宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性健康的第二大惡性腫瘤,是目前世界范圍內(nèi)具有高發(fā)病率和高死亡率的生殖系統(tǒng)的疾病。宮頸癌主要發(fā)生在老年女性,五年生存率極低,宮頸癌復(fù)發(fā)病人的生存期僅為1～2年[1]。文獻(xiàn)報(bào)道,高度保守的真核細(xì)胞真核翻譯起始因子5A(eIF5A)基因與癌癥發(fā)生機(jī)制密切相關(guān)。在所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,eIF5A-1基因呈現(xiàn)顯著高表達(dá),在增殖細(xì)胞中eIF5A-1表達(dá)更為豐富[2]。本研究通過構(gòu)建eIF5A-1過表達(dá)和沉默表達(dá)質(zhì)粒載體作用SiHa細(xì)胞,觀察eIF5A-1在宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)特征改變過程中的功能及作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料收集 選取2015年6月至2016年10月在青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院就治的宮頸癌病人40例,宮頸組織病理診斷明確。宮頸癌病人臨床資料收集完整無誤。將宮頸癌病人分為老年組和非老年組,其中老年組18例,年齡62～69歲,平均(66.1±3.2)歲,非老年組22例,年齡27～58歲,平均(42.1±7.1)歲。每例對(duì)象均收集癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織,取材后置于-79 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌細(xì)胞株SiHa由中國(guó)典型物種保藏中心提供。細(xì)胞接種在DMEM培養(yǎng)基中(包含小牛血清20%、鏈霉素100μg/mL、慶大霉素100 U/mL以及非必需氨基酸10 mL/L)。宮頸癌細(xì)胞培養(yǎng)及體外實(shí)驗(yàn)在37 ℃,5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行。

1.3 免疫印跡 取一定體積的宮頸癌組織及癌旁正常組織,分別加入5倍體積的組織裂解液,移液器反復(fù)吹打成糊狀,促使蛋白析出。取蛋白質(zhì)標(biāo)本與2×loading buffer混勻,100 ℃,20 min后,10 000 r/min,離心15 min;取上清樣本進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE);電泳結(jié)束后,進(jìn)行電轉(zhuǎn)移至偏二氟乙烯膜(PVDF);加入5%脫脂奶粉稀釋的eIF5A-1一抗,37 ℃孵育4 h,以TBS洗滌PVDF膜,每次15 min,洗滌3次,加入HRP連接的二抗,37 ℃孵育1 h后,加入顯色液,避光反應(yīng)6～12 min后,曝光20 s;Bio-Rad凝膠成像分析儀對(duì)免疫印跡條帶進(jìn)行灰度計(jì)算,以下列公式進(jìn)行計(jì)算:目的蛋白/內(nèi)參蛋白。

1.4 構(gòu)建eIF5A-1 siRNA質(zhì)粒載體 siRNA構(gòu)建采用pGenesil-1質(zhì)粒作為載體,BamHⅠ+HindⅢ進(jìn)行雙酶切后,采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行大分子片段回收。pGenesil-1線性化后與合成的eIF5A-1 siRNA(序列為:5′-AAC GGA ATG ACT TCC AGC TGA-3′)(隨機(jī)選取一段與目的基因無關(guān)序列作為Negative siRNA),在22 ℃水浴中,與T4DNA連接酶反應(yīng)24 h;取連接產(chǎn)物6 μL轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,均勻涂布LB平板上(含20μg/mL Kanar抗性),37 ℃,24 h;挑取陽(yáng)性單克隆菌落5個(gè),轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)液中,37 ℃,400 r/min搖床,24 h;提取質(zhì)粒后,SalⅠ進(jìn)行酶切,1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定;將篩選出的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒由武漢晶賽生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列分析,證實(shí)pGenesil-1質(zhì)粒中正確插入目的eIF5A-1基因片段,本研究中,重組質(zhì)粒命名分別為eIF5A-1 siRNA和Negative siRNA。

1.5 構(gòu)建eIF5A-1 vector質(zhì)粒載體 將BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點(diǎn)加入eIF5A-1引物序列中,eIF5A-1引物與探針的設(shè)計(jì),其上游序列為:Primer-F (5′-AAC ATA TGT CCG ATG ATG AGG GAA A-3′)和Primer-R (5′-AAG GAT CCT TAC TTT TCA ACA GCA TTT TTA-3′)。本研究中反應(yīng)體系如下:0.2μg DNA模板,0.1μg質(zhì)粒載體,加ddH2O至7.2μL,45 ℃孵育8 min,冷卻0 ℃。加入10 ng cDNA、100 ng質(zhì)粒載體、1μL T4DNA連接酶,以ddH2O定容至10μL,26 ℃,2 h,構(gòu)建重組eIF5A-1 vector。充分混勻后,10 000 r/min,離心15 min, 12 ℃,24 h,置于-20 ℃保存?zhèn)溆?重組質(zhì)粒分別命名為eIF5A-1 vector和Empty eIF5A-1 vector。

1.6 宮頸癌細(xì)胞活力的檢測(cè) 分別將構(gòu)建的Negative siRNA、eIF5A siRNA、Empty vector和eIF5A vector轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,采用甲基噻唑基四唑(MTT)比色法檢測(cè)SiHa細(xì)胞活力,實(shí)驗(yàn)步驟如下。用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞10 min后,用完全營(yíng)養(yǎng)液終止消化,調(diào)整細(xì)胞密度為1000～10 000個(gè)/孔,接種到96孔板,每孔200μL;繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,加入0.5% MTT溶液20μL,培養(yǎng)4 h后,棄去上清。加DMSO溶液200μL,充分震蕩20 min,使形成的結(jié)晶物甲躦徹底溶解,于490 nm波長(zhǎng)處,酶標(biāo)儀讀取各孔OD值。

1.7 宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的測(cè)定 分別將構(gòu)建的Negative siRNA、eIF5A-1siRNA、Empty vector和eIF5A-1 vector轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞,培養(yǎng)48 h后,采用3H-胸腺嘧啶核苷酸(3H-TdR)摻入法檢測(cè)SiHa的增殖能力。首先加入0.5～1μci3H-TdR 50μL繼續(xù)培養(yǎng)12～18 h。收集細(xì)胞后,10 000 r/min,離心15 min,棄去上清,冷PBS充分洗滌3次,用三氯乙酸、無水乙醇進(jìn)行充分抽干轉(zhuǎn)移置玻璃纖維濾紙上的細(xì)胞膜片,烘干后,剪濾紙片,將膜放入8 mL閃爍液中,暗視野,室溫放置25 min,用Beckman LS-9800型液體閃爍計(jì)數(shù)儀進(jìn)行檢測(cè),采用每分鐘放射性脈沖數(shù)(cpm)進(jìn)行統(tǒng)計(jì),實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)檢測(cè)3次,取平均值。

2 結(jié)果

2.1 eIF5A-1基因在宮頸癌和癌旁組織中的表達(dá) 免疫印跡結(jié)果顯示,eIF5A-1蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織(P<0.01)。其中老年組eIF5A-1蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)高于非老年組(P<0.05)。見表1。

表1eIF5A-1蛋白在宮頸組織中的表達(dá)

注：與癌旁正常組織比較,**P<0.01;與非老年組比較,△P<0.05.

2.2 宮頸癌SiHa細(xì)胞活性檢測(cè) MTT結(jié)果表明,eIF5A-1 vector組與Empty vector組比較,SiHa細(xì)胞的活性顯著升高(P<0.01);eIF5A-1 siRNA組與Negative siRNA組進(jìn)行比較,宮頸癌細(xì)胞活性顯著下降(P<0.05)。見圖1。

2.3 宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖的檢測(cè)3H-TdR數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染eIF5A-1 vector組與Empty vector組比較,增殖細(xì)胞數(shù)量明顯增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);轉(zhuǎn)染eIF5A-1 siRNA質(zhì)粒組與Negative siRNA組進(jìn)行比較,增殖宮頸癌細(xì)胞數(shù)量顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

3 討論

高危型HPV 16持續(xù)性感染是宮頸上皮鱗狀細(xì)胞永生化的重要致病因素,持續(xù)性感染導(dǎo)致E6癌基因的表達(dá)對(duì)于宮頸癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展尤為重要[3]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示,HPV 16 E6基因是通過誘發(fā)腫瘤抑制蛋白p53的降解,從而引發(fā)宮頸癌的發(fā)生[4]。截至目前, HPV 16 E6引發(fā)宮頸癌發(fā)生的機(jī)制眾多,本研究為了探尋HPV 16 E6的下游作用靶標(biāo),首先分析了宮頸癌組織及癌旁正常組織中eIF5A-1基因的表達(dá),旨在探索HPV 16 E6基因發(fā)生過程中,與eIF5A-1基因的潛在關(guān)系。免疫印跡結(jié)果顯示,eIF5A-1蛋白的表達(dá)在宮頸癌組織中顯著高于其對(duì)應(yīng)的癌旁組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。其中老年組eIF5A-1蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)高于非老年組。因此,本研究推斷在宮頸癌細(xì)胞腫瘤轉(zhuǎn)化和永生化過程中,eIF5A-1基因是誘發(fā)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的重要下游因子。

注：與Plain medium組比較, *P<0.05; 與Negative siRNA組比較,▲P<0.05; 與Empty vector組比較,△P<0.01圖1SiHa細(xì)胞的活性檢測(cè)

注：與Plain medium組比較, *P<0.05,**P<0.01; 與Negative siRNA組比較,▲P<0.05; 與Empty vector組比較,△△P<0.01圖2SiHa細(xì)胞的增殖檢測(cè)

在癌癥發(fā)生發(fā)展中,翻譯作為基因表達(dá)途徑中的關(guān)鍵步驟常常處于失調(diào)狀態(tài)[5]。在生物體蛋白質(zhì)合成中,eIF5A基因發(fā)揮重要作用。癌癥發(fā)生過程中與eIF5A的過表達(dá)緊密相關(guān)。目前發(fā)現(xiàn)有eIF5A-1和eIF5A-2兩種異構(gòu)體,eIF5A-1主要存在于正常組織中,eIF5A-2局限于腦和睪丸[6]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示,兩種eIF5A水平增多是腫瘤衍生細(xì)胞系以及多種癌癥的特征,尤其eIF5A-1基因與細(xì)胞侵襲性，癌癥進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、增殖以及不良的臨床預(yù)后有關(guān)。本研究中,我們著重關(guān)注eIF5A-1另一個(gè)生物學(xué)特性:即其作為調(diào)節(jié)因子,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡中的潛在作用。文獻(xiàn)報(bào)道,eIF5A-1的過表達(dá)可誘發(fā)骨骼干細(xì)胞分化[7]和肝癌細(xì)胞增殖[8]。本研究結(jié)果顯示,eIF5A-1在老年人宮頸癌中的表達(dá)顯著高于非老年人,提示高表達(dá)的eIF5A-1基因可能賦予了免疫功能衰退的老年人宮頸癌更強(qiáng)的活力和侵襲能力。采用siRNA有效沉默eIF5A-1基因的表達(dá),宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)特性,如細(xì)胞的活性和增殖均呈現(xiàn)顯著降低;而過表達(dá)eIF5A-1基因,宮頸癌細(xì)胞的活性和增殖均呈現(xiàn)顯著增高。以上數(shù)據(jù)提示了eIF5A-1基因在誘發(fā)宮頸癌發(fā)生中的重要作用,以上問題的闡明為宮頸癌的防治提供了新的線索和潛在的干預(yù)靶標(biāo)。