均直徑、根尖數(shù)、分叉數(shù)。這與翟帥帥等[10]在褐環(huán)乳牛肝菌對馬尾松根系構(gòu)型的促進(jìn)作用的研究結(jié)果一致。

不同處理油松幼苗的根系各不同角度的根分布不均衡,其中接種褐環(huán)乳牛肝菌幼苗根沿主根分支成80°—90°的一級側(cè)根占23.81%,顯著大于紅汁乳菇接種處理,<60°的一級側(cè)根顯著低于紅汁乳菇處理。結(jié)合根系生長參數(shù)、一級側(cè)根角度綜合看,雖然在根系總長度、表面積等參數(shù)上紅汁乳菇和褐環(huán)乳牛肝菌作用基本相同,但接種褐環(huán)乳牛肝菌油松幼苗一級側(cè)根角度中80°—90°的一級側(cè)根最多,有利于根系擴(kuò)大沿根圍向不同方向生長的范圍,表明褐環(huán)乳牛肝菌形成的油松根系發(fā)達(dá)、分布范圍廣,更利于養(yǎng)分和水分的吸收。所以接種褐環(huán)乳牛肝菌的處理方式更有利于油松生長。對照根系中80°—90°的一級側(cè)根很少,限制了根系的橫向生長。一旦外生菌根菌與樹木根形成外生菌根后,特殊結(jié)構(gòu)和根-菌互作,使外生菌根具有諸多功能。有些地區(qū)缺乏外生菌根菌,在常規(guī)造林的過程中使其自然感染菌根真菌是相當(dāng)難的,為了達(dá)到更高的油松造林成活率,人為菌根化苗木的培育就顯得十分重要。

由于研究條件等的限制,相比較地上部分功能形狀的研究,根系研究仍相對滯后[23]。本研究中選用傳統(tǒng)方法中的容器法,由于受容器限制,會抑制或影響根系生長,從而致使觀測數(shù)據(jù)與實際情況的不符,還需要今后利用苗圃等野外實驗條件進(jìn)一步實驗。