賈永義 鄭建波 顧志敏 陳立僑 羅 琛 遲美麗 劉士力蔣文枰 程 順

(1. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 上海 200241; 2. 浙江省淡水水產(chǎn)研究所, 湖州 313001;3. 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 杭州 310058)

Sox基因是編碼一類具有高度保守HMG盒(High mobility group)序列特征的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[1],伴隨著物種多倍化進(jìn)程中導(dǎo)致的基因組復(fù)制和分裂結(jié)果, 目前已克隆到該家族30多個(gè)成員[2]。Sox家族成員在早期胚胎至成體的各個(gè)發(fā)育階段都發(fā)揮著重要作用, 如參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、器官再生、細(xì)胞命運(yùn)決定、血細(xì)胞生成、晶狀體發(fā)育等眾多生物學(xué)過程[3,4]。其中Sox9基因作為重要的一員, 已被證明與脊椎動(dòng)物性別決定直接相關(guān), 因而受到了廣泛的關(guān)注與研究[5]。魚類有著最為復(fù)雜的性別決定類型, 這也為研究性別分化機(jī)制提供了理想的動(dòng)物模型。迄今為止, 在斑馬魚(Danio rerio)、黃鱔(Monopterus albus)、青鳉(Oryzias latipes)、鯉(Cyprinus carpio)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)等魚類品系中展開的相關(guān)研究都證實(shí)Sox9在魚類性別控制方面具有重要作用[6]。

近年來, 越來越多的研究表明表觀遺傳調(diào)控在性別決定中有著不可或缺的作用, 特別是性別相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島DNA甲基化修飾[7—9]。海鱸(Lateolabrax japonicus)中發(fā)現(xiàn)在發(fā)育早期高溫處理能使Cyp19a1a基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平增強(qiáng), 從而抑制了該基因的表達(dá), 引導(dǎo)其向雄性分化[7]。Wen等[10]在日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)中的研究證明性別相關(guān)基因dmrt1和cyp19a啟動(dòng)子CpG甲基化修飾模式與2個(gè)基因的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān), 提示表觀遺傳調(diào)控可以決定牙鲆的性腺分化。同樣的, 性別決定相關(guān)基因Sox9啟動(dòng)子或調(diào)控區(qū)域的甲基化修飾作為一種關(guān)鍵的因子可以直接影響下游基因的表達(dá), 進(jìn)而實(shí)現(xiàn)性別的決定與分化[11]。

翹嘴鲌(Culter alburnusBasilewsky)在分類上隸屬鯉科、鲌亞科、鲌屬, 近年來由于人工養(yǎng)殖和繁殖技術(shù)的不斷成熟與推廣, 現(xiàn)已成為長江三角洲地區(qū)的主要名特養(yǎng)殖品種[12]。多年的養(yǎng)殖經(jīng)驗(yàn)顯示翹嘴鲌雌魚比雄魚的個(gè)體大、生長速度快, 有著明顯的性別異形特征[13,14]。但目前我們對(duì)于翹嘴鲌的性別決定類型以及相關(guān)的調(diào)控基因都不清楚,因此探索、闡明翹嘴鲌性別決定與分化的作用機(jī)制, 發(fā)展翹嘴鲌全雌育種技術(shù), 對(duì)于提高翹嘴鲌養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。本研究首次克隆了翹嘴鲌性別相關(guān)基因Sox9的全長cDNA及近端啟動(dòng)子序列, 同時(shí)進(jìn)行了序列分析和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè); 隨后采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了該基因在成體各組織中的表達(dá)水平; 最后分析了該基因在不同性腺組織啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化的修飾狀態(tài)。這些結(jié)果為深入研究翹嘴鲌性別相關(guān)基因及性別決定機(jī)制提供線索和新的思路, 為進(jìn)一步探索翹嘴鲌Sox9基因的生物學(xué)功能研究提供重要依據(jù), 同樣也有助于發(fā)展翹嘴鲌性別控制育種和單性養(yǎng)殖技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究使用的翹嘴鲌實(shí)驗(yàn)材料取自浙江省淡水水產(chǎn)研究所八里店綜合試驗(yàn)基地。各成體組織:腦、肝、腎、脾、心臟、肌肉、眼、卵巢、精巢樣品經(jīng)液氮速凍后保存于-80℃, 直至后續(xù)RNA或基因組DNA提取。

1.2 翹嘴鲌基因組DNA、總RNA的提取及cDNA第一鏈合成

選用實(shí)驗(yàn)室改良的酚氯仿抽提法分離翹嘴鲌精巢和卵巢的基因組DNA, 按照Total RNA Extractor (Trizol)試劑盒(生工生物工程 上海)說明書步驟進(jìn)行各成體組織總RNA的提取。最后將提取的所有核酸產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)和濃度測(cè)定, 并置于冰箱用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。以提取的總RNA為模板, 在HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒(康為 北京)作用下合成cDNA的第一條鏈。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 翹嘴鲌Sox9編碼區(qū)的克隆及cDNA末端擴(kuò)增

從GenBank中下載多個(gè)已發(fā)表魚類物種Sox9基因mRNA序列并進(jìn)行比較分析, 它們都含有一段編碼HMG盒結(jié)構(gòu)域的保守區(qū)域, 隨即在該區(qū)域設(shè)計(jì)了簡并引物sox9-F和sox9-R (表1)。PCR反應(yīng)體系為50 μL, 包含10×Ex-TaqBuffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L) 4 μL、正反向引物(2.5 μmol/L)各4 μL、Ex-Taq0.5 μL及補(bǔ)足ddH2O至50 μL。擴(kuò)增條件: 94℃預(yù)變性5min; 94℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃1min, 32個(gè)循環(huán); 72℃延伸7min, 最后4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接至pMD18-T克隆載體進(jìn)行測(cè)序, 序列結(jié)果通過與同源基因比對(duì)確認(rèn)其為目的片段。隨后在已獲編碼區(qū)序列基礎(chǔ)上分別設(shè)計(jì)正反向特異性巢式引物GSPF1、GSPF2和GSPR1、GSPR2 (表1)并參照SMARTerTMRACE (Clontech Japan)試劑盒說明書進(jìn)行cDNA末端擴(kuò)增, 最終獲得Sox9a和Sox9b兩個(gè)翹嘴鲌旁系同源基因的cDNA全長, 并且提交至GenBank (登錄號(hào): MG694537和MG694536)。本部分實(shí)驗(yàn)所用試劑均購自日本TaKaRa公司, 引物合成及測(cè)序委托上海生工生物工程公司。

表1 用于翹嘴鲌Sox9基因克隆、表達(dá)分析和甲基化檢測(cè)的引物Tab. 1 Primers used for cloning, expression and methylation analysis of Sox9 in C. alburnus

1.4 氨基酸預(yù)測(cè)、比對(duì)及進(jìn)化樹分析

使用JELLYFISH軟件推測(cè)了Sox9a和Sox9b基因編碼的氨基酸序列, 隨后用DNAMAN軟件對(duì)這兩個(gè)同源基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì), 利用在線軟件Motif Scan (https://myhits.isb-sib.ch/cgibin/motif_scan)和SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行了蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。同時(shí)將預(yù)測(cè)的結(jié)果分別與其他物種進(jìn)行同源性分析, 使用MEGA 5.0軟件的Neighbor-joining方法構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 Sox9a、Sox9b在翹嘴鲌成體不同組織中的表達(dá)特征分析

利用熒光實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)的方法檢測(cè)了翹嘴鲌不同成體組織的mRNA轉(zhuǎn)錄水平, 根據(jù)克隆獲得的Sox9a和Sox9bcDNA序列分別設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量引物對(duì)RT-sox9a-F和RT-sox9a-R、RT-sox9b-F和RT-sox9b-R (表1), 并以ef-1α作為內(nèi)參基因。熒光定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)首先將各組織RNA在去基因組逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(ABM加拿大)作用下合成cDNA第一鏈, 隨后選用EvaGreen 2× qPCR MasterMix試劑盒(ABM加拿大)構(gòu)建PCR反應(yīng)體系。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)及后續(xù)信息在LightCycler 480 System (Roche瑞士)上進(jìn)行。由于定量反應(yīng)非常敏感, 我們對(duì)每個(gè)反應(yīng)設(shè)定了3個(gè)平行, 最后采用2-ΔΔCt法計(jì)算表達(dá)量并使用GraphPad Prism 5軟件獲得直方圖。

1.6 Sox9a近端啟動(dòng)子擴(kuò)增、CpG島預(yù)測(cè)及DNA甲基化修飾檢測(cè)

根據(jù)已知的Sox9amRNA序列設(shè)計(jì)了兩條特異性引物GSP-AS1、GSP-AS2, 按照GenomeWalker?Universal Kit (CloneTech, 日本)試劑盒說明書通過染色體步查法擴(kuò)增到未知的近端啟動(dòng)子區(qū)域。隨后, 我們直接將翹嘴鲌Sox9a啟動(dòng)子原始序列輸入于在線軟件MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/), 進(jìn)行序列提交命令后, 軟件預(yù)測(cè)到CpG島的所在區(qū)域以及甲基化分析引物對(duì)BSP-F和BSP-R (表1)。根據(jù)CpGenomeTMDNA Modification Kit (Chemicon, USA)說明書對(duì)翹嘴鲌性腺組織基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸氫鹽修飾處理, 隨后進(jìn)行甲基化特異性擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 翹嘴鲌Sox9基因的cDNA克隆

用sox9-F和sox9-R簡并引物通過RT-PCR方法擴(kuò)增獲得了一段長度為212 bp的核苷酸片段, 經(jīng)測(cè)序并借助NCBI網(wǎng)站中Blast功能進(jìn)行同源性分析,結(jié)果顯示其為斑馬魚、鯉等物種的同源片段, 從而確定此片段為翹嘴鲌Sox9基因的部分cDNA序列。

隨后用SMARTerTMRACE試劑盒進(jìn)行5′和3′-RACE擴(kuò)增獲得了翹嘴鲌Sox9 cDNA的完整序列。與其他魚類品系一樣, 翹嘴鲌Sox9具有2個(gè)同源基因, 分別為Sox9a、Sox9b。Sox9a全長1642 bp, 包括191 bp的5′非編碼區(qū)(5′-UTR)、1377 bp的開放閱讀框(ORF)和74 bp的3′非編碼區(qū)(3′-UTR), 編碼458個(gè)氨基酸;Sox9b全長1673 bp, 包括212 bp的5′非編碼區(qū)(5′-UTR)、1371 bp的開放閱讀框(ORF)和90 bp的3′非編碼區(qū)(3′-UTR), 編碼456個(gè)氨基酸。2個(gè)同源基因都具有進(jìn)化上高度保守的HMG盒結(jié)構(gòu)域,目前已將序列提交至GenBank (登錄號(hào): MG694537和MG694536)。

2.2 翹嘴鲌轉(zhuǎn)錄因子Sox9a和Sox9b氨基酸序列比對(duì)及蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)翹嘴鲌轉(zhuǎn)錄因子Sox9a和Sox9b的氨基酸序列進(jìn)行了比對(duì)分析, 兩者相似度達(dá)到73.95%, 但編碼HMG盒區(qū)域極其保守。利用在線軟件Motif Scan分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具對(duì)翹嘴鲌Sox9a和Sox9b的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析, 結(jié)果顯示兩者除了高度保守的HMG盒結(jié)構(gòu)域外, 分別還有2個(gè)核定位信號(hào)。利用SWISS-MODEL在線工具為Sox9的三維結(jié)構(gòu)建模, 翹嘴鲌Sox9a和Sox9b與人4euw.1.A的一致性高達(dá)98.81%, 其中Sox9a含有多個(gè)α螺旋及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu), 在約90—170個(gè)氨基酸處形成空穴, 與預(yù)測(cè)的二級(jí)保守結(jié)構(gòu)域HMG-box有重疊, 推測(cè)該部位為其活性部位。Sox9b同樣含有多個(gè)螺旋結(jié)構(gòu), 同時(shí)在90—180個(gè)氨基酸處出現(xiàn)更大的彎曲, 空穴則壓縮得更小, 使其三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)餅鐺狀, 推測(cè)其與Sox9b功能趨異有關(guān)。

2.3 不同物種Sox9基因氨基酸序列聚類分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載了不同脊椎動(dòng)物已發(fā)表的Sox9蛋白編碼序列, 利用MEGA 5.0軟件的鄰接法(Neighbor-joining)對(duì)翹嘴鲌Sox9a、Sox9b氨基酸序列與其他物種的Sox9氨基酸序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1)。在分子系統(tǒng)樹中, 所有魚類聚為一支, 與其他較高等脊椎動(dòng)物關(guān)系較遠(yuǎn)(除了非洲爪蟾)。其中翹嘴鲌Sox9a與羅非魚Sox9a發(fā)生聚類,較其他物種具有最接近的親緣關(guān)系, 而翹嘴鲌Sox9b形成單獨(dú)的一支?？傮w而言, 該基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與其所在物種的進(jìn)化地位仍保持一致。

2.4 翹嘴鲌Sox9a和Sox9b在各個(gè)組織中的差異表達(dá)

運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)2個(gè)同源基因Sox9a和Sox9b的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè), 結(jié)果顯示兩者在翹嘴鲌不同組織中的表達(dá)豐度具有明顯的組織差異性和特異性。Sox9a在腦和精巢中表達(dá)量最高, 其次是肌肉、鰭條、眼睛和卵巢, 在腎臟、脾臟、肝臟中相對(duì)較低;Sox9b只在腦、鰭條、眼睛和精巢中檢測(cè)到一定水平的表達(dá), 其余組織中幾乎不表達(dá)(圖2)。

2.5 翹嘴鲌Sox9a啟動(dòng)子區(qū)域CpG島甲基化分析

實(shí)時(shí)定量分析結(jié)果顯示翹嘴鲌雄性特異性基因Sox9a在精巢組織中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于卵巢組織,為了解這類兩性特異性差異表達(dá)的潛在機(jī)制, 我們檢測(cè)了精巢和卵巢中Sox9a基因差異表達(dá)是否涉及DNA甲基化水平的差異修飾。通過染色體步查法獲得的部分啟動(dòng)子序列提交至在線工具M(jìn)ethPrimer進(jìn)行CpG島預(yù)測(cè), 結(jié)果表明近端啟動(dòng)子附近存在符合標(biāo)準(zhǔn)的CpG島, 包含9個(gè)CG二核苷酸位點(diǎn)(圖3A)。隨即我們通過重亞硫酸氫鹽DNA測(cè)序方法分析了翹嘴鲌性腺組織Sox9a啟動(dòng)子CpG島甲基化修飾模式, 結(jié)果顯示在精巢中CG位點(diǎn)幾乎不發(fā)生甲基化, 然而卵巢中高度甲基化(圖3B)。這個(gè)結(jié)果表明Sox9a在性腺組織中的表達(dá)豐度與DNA甲基化修飾程度正好呈負(fù)相關(guān), 提示在翹嘴鲌性腺發(fā)育過程中性別相關(guān)基因啟動(dòng)子CpG島差異甲基化修飾涉及下游基因的異形表達(dá)。

圖1 采用Neighbor Joining方法構(gòu)建的不同物種Sox9蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree of Sox9 protein generated with Neighbor Joining method

圖2 Sox9基因在翹嘴鲌成魚組織中的表達(dá)分析Fig. 2 The relative expression of Sox9 in the various tissues of C.alburnus

圖3 翹嘴鲌Sox9a基因啟動(dòng)子CpG島甲基化分析Fig. 3 Promoter CpG island methylation analysis of Sox9a in C.alburnus

3 討論

3.1 翹嘴鲌Sox9基因序列克隆及特征分析

為了解Sox9基因在翹嘴鲌性腺分化中的作用,本研究利用RT-PCR、RACE及染色體步查等分子克隆方法獲得了翹嘴鲌Sox9基因全長和近端啟動(dòng)子序列。不同于高等哺乳動(dòng)物, 低等脊椎動(dòng)物在進(jìn)化過程會(huì)產(chǎn)生基因加倍現(xiàn)象, 類似于其他魚類品系,翹嘴鲌Sox9也存在2個(gè)旁系同源基因:Sox9a和Sox9b, 但其中涉及的分子機(jī)制較為復(fù)雜[15]。氨基酸序列分析表明Sox9a和Sox9b有著Sox家族蛋白都存在的高度保守HMG盒結(jié)構(gòu)域, 然而兩者的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示出一定程度上的不一致性, 提示其在功能作用中的差異。根據(jù)氨基酸序列進(jìn)行同源性分析表明翹嘴鲌Sox9a與羅非魚Sox9a發(fā)生聚類, 較其他物種具有最接近的親緣關(guān)系, 而翹嘴鲌Sox9b形成單獨(dú)的一支, 但總體而言該基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系與其所在物種的進(jìn)化地位仍保持一致, 意味著Sox9基因在功能上的保守性。因此, 在魚類中克隆并深入研究Sox9基因, 對(duì)于揭示脊椎動(dòng)物Sox基因的進(jìn)化歷程以及研究其性別決定機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義。

3.2 翹嘴鲌Sox9a和Sox9b基因的表達(dá)特征

為了揭示Sox9a和Sox9b基因在翹嘴鲌各成體組織中的表達(dá)情況, 本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)對(duì)這2個(gè)同源基因的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果顯示Sox9a在腦和精巢中表達(dá)量最高, 其次是肌肉、鰭條、眼睛和卵巢, 在腎臟、脾臟、肝臟中相對(duì)較低, 這與Sox9基因在金錢魚[16]、虹鱒[17]、西伯利亞鱘(Acipenser baeri)[18]等物種中的表達(dá)情況相似。翹嘴鲌Sox9a基因的表達(dá)模式表明其主要功能體現(xiàn)于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和雄性性別分化, 同時(shí)在其他組織中也有不同程度的表達(dá), 顯示其功能的廣泛性。基因組研究發(fā)現(xiàn)在魚類等低等脊椎動(dòng)物中, 基因復(fù)制后的重復(fù)基因有著不同的命運(yùn), 主要包括選擇性丟失或協(xié)同進(jìn)化產(chǎn)生新的功能, 而Sox9b只在腦、鰭條、眼睛和精巢中檢測(cè)到一定水平的表達(dá),這個(gè)結(jié)果說明該基因明顯面臨功能上的丟失。

3.3 DNA甲基化在翹嘴鲌性腺分化過程中的作用

魚類性別決定方式最為復(fù)雜, 其主要由內(nèi)在的基因調(diào)控, 但同時(shí)又會(huì)受到其他非遺傳因子的影響。近年來, 關(guān)于表觀遺傳修飾對(duì)于魚類性別決定調(diào)控的研究越來越多, 特別是靶基因啟動(dòng)子或調(diào)控區(qū)域的CpG島甲基化作用。DNA甲基化修飾能改變基因表達(dá)活性, 并且在細(xì)胞分裂后, 以半保留復(fù)制的方式將這種修飾式樣傳遞到子細(xì)胞[19], 因此深入研究表觀遺傳機(jī)制在魚類性別決定中的作用具有十分重要的意義。本研究通過分析翹嘴鲌近端啟動(dòng)子區(qū)域鑒定到一個(gè)CpG島, 對(duì)不同性腺組織的甲基化檢測(cè)表明翹嘴鲌精巢和卵巢確實(shí)存在差異的修飾式樣, 且正好與基因的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。這個(gè)結(jié)果初步表明翹嘴鲌很可能通過DNA甲基化修飾依賴型機(jī)制調(diào)控下游基因二態(tài)性表達(dá), 進(jìn)而引導(dǎo)性腺分化。已知性別決定涉及到復(fù)雜的分子作用網(wǎng)絡(luò)以及信號(hào)級(jí)聯(lián), 目前的研究大多局限于單基因甲基化狀態(tài)的分析, 因此未來仍需大量的、全基因組水平的甲基化分析來解答眾多關(guān)鍵性問題。