朱雪峰，田文剛，熊顯鵬，薛 飛，張 莉，朱華國

(石河子大學/新疆生產建設兵團綠洲生態(tài)農業(yè)重點實驗室，新疆石河子832003)

0 引 言

【研究意義】隨著我國科技的進步，棉花種植技術日益成熟，我國目前已經進入棉花高產國行列[1]。雖然我國棉花產業(yè)發(fā)展迅速，但是仍有許多問題亟待解決[2]。如干旱與鹽漬化是我國農業(yè)生產主要的非生物脅迫因素，影響棉花產量與棉纖維質量，造成棉紡織業(yè)成本上升[3-4]。培育抗鹽堿能力強的棉花新種質成為育種新目標，而培育出這些新種質需要以棉花生物學作為理論基礎,以棉花功能基因組學來解析調控農藝性狀的基因網絡[5]。近年來發(fā)展迅速的基因編輯技術為挖掘與檢驗調控棉花農藝性狀的關鍵基因提供了新的思路，而且為創(chuàng)建新的棉花種植資源提供了新的手段[6]。研究多胺氧化酶基因對提高棉花抗逆能力有一定的理論和實踐意義。而CRISPR/Cas9技術的出現及發(fā)展，為研究多胺氧化酶基因提供了便捷、可靠的手段?！厩叭搜芯窟M展】基因編輯技術可以改變基因組序列，定點編輯目標基因，是人們驗證特定基因功能的一種手段[7]。CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-as-sociated protein)系統(tǒng)是一種新興起的基因定點編輯技術，它是基于細菌獲得性免疫系統(tǒng)原理改造而成的一種全新的人工核酸酶系統(tǒng)，因其操作簡單，編輯效率高，已被廣泛應用于包括植物在內的多種生物中[8]。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)的原理是Cas9蛋白可以在由crRNA與 tracrRNA 形成的sgRNA 的引導下，切割靶標基因，形成DSBs (double-stranded DNA breaks)，通過生物體內的NHEJ (non-homologous end joining)修復機制引起基因突變[9-10]。CRISPR/Cas9 基因組編輯技術體系中 U6 或 U3 啟動子是驅動sgRNA 轉錄的重要元件,最近利用擬南芥U6啟動子在棉花(GossypiumhirsutumLinn, 陸地棉)中已成功建立了高效CRISPR/Cas9 基因組編輯技術體系[11-13]。多胺氧化酶(Polyamine oxidase,PAO)是指催化腐胺、亞精胺和精胺等多胺類物質氧化降解的酶類。在研究模式植物擬南芥(Arabidopsis,thaliana) PAO基因的功能及其調控途徑的過程中發(fā)現，其有5個PAO同源基因[14]，控制擬南芥的多胺代謝。在金盞花中，外源添加亞精胺可以調節(jié)過氧化物酶活性與脯氨酸含量，外源添加精胺可以增強金盞花過氧化氫酶活性，提高抗鹽能力[15]。精胺含量的上升能有效提高三葉草的抗旱能力[16]。添加外源亞精胺可以增強玉米對干旱脅迫的耐受性[17]。前期研究中發(fā)現，在擬南芥中過表達GhPAO3基因可以降低擬南芥體內的精胺含量，從而提高擬南芥的抗鹽能力[18]?！颈狙芯壳腥朦c】所使用的表達載體為pRGEB32-7載體，可以串聯(lián)多個tRNA+靶標+gRNA，從而提高突變效率，植物自身的RNase P和RNase Z可以分別切割tRNA的5’端和3’端，可以將多個靶標的gRNA釋放，與目標序列互補后， Cas9/ gRNA會在PAM前3 bp左右的位置精確切割靶DNA雙鏈。通過CRISPR系統(tǒng)將靶標切斷后，生物會啟動自身修復機制，在修復后產生突變，導致目標基因功能沉默。研究多胺氧化酶基因,提高棉花抗逆能力?！緮M解決的關鍵問題】以棉花為材料，篩選合適靶點設計引物，經三次重疊延伸PCR與一次酶切連接后，構建敲除GhPAO3基因的CRISPR/Cas9的載體。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株與質粒

使用的CRISPR/Cas9植物基因敲除載體是pRGEB32-7(來自于華中農業(yè)大學金雙俠課題組)，所用菌株為大腸桿菌E.coliDH5α，農桿菌菌株LBA4404。

1.1.2 主要酶及試劑

Ex-Taq酶(TaKaRa 公司)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(北京全式金公司)、BsaⅠ(New England Biolabs公司)、Exnase Ⅱ(南京諾唯贊公司)。

1.2 方 法

1.2.1GhPAO3 基因敲除靶位引物序列設計

GhPAO3基因靶標選擇參考了CRISPR-P網站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR)，通過上傳GhPAO3基因外顯子序列，搜索并選擇分數較高的序列。選出的序列進行Blast，確定具有特異性的序列，則選擇由該靶點設計得到的引物。

1.2.2 小片段的擴增與連接

設計好的引物送公司合成(北京六合華大公司)，純化級別為PAGE。通過兩次PCR得到兩個靶點的小片段，由于引物的5’端加入了接頭，PCR產物中將會帶有接頭的互補序列，通過第三次PCR可以將兩個小片段連接起來。PCR擴增體系為20 μL體系，反應條件：95℃,4 min；95 ℃，30s；55℃，30s；72℃，20s，3個循環(huán)；95℃，30s；60℃，30s；72℃，20s，27個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。通過在引物的5’端加入接頭，使PCR產物帶有互補序列的接頭，通過第三次PCR使兩個獨立的PCR產物借助接頭經Taq酶延伸成為融合片段。圖1,表1

圖1 重疊延伸
Fig.1 Overlapping extension
表1 第一、二次PCR體系
Table 1 First and second PCR system

20 μL體系20 μLsystem第一次PCR (μL) 第二次PCR The first PCR (μL) The second PCR (μL)ddH2OBufferdNTPSprimerASprimerEx Taq模板16.1 220.3pRGEB32-7s 0.2 GhPAO3-1as 0.2 pGTR4質粒16.10.20.3GhPAO3-2s 0.2 GhPAO3-2as 0.21pGTR4質粒1

注：pGTR4質粒為中間載體質粒，來自華中農業(yè)大學金雙俠教授課題組

Note: pGTR4 plasmid is an intermediate vector plasmid from Professor Jin Shuangxia of Huazhong Agricultural University

1.2.3 載體酶切與連接

取pRGEB32-7載體，使用限制性核酸內切酶BsaⅠ進行單酶切。100 μL酶切體系，其中pRGEB32-7載體15 μL，10x cut smart Buffer 10 μL，BsaⅠ 酶4 μL，ddH2O補足至100 μL。37℃酶切5.5 h，可以適當延長酶切時間，使反應更充分。連接載體使用一步法，其中目的片段100 ng，線性化表達載體100 ng，Exnase Ⅱ 酶1 μL，CE Buffer 2 μL。37℃水浴30 min，冰浴5 min。連接產物可以-20℃長期保存。

2 結果與分析

2.1 靶點選擇與引物合成

根據 CRISPR/Cas9 技術原理，在GhPAO3基因的外顯子上，根據CRISPR-P網站給出的序列，選擇一段20 bp的序列(5′-TATAATCGAATACCTCGCGT-3′)作為靶點。該序列3′端PAM序列為CGG，Cas9蛋白將在其上游3 bp左右精確切割靶DNA雙鏈。根據該靶點得到相應引物，并在引物后添加接頭，方便后續(xù)連接實驗。表2

表2 PCR相關引物
Table 2 PCR related primers

引物名稱Primer name引物序列Primer sequenceGhPAO3-1asGhPAO3-1sGhPAO3-2asInfPAO3aspRGEB32-7sInfpRGEB32-7sU6-7sTATCGACACTTAAGAACtgcaccagccgggaa (靶標1互補序列)GTTCTTAAAAAGTGTCGATAgtttagagctagaaata (靶標1序列)ACGCGAGGTAT TCGATTATAtgcacagcggaat (靶標2互補序列)ttctagctctaaaCACGCGAGGTATTCGATTATA (靶標2互補序列)CAGCACATAACTGGCAAACAAAGCACCAGTGGTCTAGCAGCACATAACTGGCAAACAAATGTGCCACTCCAAAGACATCAG

注：小寫部分為載體固定序列，引物pRGEB32-7s、U6-7s與InfpRGEB32-7s為載體通用引物

Note：The lower case is the vector-fixed sequence, and the primers pRGEB32-7s, U6-7s and Inf pRGEB32-7s are the universal primers for the vector

2.2 靶位點片段的驗證

以中間載體pGTR4質粒為模板，分別以pRGEB32-7 s 、GhPAO3-1 as 和GhPAO3-2s 、GhPAO3-2 as為引物，進行第一、二次PCR。PCR產物進行電泳檢測，兩次PCR條帶大小分別約為150 bp與200 bp(圖2A)。以前兩次PCR產物為模板， InfpRGEB32-7 s與InfGhPAO3 as為上下游引物進行第三次PCR，連接兩個小片段。PCR條件為：95℃，4 min；95℃，30 s；59℃，30 s；72℃，20 s，27個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。PCR產物進行電泳檢測，條帶大小約為400 bp(圖2B)。圖2

圖2 A圖是第一與第二次PCR產物電泳圖，條帶大小分別為100 bp與250 bpB圖是第三次PCR產物電泳圖，條帶大小約為400 bp
Fig.2 Figure A is the first and second PCR product electropherogram, the size of stripe is 100 bp and 250 bp respectively.Figure B is the third PCR product electropherogram,the size of stripe is about 400 bp

2.3 酶切驗證與感受態(tài)的轉化

酶切產物進行電泳檢測，得到線性pRGEB32-7載體條帶，大小約為16 kb(圖3A)。將得到的條帶進行膠回收，回收產物測濃度后用于載體連接。

取2～5 μL連接產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞，重組后的pRGEB32-7載體帶有卡那抗性，挑取4～5個單克隆，用于PCR陽性檢測并送菌液測序。PCR陽性檢測使用引物為通用引物U6-7s與InfPAO3as(圖3B)。送PCR驗證正確的菌液去測序，測序結果正確。圖3

圖3 A圖為載體酶切電泳結果；B圖為陽性菌液鑒定電泳
Fig.3 Figure A shows the results of vector digestion electrophoresis；Figure B is the positive bacterial solution identification electrophoresis results

2.4 農桿菌轉化

對含有測序正確的pRGEB32-7載體的菌液提質粒，采用電擊轉化法轉化農桿菌LBA4404感受態(tài)，菌液PCR驗證陽性后甘油保存于-80℃，用于后續(xù)棉花轉化培養(yǎng)實驗。

3 討 論

所用的Cas9中間載體為pGTR4載體， tRNA + gRNA組合序列已經被插入pGTR4載體中，兩個小片段可以從該載體中擴增出來，兩個小片段連接在一起可以構成完整的tRNA+靶標+gRNA。因為在合成引物時添加了接頭序列，在連接的過程中更為便捷，從而整體簡化了操作過程。與新疆農業(yè)大學農業(yè)生物技術重點實驗室的pCAMBⅠA1300載體相比較[19]，操作更為簡單，只需要三次PCR與一次酶切連接便可構建出敲除目標基因的Cas9表達載體。

目前，以基因編輯為基礎的反向遺傳學技術是基因改造與研究的手段之一[20]?；蚪M編輯通過特異性結構識別目標基因，改造基因DNA來改變基因組中的特定基因，從而定點修復致病基因[21]或定點插入一個基因或DNA元件[22]，也可以定點編輯正?；?，對正?；蜻M行敲除、結構修飾，利用該技術研究單一基因在體內的功能。目前常用的基因編輯技術有鋅指核酸酶(zinc-finger nucleases，簡稱ZFN)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease, TALEN)和CRISPR/Cas9。與其他兩種技術相比，CRISPR/Cas9技術有著脫靶率相對較低，編輯效率高的優(yōu)點。棉花中一直存在基因組較大，轉化比較困難等問題，所以在基因編輯方面進展緩慢，只有CRISPR/Cas9技術在棉花中有報道。

在研究棉花基因功能中，常用的基因沉默方法有病毒介導的棉花基因沉默體系(virus-induced gene silencing,VIGS)、RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術與基因編輯技術。VIGS技術屬于轉錄后的基因沉默，能使靶標基因在mRNA水平上顯著降低，從而降低靶標基因的表達量。RNAi技術是RNA水平的沉默，可以使靶標基因產生的mRNA降解，從而使靶標基因表達量下調。與VIGS和RNAi技術相比較， CRISPR/Cas9技術是基因組水平上的敲除，具有編輯效率高，沉默準確性高，能穩(wěn)定遺傳的特點。

構建棉花GhPAO3基因的Cas9表達載體具有較大研究價值。研究系統(tǒng)介紹了定向構建一個編輯棉花多胺氧化相關基因GhPAO3的CRISPR/Cas9載體的方法，為研究GhPAO3基因奠定基礎，同時為研究CRISPR/Cas9載體構建提供參考。

4 結 論

中間載體為pGTR4，表達載體為pRGEB32-7，篩選標記是卡那霉素篩選標記。在GhPAO3基因序列中選出合適的靶標，設計引物。通過三次重疊延伸PCR，構建出tRNA+靶標+gRNA的序列，使用限制性核酸內切酶BsaⅠ 對表達載體pRGEB32-7進行一次單酶切，采用一步法將構建出的tRNA+靶標+gRNA序列連接在線性化的表達載體pRGEB32-7上，將靶基因的靶點序列插入載體中，構建出敲除棉花GhPAO3基因的Cas9表達載體。