齊登斌 郭振元 閆波 張蕊

[摘要] 目的 探討自由基清除劑依達(dá)拉奉對于大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后所導(dǎo)致的神經(jīng)元凋亡和XIAP、Caspase-3的影響。方法 對2015年9月—2017年9月雄性Wistar大鼠共54只展開研究，將該組所有大鼠隨機分為對照組（N組）、模型組（M組）和依達(dá)拉奉組（ED組）3組，其中對照組6只，后兩組再分為6、12、24、48 h 4個亞組，每個亞組6只。采用氯化鋰-匹羅卡品制備SE動物模型，大鼠海馬神經(jīng)元凋亡檢測采用TUNEL法來完成，同時對XIAP、Caspase-3蛋白表達(dá)采用免疫組化來進(jìn)行檢測。結(jié)果 在6 h內(nèi)SE后M組主要有陽性TUNEL、XIAP和Caspase-3細(xì)胞，TUNEL和Caspase-3表達(dá)高峰是在24 h左右（43.17±1.424），（35.26±1.428）；XIAP表達(dá)高峰在12 h（40.68±2.817），兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.013）。ED組與M組相比，在12、24 h和48 h，TUNEL和Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05），XIAP陽性細(xì)胞數(shù)有所增加（P<0.05）。結(jié)論 依達(dá)拉奉在大鼠神經(jīng)元凋亡下持續(xù)癲癇狀態(tài)中應(yīng)用，可以提高XIAP蛋白的表達(dá)，抑制Caspase-3蛋白的表達(dá)，從而對神經(jīng)元損傷提供保護。

[關(guān)鍵詞] 依達(dá)拉奉；大鼠；癲癇持續(xù)狀態(tài)；XIAP；Caspase-3

[中圖分類號] R5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2019）01（c）-0023-03

Effects of Edaravone on Neuronal Apoptosis and Expression of XIAP and Caspase-3 in Rats with Status Epilepticus

QI Deng-bin1， GUO Zhen-yuan1， YAN Bo2， ZHANG Rui3

1.Department of Neurology， Yanzhou District People's Hospital， Jining Medical College， Jining Medical College， Jining， Shandong Province， 272200 China；2.Shandong Sino-US Translational Medicine Cooperation Research Center， Jining， Shandong Province， 272200 China； 3.Affiliated Hospital of Jining Medical College （Pediatrics Department），Jining， Shandong Province， 272200 China

[Abstract] Objective To investigate the effects of free radical scavenger edaravone on neuronal apoptosis and XIAP and Caspase-3 induced by epilepticus in rats. Methods A total of 54 male Wistar rats from September 2015 to September 2017 were enrolled. All rats in this group were randomly divided into control group （N group）， model group （M group） and edaravone group （ED group）， there were three groups， including 6 in the control group. The latter two groups were subdivided into four subgroups of 6 h， 12 h， 24 h and 48 h， with 6 in each subgroup. The animal model of SE was prepared by using lithium chloride-pilocarpine. The apoptosis of rat hippocampal neurons was detected by TUNEL method. The expression of XIAP and Caspase-3 protein was detected by immunohistochemistry. Results After 6 hours， the main group had positive TUNEL， XIAP and Caspase-3 cells peak expression of TUNEL and Caspase-3 was about 24 h （43.17±1.424），（35.26±1.428）； the peak of XIAP expression was 12 h （40.68±2.817）， the different was statistically significant（P=0.013）. Compared with the M group， the number of TUNEL and Caspase-3 positive cells decreased in the ED group at 12 h， 24 h and 48 h （P<0.05）， and the number of XIAP positive cells increased （P<0.05）. Conclusion The application of edaravone in the continuous epilepsy state of rat neuronal apoptosis can increase the expression of XIAP protein and inhibit the expression of Caspase-3 protein， thus providing protection for neuronal damage.

[Key words] Edaravone； Rat； Status epilepticus； XIAP； Caspase-3

癲癇持續(xù)狀態(tài)在臨床醫(yī)學(xué)中是一種常見的急癥，會導(dǎo)致認(rèn)知狀態(tài)及行為狀態(tài)發(fā)生急性或是持續(xù)性改變，從而導(dǎo)致大腦皮質(zhì)、海馬體等邊緣神經(jīng)元損傷。細(xì)胞凋亡的過程是一種程序性和自主性的過程，主要是受到基因調(diào)控，同時也是SE后神經(jīng)元死亡重要形式之一。目前在抗凋亡效應(yīng)中Caspase-3、XIAP對SE中的病理生理機制目前仍缺乏深入的研究。依達(dá)拉奉作為一種新型自由基清除劑，對遲發(fā)性神經(jīng)細(xì)胞死亡及脂質(zhì)過氧化反應(yīng)具有抑制作用，該組對2015年9月—2017年9月54只大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)治療中采用依達(dá)拉奉，并對患鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后神經(jīng)元損傷情況，和對其自由基影響加以觀察。

1 材料與方法

1.1 材料

取健康成年雄性Wistar大鼠54只，體質(zhì)量為190～230 g，該組實驗材料由濟寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院實驗動物中心提供，氯化鋰、匹魯卡品、依達(dá)拉奉由美國Sigma公司所提供。SOD試劑盒選購于南京建成生物公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 對該次的研究對象按照雙盲法將其分為對照組（n=6）和實驗組（n=48），其中實驗組又分為依達(dá)拉奉治療組（ED組）與模型組（M組），后兩組再分為6、12、24、48 h 4個亞組，每個亞組6只。

1.2.2 動物模型建立 該組研究中所有動物均采用灌胃法，在造模前一刻鐘ED組向腹腔注射50 mg/kg，依達(dá)拉奉（國藥準(zhǔn)字H20160151），M組與N組注射50 mg/kg，生理鹽水。在造模后ED組與M組根據(jù)體質(zhì)量指數(shù)注射127 mg/kg氯化鋰，在20 h后向腹腔注射30 mg/kg匹羅卡品（國藥準(zhǔn)字H20013262）。對照組大鼠采用適量生理鹽水向腹腔注射，觀察大鼠在15～30 min后的癲癇發(fā)作狀態(tài)，并給予地西泮（國藥準(zhǔn)字H33020250），終止癲癇發(fā)作。

1.2.3 標(biāo)本處理方法 對各個時間點大鼠的狀態(tài)進(jìn)行觀察，在給予1%的戊巴比妥鈉麻醉后，在冰盤上取腦，將大鼠腦干和小腦快速去除，并將其置于0～4℃的生理鹽水中進(jìn)行漂洗，去除殘留血液，并用濾紙進(jìn)行擦拭干凈，并取左側(cè)稱其質(zhì)量，加入適量生理鹽水，在冰浴中采用玻璃勻漿器制成腦勻漿，取上清液將其放置到冰箱中儲藏，等待測定。右側(cè)半腦采用多聚甲醛固定1 d，在石蠟包埋后，對其海馬部位做一矢狀切片，并對其采用免疫組織化學(xué)法對蛋白表達(dá)進(jìn)行測定。

1.2.4 染色 按照試劑盒說明方法對 TUNEL進(jìn)行染色，陽性細(xì)胞即凋亡細(xì)胞，將細(xì)胞核染為棕黃色顆粒。

1.2.5 XIAP、Caspase-3蛋白免疫組化檢測 采用常規(guī)法進(jìn)行免疫組化檢測，每張切片取5個（×400倍）視野，測定各個視野陽性細(xì)胞數(shù)量，并取平均值進(jìn)行計算。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 13.6統(tǒng)計學(xué)軟件對該組數(shù)據(jù)加以評定與總結(jié)，用χ2檢驗對計數(shù)資料進(jìn)行檢驗，多樣本均數(shù)用方差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察

N組大鼠在治療后無癲癇持續(xù)發(fā)作狀態(tài)，采用匹魯卡品向M組大鼠注射，待半小時后，大鼠均出現(xiàn)不同的癥狀，如點頭、咀嚼等，部分大鼠出現(xiàn)站立、前肢痙攣等，同時會導(dǎo)致全身出現(xiàn)強直陣攣，上述癥狀反復(fù)發(fā)作，產(chǎn)生癲癇持續(xù)狀態(tài)。ED組癲癇發(fā)作程度較輕，潛伏期長。

2.2 HE染色結(jié)果

正常對照組大鼠細(xì)胞呈橢圓形或圓形，核仁清晰，神經(jīng)元排列整齊，胞漿透明，染色質(zhì)分布均勻；模型組細(xì)胞排列紊亂，胞核固縮，胞漿紅染，有嗜酸性神經(jīng)元。依達(dá)拉奉組的嗜酸性神經(jīng)元數(shù)量少，細(xì)胞排列較為松散，形態(tài)趨于正常。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測 N組大鼠陽性細(xì)胞表達(dá)較少

6 h時，M組大鼠SE后有TUNEL表達(dá)，主要分布在海馬CA3區(qū)，陽性細(xì)胞核染色呈棕黃色，TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)少量，著色淺，隨著時間的延長而不斷增加，在24 h時達(dá)到表達(dá)高峰，在48 h時減少。ED組與M組兩組在凋亡陽性細(xì)胞數(shù)變化上無顯著差異，在24 h時TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)處于高峰，但細(xì)胞數(shù)量較M組少（P<0.05）。見表1。

2.4 XIAP及Caspase-3免疫組化結(jié)果

在12、24 h和48 h，ED組與M組XIAP和Caspase-3表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2、3。

3 討論

癲癇主要是由于多種因素所引起的一種慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病綜合征，由于大腦神經(jīng)元異常，從而引起重復(fù)和短暫的神經(jīng)功能失調(diào)，在癲病發(fā)展中自由基發(fā)揮著重要作用，根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，在癲癇時自由基是腦內(nèi)異常代謝產(chǎn)物，并參與到癲病發(fā)展，加重腦損傷，損傷到線粒體，導(dǎo)致腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡、興奮性神經(jīng)遞質(zhì)合成，進(jìn)而產(chǎn)生疾病，在腦組織中具有較高的脂質(zhì)含量，同時自由基會攻擊腦內(nèi)的不飽和脂肪酸，脂質(zhì)會產(chǎn)生過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生大量過氧化物，同時又被分解成MDA產(chǎn)物，從而產(chǎn)生細(xì)胞代謝障礙，或?qū)е履X實質(zhì)功能產(chǎn)生障礙。在動物研究實驗中發(fā)現(xiàn)，在癲癇發(fā)病中腦內(nèi)MDA含量增加，下丘腦、腦垂體、海馬體和腦皮層SOD活性降低，而癲癇發(fā)作次數(shù)的增加，這種變化也會隨之發(fā)生顯著變化。據(jù)研究觀察與分析發(fā)行，大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)下產(chǎn)生神經(jīng)元凋亡，是由于有多種調(diào)控基因參與其中，受到基因調(diào)控所導(dǎo)致，而Caspase與XIAP則是當(dāng)前在對凋亡調(diào)控基因中研究較多。

XIAP對Caspase分子起到直接結(jié)合及抑制的作用，抑制對由Fas及線粒體所介導(dǎo)的凋亡，具有內(nèi)源性凋亡抑制作用[3-4]。在本組實驗中發(fā)現(xiàn)，N組有Caspase和XIAP基礎(chǔ)量表達(dá)，6h內(nèi)SE后M組主要有陽性TUNEL、XIAP和Caspase-3細(xì)胞，TUNEL和Caspase-3表達(dá)高峰是在24 h左右（43.17±1.424），（35.26±1.428）；XIAP表達(dá)高峰在12 h（40.68±2.817）。ED組與M組相比，在12、24 h和48 h，TUNEL和Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)減少，XIAP陽性細(xì)胞數(shù)增加，（P<0.05）。依達(dá)拉奉通過提高XIAP蛋白的表達(dá)，抑制Caspase-3蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮保護神經(jīng)元作用[5-6]。翟紅等人[7]在研究中采用氯化鋰-匹羅卡品大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)模型，對50只大鼠在癲癇持續(xù)狀態(tài)后腦內(nèi)自由基活動情況進(jìn)行觀察，研究發(fā)現(xiàn)，在SE后，模型組腦組織勻漿中SOD活性下降，下降程度超過之前的25%，MDA含量增加，增加程度超過之前數(shù)據(jù)的50%。并且參與研究的兩組大鼠TUNEL和Caspase-3表達(dá)高峰在24 h左右為（45±0.5）、（35±1.5）；并且XIAP表達(dá)高峰在12 h左右的數(shù)據(jù)為（40±1.5）；其選擇的另一組TUNEL和Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)量也相對減少，為之前數(shù)據(jù)的85%左右，并且XIAP陽性細(xì)胞數(shù)開始增加，與本組研究結(jié)果較為相似。

依達(dá)拉奉（edravone，EP）作為全新的自由基清除劑，其能夠通過對脂質(zhì)過氧化作用進(jìn)行抑制、抑制腦細(xì)胞所產(chǎn)生的過氧化作用，并且還能夠讓神經(jīng)元死亡時間得到延遲，減輕不明原因誘發(fā)的人體組織或者腦水腫損傷現(xiàn)象[7-8]。研究表明EP可對多種炎癥介質(zhì)具有調(diào)節(jié)作用，同時HMGBl、TNF-α及IL-6中還具有抗炎介質(zhì)作用，因此依達(dá)拉奉對SE后大腦的保護機制是多途徑、多位點的，筆者將做進(jìn)一步探討。

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（收稿日期：2018-10-28）