陳 勇 華相偉 黃冰源 王綺夏 夏 強(qiáng) 馬 雄&

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科 上海市消化疾病研究所1(200001) 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院肝臟外科2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院肝病中心3

背景：研究顯示心肌營養(yǎng)素-1(CT-1)在器官損傷保護(hù)以及糖、脂代謝等過程中具有重要調(diào)節(jié)作用。目的：探討膽汁淤積性疾病中低氧誘導(dǎo)因子(HIFs)對CT-1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。方法：2016年6月—2017年6月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院招募膽道閉鎖患兒23例，7名健康活體肝移植供體作為對照組。以免疫組化法和蛋白質(zhì)印跡法檢測肝組織中的HIF-1α、HIF-2α、CT-1細(xì)胞定位和表達(dá)。在體外實(shí)驗(yàn)中，予人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)強(qiáng)氧化劑H2O2處理，并以RNA干擾技術(shù)沉默HIF-2α表達(dá)，以蛋白質(zhì)印跡法和real-time PCR檢測HIF-2α、CT-1表達(dá)變化。結(jié)果：在膽汁淤積患兒肝組織中，HIF-2α和CT-1共同分布于膽管細(xì)胞以及基質(zhì)細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞，HIF-1α僅偶見于炎性細(xì)胞。與健康對照者的肝組織相比，膽汁淤積患兒肝組織中HIF-2α、CT-1表達(dá)明顯升高。H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激可顯著上調(diào)HUVEC HIF-2α、CT-1表達(dá)，HIF-2α siRNA則可在轉(zhuǎn)錄水平抑制H2O2誘導(dǎo)的CT-1表達(dá)。結(jié)論：在小兒膽汁淤積性疾病中，CT-1表達(dá)受HIF-2α而非HIF-1α調(diào)節(jié)。膽汁淤積進(jìn)程中的氧化應(yīng)激中存在HIF-2α依賴性的CT-1表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。

作為白細(xì)胞介素-6(IL-6)家族成員，心肌營養(yǎng)素-1(cardiotrophin-1, CT-1)已被證明可在多種病理生理過程中發(fā)揮多種功能[1-2]。早期研究主要闡述了CT-1對器官損傷的保護(hù)作用，如缺血再灌注損傷以及由其他有害因素引起的器官功能衰竭[3-4]，最近一些研究指出CT-1也可能參與調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝[5-7]。筆者所在團(tuán)隊(duì)前期研究[8]還證實(shí)了CT-1在小兒膽汁淤積性肝病中的潛在促纖維化作用，然而其表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。

氧化應(yīng)激是多種膽汁淤積性疾病進(jìn)展的共同特征，可驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)和纖維化[9-10]。低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factors, HIFs)為堿性螺旋蛋白(basic helix-loop-helix, bHLH)-PAS家族成員，是氧化應(yīng)激狀態(tài)下的重要轉(zhuǎn)錄因子[11-12]。HIF-1α和HIF-2α是HIFs的主要調(diào)節(jié)亞基，兩者既有共同的靶基因，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(GLUT1)[11,13]，又可調(diào)節(jié)各自特定的靶基因表達(dá)，如磷酸甘油酸酯激酶1(PGK1)和八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4(Oct-4)[14-15]。至于CT-1，有報(bào)道稱HIF-1ɑ參與了心肌細(xì)胞CT-1轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)上調(diào)[16]。本研究擬探討HIFs是否參與了膽汁淤積性疾病中CT-1表達(dá)的調(diào)節(jié)。

材料與方法

一、標(biāo)本來源

于2016年6月—2017年6月招募行肝移植術(shù)的膽道閉鎖患兒23例，其中男性12例，女性11例，年齡(24.59±3.60)個(gè)月；膽汁淤積經(jīng)手術(shù)和病理證實(shí)。對照組肝組織源自同期7名健康活體肝移植供體，其中男性3名，女性4名，年齡(25.86±2.55)歲，臨床診斷無肝臟相關(guān)疾病，無肝功能障礙癥狀或體征，無其他嚴(yán)重炎癥或全身性疾病。兩組肝組織標(biāo)本均取材于肝移植術(shù)中。病例和對照均招募自上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院，均簽署知情同意書。研究方案通過醫(yī)院倫理委員會審批。

二、細(xì)胞株、主要試劑和儀器

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC, ATCC)。HIF-1ɑ、HIF-2ɑ、CT-1抗體(Abcam plc.)；β-actin抗體、HRP標(biāo)記IgG(Cell Signaling Technology)；Lipofect-amineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、InvitrogenTMTRIzolTM試劑、ECL發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher Scientific)；HIF-2α siRNA、對照siRNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、real-time PCR試劑盒(Takara Bio Inc.)；CT-1、β-actin PCR特異性引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。Applied BiosystemsTMABI PRISMTM7900HT序列檢測系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)。

三、方法

1. 免疫組化染色：肝組織標(biāo)本4%甲醛固定24 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm厚切片；石蠟切片60 ℃烤片1 h，脫蠟水化，3% H2O2處理15 min以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性；枸櫞酸微波法行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫；滴加山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫孵育30 min；分別加入HIF-1ɑ、HIF-2ɑ、CT-1一抗，4 ℃濕盒過夜后復(fù)溫30 min，PBS漂洗3次；滴加HRP標(biāo)記的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，自然晾干，中性樹膠封片。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)和處理：HUVEC加入含10%胎牛血清和青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于25 mL 培養(yǎng)瓶中，在5% CO2、37 ℃細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。根據(jù)需要以H2O2(0、50、100 μmol/L)處理24 h。參照試劑說明書制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物(100 pmol siRNA+5 μL LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑+500 μL Opti-MEM培養(yǎng)基)，轉(zhuǎn)染HUVEC。HIF-2α siRNA序列：F 5’-GCG CAA AUG UAC CCA AUG ATT-3’, R 5’-UCA UUG GGU ACA UUU GCG CTT-3’。

3. Real-time PCR：以TRIzol試劑提取經(jīng)不同處理HUVEC的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以之為模板，使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Perfect Real Time)行real-time PCR。引物序列：β-actin(內(nèi)參)F 5’-TTG ACG GAA GGG CAC CAC CAG-3’, R 5’-GCA CCA CCA CCC ACG GAA TCG-3’; CT-1 F 5’-GGG AGG GAA GTC TGG ACC C-3’, R 5’-CCC GAA GGG GTC TCC CTG-3’。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。2-△△CT法計(jì)算樣本目的基因mRNA相對表達(dá)量。

4. 蛋白質(zhì)印跡法：制備肝組織勻漿或收集經(jīng)不同處理的HUVEC，加入蛋白裂解液裂解10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法定量蛋白濃度。取40 μg總蛋白上樣，10% SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；分別加入HIF-2α、CT-1、β-actin一抗(工作濃度分別為1∶500、1∶500、1∶3 000)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜5 min×5次，加入二抗(工作濃度1∶5 000 )，常溫孵育1 h，ECL發(fā)光顯色。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、膽汁淤積患兒肝組織HIF-1α、HIF-2α、CT-1表達(dá)的細(xì)胞定位

為研究HIFs是否調(diào)節(jié)CT-1表達(dá)，首先檢測膽汁淤積患兒肝組織中的HIFs和CT-1表達(dá)。免疫組化染色結(jié)果顯示HIF-1ɑ僅在一些炎性細(xì)胞中偶然可見，HIF-2α則在膽管細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎性細(xì)胞等基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中廣泛表達(dá)，CT-1表現(xiàn)出與HIF-2α相似的表達(dá)分布(圖1)。上述結(jié)果提示膽汁淤積中的肝組織CT-1表達(dá)可能主要受HIF-2α而非HIF-1ɑ調(diào)節(jié)。

二、膽汁淤積患兒肝組織HIF-2α、CT-1表達(dá)升高

進(jìn)一步采用蛋白質(zhì)印跡法檢測肝組織HIF-2α、CT-1表達(dá)水平，結(jié)果顯示膽汁淤積患兒肝組織兩者表達(dá)與正常肝組織相比均明顯升高(圖2)。

三、H2O2刺激上調(diào)HIF-2α、CT-1表達(dá)

氧化應(yīng)激在膽汁淤積進(jìn)展中起重要作用。體外研究以強(qiáng)氧化劑H2O2處理HUVEC誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，蛋白質(zhì)印跡法和real-time PCR檢測顯示，HUVEC HIF-2α蛋白表達(dá)上調(diào)(圖3A)，CT-1 mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)(圖3A、3B)。

四、H2O2誘導(dǎo)CT-1表達(dá)上調(diào)依賴于HIF-2α

為確定HIF-2α對HUVEC CT-1基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，以RNA干擾技術(shù)沉默HIF-2α表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡法檢測顯示，HIF-2α siRNA可顯著降低經(jīng)H2O2(50 μmol/L)刺激的HUVEC中的HIF-2α、CT-1蛋白表達(dá)(圖4A)；更重要的是，real-time PCR檢測顯示CT-1 mRNA表達(dá)亦顯著下調(diào)(圖4B)。上述發(fā)現(xiàn)提示，在H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激中，HIF-2α在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)CT-1表達(dá)。

白色箭頭示膽管，黑色箭頭示血管內(nèi)皮

圖2 膽汁淤積患兒和健康對照者肝組織HIF-2α、CT-1蛋白表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

*兩組間比較，P<0.05

A：HIF-2α、CT-1蛋白表達(dá)上調(diào)(蛋白質(zhì)印跡法)；B：CT-1 mRNA表達(dá)上調(diào)(real-time PCR)

圖3 H2O2處理后HUVEC HIF-2α、CT-1表達(dá)變化

**兩組間比較，P<0.01

A：HIF-2α、CT-1蛋白表達(dá)下調(diào)(蛋白質(zhì)印跡法)；B：CT-1 mRNA表達(dá)下調(diào)(real-time PCR)

圖4HIF-2α siRNA處理后經(jīng)H2O2(50 μmol/L)刺激的HUVEC HIF-2α、CT-1表達(dá)變化

討 論

現(xiàn)有研究已證明CT-1在器官損傷保護(hù)以及糖、脂代謝等過程中具有重要調(diào)節(jié)作用。筆者所在團(tuán)隊(duì)還證實(shí)了CT-1在膽汁淤積中的促纖維化作用。本研究擬進(jìn)一步探討膽汁淤積性疾病中CT-1表達(dá)的調(diào)節(jié)機(jī)制。

HIFs的HIF-1α和HIF-2α亞基在功能上雖有一定共性，但兩者也在許多病理生理過程中表現(xiàn)出獨(dú)特甚至相反的功能[14-15,17-19]，此種差異可能與兩者的表達(dá)模式不同有關(guān)。HIF-1α mRNA表達(dá)廣泛，HIF-2α mRNA表達(dá)則更多地限于特定組織，如內(nèi)皮細(xì)胞和肺間質(zhì)中[18]。免疫組化分析顯示HIF-2α在低氧狀態(tài)下的腦、心、肺、腎、肝、胰腺和腸組織特定細(xì)胞群中均有表達(dá)[20]。本團(tuán)隊(duì)之前的研究[21]描述了HIF-2α在肝細(xì)胞中的作用，證明HIF-2α可促進(jìn)膽汁淤積期間的肝細(xì)胞凋亡。本研究通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)HIF-2α在膽道閉鎖膽汁淤積患兒肝臟膽管細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞中廣泛表達(dá)，同時(shí)觀察到CT-1的表達(dá)分布與HIF-2α相似。有趣的是，盡管先前研究[16]證實(shí)HIF-1α參與了小鼠心肌細(xì)胞的CT-1表達(dá)上調(diào)，但本研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在膽汁淤積中僅偶見于一些炎性細(xì)胞。蛋白表達(dá)水平的研究結(jié)果亦證實(shí)HIF-2α和CT-1在膽汁淤積患兒肝組織中表達(dá)升高。上述結(jié)果提示，在小兒膽汁淤積性疾病中，肝組織CT-1表達(dá)上調(diào)系受HIF-2α而非HIF-1α調(diào)節(jié)。

在膽汁淤積進(jìn)程中，氧自由基相關(guān)氧化應(yīng)激可激活多個(gè)促纖維化和炎癥反應(yīng)關(guān)鍵信號通路[22]。HIF-2α是參與膽汁淤積的重要轉(zhuǎn)錄因子，可介導(dǎo)對氧化應(yīng)激的初級轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[21]。 此外，氧自由基還有利于各種細(xì)胞因子和生長因子的合成和活化[22-24]。先前研究[16]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可刺激CT-1表達(dá)，后者作為反應(yīng)性保護(hù)因子對細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用。本研究體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，強(qiáng)氧化劑H2O2處理可顯著上調(diào)HUVEC的HIF-2α和CT-1蛋白表達(dá)，沉默HIF-2α則可在轉(zhuǎn)錄水平抑制H2O2誘導(dǎo)的CT-1表達(dá)，提示了氧化應(yīng)激下CT-1轉(zhuǎn)錄上調(diào)的HIF-2α依賴性機(jī)制。目前已有證據(jù)證明HIF-2α活化可促進(jìn)纖維化進(jìn)程[25-26]，而本研究發(fā)現(xiàn)HIF-2α參與介導(dǎo)了氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的CT-1表達(dá)上調(diào)，由此發(fā)揮促纖維化作用。因此，HIF-2α可能分別通過直接和間接途徑促進(jìn)纖維化發(fā)生。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，在小兒膽汁淤積性疾病中，CT-1表達(dá)受HIF-2α而非HIF-1α調(diào)節(jié)；膽汁淤積進(jìn)程中的氧化應(yīng)激中存在HIF-2α依賴性的CT-1表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制，該機(jī)制有望成為膽汁淤積性疾病的新型治療靶點(diǎn)。