胡江蘭，朱金芳,2，帕爾哈提·多力坤

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所，烏魯木齊 830011)

0 引 言

【研究意義】矮膜苞芹(HymenoleanananaRupr.)，又名膜苞棱子芹、天山棱子芹，俗名庫魯木提，為傘形科(Umbelliferae)棱子芹屬(Pleurospermum)高山膜苞芹亞屬(HymenoleanaDC)多年生草本植物[1，2]。主要分布于中國新疆塔什庫爾干、和田及天山地區(qū)，中亞也有分布[3，4]。矮膜苞芹富含多種對人體有益的成分，防治高血壓[5]、糖尿病[6]、冠心病、腦血栓等疾病。研究其指紋圖譜，對進(jìn)一步開發(fā)利用矮膜苞芹藥材資源有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】中藥指紋圖譜因其能夠全面直觀的反應(yīng)中藥材活性成分的種類及數(shù)量，宏觀、系統(tǒng)的反應(yīng)中藥材的內(nèi)在質(zhì)量，目前是國際公認(rèn)的控制中藥材質(zhì)量有效手段。近年來，研究發(fā)現(xiàn)矮膜苞芹含有黃酮、揮發(fā)油、甾體、強(qiáng)心苷、三萜類、皂苷、酚類、糖類、香豆素等成分[7]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】矮膜苞芹為生長在海拔4 000 m以上的珍稀藥材，目前關(guān)于矮膜苞芹研究的相關(guān)文獻(xiàn)較少，對于其指紋圖譜的研究在國內(nèi)尚未見報(bào)道。指紋圖譜的建立對藥材人工繁育、篩選優(yōu)良種質(zhì)資源、全面控制藥材質(zhì)量顯得尤為重要。目前，尚未見其指紋圖譜方面的研究報(bào)道。研究建立矮膜苞芹HPLC指紋圖譜?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用高效液相色譜法(HPLC)，通過梯度洗脫，研究10批藥材的HPLC圖，運(yùn)用2012.1A版中藥色譜指紋相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件分析相似度、SPSS19.0軟件進(jìn)行聚類分析及SIMCA14.0軟件進(jìn)行主成分(PCA)與偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA),建立矮膜苞芹的HPLC指紋圖譜，為矮膜苞芹藥材的全面質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 材料

木犀草素(批號(hào)：130610，購于上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，純度≥98%)、黃芩苷(批號(hào)：21967，購于成都曼斯特生物科技有限公司，純度≥ 98%)，乙腈為色譜純，甲酸、甲醇均為分析純，水為純凈水。矮膜苞芹(采自新疆塔什庫爾干塔吉克自治縣)經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院盛萍教授鑒定為傘形科植物矮膜苞芹的干燥地上部分。10批藥材均為生長在高原高寒干旱-半干旱氣候的塔什庫爾干野生品種，采集時(shí)間分別為S1(20150922)，S2(20160730)，S3(20170325)，S4(20170622)，S5(20171110)，S6(20180312)，S7(20180405)，S8(20180512)，S9(20180809)，S10(20180824)，其中S3(20170325)和S4(20170622)采自慕士塔格峰，海拔為6 000 m，其他批次均采自塔什庫爾干塔吉克自治縣，海拔為4 500 m。

1.1.2 儀器

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)；AL 104型精密電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；TG16-W微量高速離心機(jī)；HH-S型電熱恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠)。

1.1.3 色譜條件

采用WondaCract ODS-2 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相乙腈(A): 0.1%甲酸水(B)梯度洗脫(0～30 min，15%～30% A；30～45 min，30%～70% A；45～55 min，70% A；55～65 min，70%～15% A)；流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長283 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.2 方 法

1.2.1 供試品溶液制備

取矮膜苞芹藥材粉末約1 g，精密稱定，加入20 mL甲醇稱定重量，于70℃加熱回流2 h，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.2 對照品溶液制備

分別精密稱取各對照品適量，分別置于不同的5 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，作為對照品貯備液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 精密度試驗(yàn)

取S1藥材粉末，按1.2.1方法制備供試品溶液，在其色譜條件下連續(xù)測定6次，共有峰相對保留時(shí)間RSD<0.5%，相對峰面積RSD<1.8%，儀器精密度良好。

1.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取S1藥材粉末，按1.2.1方法制備供試品溶液，分別在溶液制備后的0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定。共有峰相對保留時(shí)間RSD< 0.9%，相對峰面積RSD< 2.0%，供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取S1藥材粉末6份，分別按1.2.1方法制備供試品溶液，在其色譜條件下分別進(jìn)樣分析。共有峰相對保留時(shí)間RSD< 1.0%，相對峰面積RSD< 1.8% ，該方法重復(fù)性好。

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)》(2012.1A)分析和繪制HPLC指紋圖譜，運(yùn)用SPSS19.0和SIMCA14.0進(jìn)行聚類分析、主成分分析和偏最小二乘法-判別分析指紋圖譜相關(guān)數(shù)據(jù)。

圖1 10批矮膜苞芹藥材的HPLC指紋譜
Fig.1 HPLC fingerprint of 10 batches ofHymenoleananana

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜采集

取10批矮膜苞芹藥材，分別按1.2.1方法制備供試品溶液，按1.1.3色譜條件進(jìn)樣檢測，得到各批次矮膜苞芹藥材的HPLC圖譜，以新采集的藥材(S10)的指紋圖譜為參照圖譜，采用平均數(shù)相關(guān)系數(shù)法對各指紋圖譜色譜峰進(jìn)行多點(diǎn)校正和自動(dòng)匹配，生成對照指紋圖譜R，并建立10批矮膜苞芹藥材的指紋圖譜。圖1

2.2 共有峰標(biāo)定

根據(jù)10批藥材指紋圖譜的檢測結(jié)果，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)的數(shù)據(jù)匹配功能，在對照指紋圖譜上標(biāo)定出共有色譜峰13個(gè)。經(jīng)與對照品比對，確定5號(hào)峰和7號(hào)峰分別為黃芩苷和木犀草素。其中2號(hào)峰最高，且對稱性和分離度均較好，故選擇其作為參照峰(S)，分別計(jì)算其他共有色譜峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。表1 ,表2

注：5.黃芩苷；7.木犀草素

Note: 5.Baicalin; 7.Luteolin

圖2 矮膜苞芹藥材對照特征譜(A)及混合對照品的特征譜(B)
Fig.2 Control characteristic chromatogram ofHymenoleananana(A) and characteristic chromatogram of mixed reference (B)表1 10批矮膜苞芹指紋圖譜共有峰相對保留時(shí)間
Table 1 10 batches ofHymenoleanananafingerprint shared peak relative retention time

樣品編號(hào)Sample number峰1Peak 1峰3Peak 3峰4Peak4峰5Peak 5峰6Peak6峰7Peak7峰8Peak 8峰9Peak 9峰10Peak 10峰11Peak 12峰12Peak 12峰13Peak 13S10.4071.1851.2851.4651.8401.8622.1532.3302.3992.4252.4692.526S20.4081.1851.2821.4671.8351.8532.1452.3202.3892.4152.4592.515S30.4081.1851.2841.4681.8371.8572.1482.3242.3932.4192.4642.520S40.4061.1861.2831.4691.8381.8562.1482.3232.3922.4182.4622.519S50.4091.1871.2841.4671.8371.8542.1472.3232.3922.4182.4622.519S60.4061.1841.2821.4651.8361.8562.1462.3222.3912.4172.4612.518S70.4061.1831.2821.4651.8371.8592.1492.3262.3942.4202.4652.521S80.4051.1831.2831.4651.8381.8592.1502.3262.3952.4212.4652.522S90.4061.1871.2861.4731.8431.8652.1562.3342.4022.4292.4732.529S100.4101.1881.2841.4721.8401.8582.1502.3262.3952.4212.4662.522

注：2號(hào)峰(S)均為1.000，表3同

Note: Peak 2 (S) is 1.000, the same as Table 3

表2 10批矮膜苞芹指紋圖譜共有峰相對峰面積
Table 2 The relative peak area of the common peaks of 10 batches ofHymenoleananana

樣品編號(hào)Sample number峰1Peak 1峰3Peak 3峰4Peak4峰5Peak 5峰6Peak6峰7Peak7峰8Peak 8峰9Peak 9峰10Peak 10峰11Peak 12峰12Peak 12峰13Peak 13S10.2290.1780.3690.0110.3660.0030.0860.0610.0170.0360.0270.080S20.2250.1910.3950.0220.1530.0170.1070.0720.0160.0400.0250.093S30.3230.1840.4030.0200.3230.0030.0770.0540.0140.0320.0240.071S40.1780.1650.1920.0200.4410.0050.2340.1530.0330.0960.0450.304S50.1990.1590.2710.0220.4110.0030.1230.0860.0260.0610.0370.134S60.2460.1680.4150.0250.2300.0440.4940.3500.0780.2250.0610.665S70.1980.1140.3430.0400.4400.0630.5510.3350.0560.1890.0690.802S80.1140.1190.2340.0480.5300.0540.6940.4170.0850.2490.0931.051S90.8370.2950.4670.0130.0270.0030.1500.1340.0480.2550.0160.237S100.8250.3030.4380.0170.0220.0020.1380.1180.0460.2300.0150.205

2.3 相似度評價(jià)

研究表明，相似度分析結(jié)果大致可以分為三類，第1類為S8，其相似度< 0.8；第2類為S6、S7，其相似度在0.8 ～ 0.9；第3類為S1、S2、S3、S4、S5、S9、S10，其相似度均>0.9。相似度結(jié)果表明,10批矮膜苞芹藥材成分相似度較高，但S8的相似度較差。不同批次矮膜苞芹所含化學(xué)成分存在不同程度的差異，綜合指紋圖譜中各批次藥材主要峰群，其峰形基本一致，只是成分含量略有不同。各批藥材間相似度差異可能受采收時(shí)間、海拔、樣品本身差異等多種因素影響。表3

表3 10批矮膜苞芹相似度評價(jià)
Table 3 Evaluation of similarity of 10 batches ofHymenoleananana

樣品編號(hào)Sample numberS1S2S3S4S5S6S7S8S9S10RS110.9980.9970.9240.9790.790.7670.6960.8650.8660.965S20.99810.9930.9330.9850.7920.7710.7060.8390.8410.955S30.9970.99310.9160.9730.7830.7580.6830.870.8770.965S40.9240.9330.91610.9650.8650.8830.8490.7950.7960.934S50.9790.9850.9730.96510.8090.8060.7550.8220.8280.953S60.790.7920.7830.8650.80910.9750.9480.7490.740.857S70.7670.7710.7580.8830.8060.97510.9770.6920.6820.828S80.6960.7060.6830.8490.7550.9480.97710.6270.6160.769S90.8650.8390.870.7950.8220.7490.6920.62710.9910.948S100.8660.8410.8770.7960.8280.740.6820.6160.99110.949R0.9650.9550.9650.9340.9530.8570.8280.7690.9480.9491

2.4 藥材指紋圖譜聚類

研究表明，10批樣品在距離25時(shí)被聚為1類。距離20 ～ 5時(shí)，聚為2類，其中S9、S10與其他批次分隔開，表明這兩個(gè)批次差異性較大。距離5 ～ 0時(shí)，藥材被依次分開。最終聚為3類，即S1、S2、S3、S4、S5聚為一類，S6、S7、S8聚為一類，S9、S10聚為一類。從藥材來源分析，S1、S2、S3、S4和S5采集時(shí)間最早，儲(chǔ)存時(shí)間最長；S9、S10為最近采集，儲(chǔ)存時(shí)間最短；而S6、S7、S8采集時(shí)間較早，儲(chǔ)存時(shí)間相對較長，矮膜苞芹藥材質(zhì)量可能受采收時(shí)間、儲(chǔ)存條件等影響，需進(jìn)一步研究。圖3

圖3 10批矮膜苞芹藥材聚類分析樹狀圖
Fig.3 10 batch ofHymenoleanananasquid cluster analysis tree diagram relationship

2.5 藥材指紋圖譜PCA及PLS-DA分析

研究表明，前2個(gè)主成分的特征值均大于1，說明前2個(gè)因子在藥材共有成分的相互關(guān)系中起主導(dǎo)作用。其中，第一主成分方差貢獻(xiàn)率為 64.95%；第二主成分方差貢獻(xiàn)率為17.28%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為82.23%。表明前2個(gè)主成分能夠客觀得反映10批矮膜苞芹指紋圖譜的信息，PCA得分分布。表明S9和S10與其他批次明顯區(qū)分，但其他批次間無明顯區(qū)分。PLS-DA模型的主成分回歸系數(shù)Q2Y=0.598>0.5，說明模型的預(yù)測能力較強(qiáng)；R2Y=0.851 9，即模型對因變量變異貢獻(xiàn)的百分比為85.19%，說明模型擬合度較好。PLS-DA分析結(jié)果，表明10批藥材被明顯區(qū)分為三類，即S1、S2、S3、S4、S5為一類，S6、S7、S8為一類，S9、S10為一類，與藥材聚類分析結(jié)果吻合。圖4,圖5

圖4 PCA得分分布
Fig.4 Score plot of PCA

圖5 PLS-DA得分分布
Fig.5 Score plot of PLS-DA

提取PLS-DA模型中13個(gè)變量的重要性投影(VIP)值，研究表明,對13個(gè)共有峰面積VIP值大小進(jìn)行排列，VIP值越大說明該共有峰對分類的貢獻(xiàn)越大[8]。選擇VIP值大于1的共有峰，結(jié)果顯示，峰2(VIP值：1.829)，峰1(VIP值：1.487)，峰13(VIP值：1.308)，峰6(VIP值：1.194)和峰4(VIP值：1.111)VIP值均大于1，說明以上化學(xué)成分對不同批次矮膜苞芹藥材分類具有顯著影響，這些成分是引起不同批次藥材差異的主要標(biāo)志性成分。其余色譜峰VIP值小于1，對樣品的區(qū)分影響較小。圖6

圖6 各共有峰對藥材分組VIP值
Fig.6 VIP value of each common peak grouped with herbs

3 討 論

3.1 色譜條件選擇

由于矮膜苞芹藥材成分較為復(fù)雜，研究了甲醇-0.05%甲酸水、乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水等溶劑系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫[9-11]，篩選最佳流動(dòng)相；并對進(jìn)樣量5、10、20 μL進(jìn)行了考察；應(yīng)用二極管陣列檢測器同時(shí)比較了254、283、340、350 nm不同波長下的色譜圖信息[12-14]，結(jié)果表明，以乙腈:0.1%甲酸水為流動(dòng)相梯度洗脫，進(jìn)樣量為10 μL，在283 nm波長下，色譜圖的色譜峰較多，分離度較好，各色譜峰對稱性及拖尾因子均符合要求。

3.2 建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其指紋圖譜

建立的矮膜苞芹HPLC指紋圖譜方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好。將指紋圖譜數(shù)據(jù)與相似度評價(jià)、聚類分析及主成分分析相結(jié)合，結(jié)果表明不同批次的矮膜苞芹HPLC指紋圖譜既有共性又有差異。各批次藥材的色譜峰整體圖譜相似，但峰面積又有所差異，表明不同因素對藥材成分的含量有影響。研究表明，中藥材主要活性成分含量測定，因其地域、品系、采樣時(shí)期、加工方式、貯存時(shí)間等因素均會(huì)對試驗(yàn)結(jié)果有影響[15]。因此，各批次色譜峰峰面積有所差異分析可能原因是因氣候、海拔、采收時(shí)間、儲(chǔ)存時(shí)間、樣品本身差異、采收方式等不同所導(dǎo)致。

4 結(jié) 論

建立了矮膜苞芹藥材的HPLC指紋圖譜，確定了13個(gè)共有峰。通過精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)證明，該方法符合建立指紋圖譜各項(xiàng)要求。運(yùn)用相似度評價(jià)對建立的指紋圖譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同批次藥材質(zhì)量相似性較好，采用聚類分析、主成分分析及偏最小二乘法-判別分析彌補(bǔ)了單純應(yīng)用相似度評價(jià)指紋圖譜的不足，能夠反映藥材多成分的特點(diǎn)，整體控制矮膜苞芹藥材的質(zhì)量。