(遵義師范學(xué)院生物與農(nóng)業(yè)科技學(xué)院， 貴州 遵義 563006)

鈣離子是植物細(xì)胞壁的重要結(jié)構(gòu)組分，也是植物必需礦質(zhì)元素其中之一，在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育過程方面起著重要作用[1], 并且鈣離子還是液泡內(nèi)重要的滲透保護(hù)物質(zhì)，具有維持細(xì)胞內(nèi)離子平衡并保持細(xì)胞膜穩(wěn)定等功能[2-5]。此外, 鈣離子還是植物細(xì)胞響應(yīng)環(huán)境變化非常重要的信號分子，耦連胞外環(huán)境信號與胞內(nèi)生理反應(yīng)，在外界信號的感應(yīng)以及響應(yīng)過程中起著極為重要的作用[6]。一定含量的鈣可以緩解鹽害、干旱、冷害、細(xì)菌等對植物造成的傷害[7-8]，對植物種子萌發(fā)和生長都有積極的影響[9]。外源鈣對絕大多數(shù)植物的鹽害效應(yīng)具備一定程度的緩解作用，當(dāng)植物受到低濃度鹽脅迫時，植物可以采用增加細(xì)胞質(zhì)中游離Ca2+的濃度，進(jìn)而借助Ca2+與CaM的結(jié)合，啟動一系列的生理生化響應(yīng)機(jī)制，維持細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，保證光合作用的正常進(jìn)行[10-11]。然而，高濃度的鈣離子可以干擾植物細(xì)胞的正常生理生化功能[5]，抑制植物種子萌發(fā)，影響其光合作用[12-14], 進(jìn)而抑制植物的生長發(fā)育[15]。

喀斯特地貌以裸露的石灰?guī)r為其主要特征[16]，其面積約占地球陸地面積的12%[17]，中國約有1/3的陸地屬于喀斯特地貌[18]?？λ固氐貐^(qū)土壤具有高鈣的特點(diǎn)，且大多土被不連續(xù)，土層也較為淺薄，土壤中含有極為豐富鈣離子, 其含量是一般酸性土壤的3倍以上[17,19]，對植物的生長和發(fā)育產(chǎn)生重要影響[20]。我國喀斯特地貌大多分布在人口相對集中的西南部山區(qū)，近年來隨著人地矛盾日益突出，土壤侵蝕和水土流失加劇，對喀斯特地區(qū)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了直接威脅。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、白車軸草(TrifoliumrepensL.)和紫云英(AstragalussinicusL.)均是我國廣泛栽培應(yīng)用的優(yōu)良牧草，同時，作為優(yōu)質(zhì)的綠肥作物，具備在喀斯特地區(qū)進(jìn)行推廣種植的潛力。目前，相關(guān)研究主要集中在這3種牧草種子的耐鹽性和抗旱性方面[21-23]，關(guān)于其對高鈣土壤環(huán)境的適應(yīng)性方面研究較少。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的鈣離子溶液模擬土壤鈣離子環(huán)境，研究鈣離子濃度對3種牧草種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，為喀斯特地區(qū)適宜牧草和綠肥作物的篩選與評價提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

材料：供試種子為市場采購的湖北鑫大葉牧草公司生產(chǎn)的紫花苜蓿、白車軸草、紫云英種子。

試劑：氯化鈣為常規(guī)分析純無水氯化鈣(無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司)。

儀器：人工氣候箱(上海博迅，BIC-400)；分析天平(上海奧豪斯，AX 523 ZH-E)；烘箱(上海一恒，DHG-9625 A)；數(shù)顯游標(biāo)卡尺(日本三豐，Mitutoyo)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)計

試驗(yàn)共設(shè)置6個不同鈣離子濃度處理，每處理重復(fù)4次，每重復(fù)50粒種子。采用無水氯化鈣配置不同濃度的鈣離子溶液，鈣離子濃度梯度設(shè)置為0，0.03，0.06，0.09，0.12，0.15 mol·L-1。

1.2.2種子萌發(fā)試驗(yàn)

種子萌發(fā)處理：使用90 mm培養(yǎng)皿作為培養(yǎng)載體，采用2層濾紙法對種子進(jìn)行培養(yǎng)處理。為保證3種牧草種子在培養(yǎng)皿中發(fā)芽環(huán)境大致相同，在整個發(fā)芽試驗(yàn)期間每隔2 d用滴管吸取相同濃度溶液對種子潤洗2～3遍。整個萌發(fā)試驗(yàn)均在人工氣候箱中展開，溫度20 ℃，每日光照16 h，周期為15 d，在相同條件下萌發(fā)以排除其他因子干擾。萌發(fā)實(shí)驗(yàn)過程中每24 h統(tǒng)計1次發(fā)芽數(shù)量。種子萌發(fā)以胚根露出1 cm左右為判斷標(biāo)準(zhǔn)，萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束以后稱量幼苗鮮重。

恢復(fù)萌發(fā)處理：將種子萌發(fā)試驗(yàn)結(jié)束后培養(yǎng)皿中剩余未萌發(fā)的種子移出，并用蒸餾水反復(fù)沖洗3遍以上，其后將其轉(zhuǎn)入加有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，采用種子萌發(fā)試驗(yàn)相同的環(huán)境條件，在人工氣候箱中繼續(xù)培養(yǎng)10 d，每24 h統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)并移除已萌發(fā)種子。

1.2.3種子萌發(fā)參數(shù)的統(tǒng)計和測定

種子形態(tài):取20粒種子， 用精確度為 0.02 mm的數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量種子的長度、寬度及厚度，計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

種子百粒重: 取5個重復(fù)，用精度0.000 1 g的電子天平分別稱量百粒重，計算平均值及標(biāo)準(zhǔn)差。

種子含水率：稱取一定量的種子于鋁盒中，質(zhì)量記為m0，在100 ℃烘箱中烘干至恒重，再次稱重，質(zhì)量記為m，種子含水率(%)=[(m-m0)/m0]×100%。重復(fù)4次。

種子吸水率：稱取一定量的種子于鋁盒中，質(zhì)量記為m0，加入蒸餾水至淹沒所有種子，浸泡24 h，其后取出種子，擦干其表面水分，稱量，質(zhì)量記為m，種子吸水率(%)=[(m-m0)/m0]×100%。重復(fù)4次。

發(fā)芽率(%)=(15 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/每皿總種子數(shù))×100%；

發(fā)芽勢(%)=(前5 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/每皿總種子數(shù))×100%；

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt，(式中，Gt為第t天的發(fā)芽種子數(shù)，Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù))；

恢復(fù)萌發(fā)率(%)=(脅迫去除后恢復(fù)發(fā)芽種子數(shù)/未發(fā)芽種子總數(shù))×100%。

表1 3種牧草種子生物學(xué)特性比較

牧草種類 種子形態(tài)/mm長寬厚百粒重/g種子含水率/%種子吸水率/%紫花苜蓿2.22±0.341.34±0.180.93±0.090.1986±0.01099.42±0.35103.03±12.57白車軸草1.14±0.090.96±0.160.68±0.060.0616±0.00088.56±1.34118.90±13.51紫云英2.81±0.331.96±0.160.78±0.100.3389±0.00223.81±0.19141.72±8.38

1.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對不同鈣離子脅迫條件下3種牧草種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)分別進(jìn)行方差分析(one-way ANOVA)，并采用最小顯著差異法(LSD)對其進(jìn)行多重比較。同時，采用Excel 2016軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子基本表征

3種牧草種子的生物學(xué)特性如表1。種子形態(tài)整體上紫云英>紫花苜蓿>白車軸草，百粒重也是紫云英最大為(0.338 9±0.002 2)g。紫云英不但種子較大，且種子含水率最低，小于白車軸草和紫花苜蓿。然而，紫云英種子吸水率是3種牧草種子中最大的，達(dá)(141.72±8.38)%，其次為白車軸草，再次為紫花苜蓿。

2.2 種子萌發(fā)

不同的鈣離子溶液處理下3種牧草發(fā)芽率差異明顯(圖1)。白車軸草發(fā)芽率隨鈣離子濃度的增加呈下降趨勢，在鈣離子濃度0 mol·L-1時發(fā)芽率最大為(98.67±2.31)%。鈣離子濃度0.03 mol·L-1時發(fā)芽率和0 mol·L-1時差異不顯著，但顯著高于其他處理。鈣離子濃度0.12 mol·L-1時，發(fā)芽率快速下降，當(dāng)鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時，發(fā)芽率僅為(8.00±2.00)%。紫云英發(fā)芽率也隨鈣離子濃度的增加而降低，鈣離子濃度為0 mol·L-1時發(fā)芽率最大為(85.33±9.02)%，與鈣離子濃度0.03和0.06 mol·L-1發(fā)芽率差異不顯著。鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時發(fā)芽率最低為(34.67±13.32)%。紫花苜蓿發(fā)芽率隨鈣離子濃度增加呈先上升后下降的趨勢，在鈣離子濃度為0.06 mol·L-1時萌發(fā)率最大達(dá)(82.67±3.06)%，且與鈣離子濃度0、0.03、0.09 mol·L-1時發(fā)芽率差異不顯著(p<0.05)。鈣離子濃度0.15 mol·L-1時發(fā)芽率最低為(39.33±6.43)%?？傮w來看，鈣離子濃度0～0.09 mol·L-1時3種牧草萌發(fā)率緩慢下降趨勢，鈣離子濃度0.12～0.15 mol·L-1時3種牧草種子萌發(fā)率快速下降，下降幅度由大到小依次為白車軸草、紫云英和紫花苜蓿。

圖1 鈣離子濃度對3種牧草種子發(fā)芽率的影響

3種牧草在不同鈣離子濃度溶液處理下發(fā)芽勢差異明顯(圖2)。白車軸草和紫云英發(fā)芽勢隨鈣離子濃度增加呈下降趨勢，二者均在鈣離子濃度為0 mol·L-1時發(fā)芽勢最大，分別為(97.33±1.15)%和(84.67±9.02)%。白車軸草在鈣離子濃度為0.12 mol·L-1時發(fā)芽勢快速降低，顯著低于鈣離子濃度為0.09 mol·L-1，到0.15 mol·L-1時發(fā)芽勢僅為(2.00±2.00)%。紫云英發(fā)芽勢也在鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時逐漸降到最低為(12.67±2.31)%。紫花苜蓿發(fā)芽勢隨鈣離子濃度增加呈先增大后減小趨勢，在鈣離子濃度為0.03 mol·L-1時達(dá)到最大值為(80.67±6.43)%，其后發(fā)芽勢緩慢下降，到鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時最低，為(26.67±8.08)%。

圖2 鈣離子濃度對3種牧草種子發(fā)芽勢的影響

3種牧草種子發(fā)芽指數(shù)隨鈣離子濃度增加均呈減小趨勢(圖3)。紫花苜蓿、白車軸草和紫云英均在鈣離子濃度為0 mol·L-1時發(fā)芽指數(shù)最大，分別為23.21±1.99、34.25±1.76和16.63±2.61。其后發(fā)芽指數(shù)均逐漸降低，到鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時降到最低，發(fā)芽指數(shù)分別為5.38±1.35、0.62±0.22和2.78±0.83，僅分別為鈣離子濃度0 mol·L-1時的23.18%、1.81%和16.72%。

圖5 鈣離子濃度對3種牧草幼苗生長的影響

圖3 鈣離子濃度對3種牧草種子發(fā)芽指數(shù)的影響

2.3 蒸餾水恢復(fù)萌發(fā)

將上述鈣離子溶液各處理中不萌發(fā)的種子經(jīng)過反復(fù)清洗并轉(zhuǎn)入到蒸餾水中進(jìn)行萌發(fā)后，3種牧草種子都快速恢復(fù)萌發(fā)，且恢復(fù)萌發(fā)率較高，達(dá)49.38%。不同鈣離子濃度處理下3種牧草種子的恢復(fù)萌發(fā)率隨鈣離子濃度的增加呈快速增加趨勢，且各鈣離子濃度下，紫花苜?；謴?fù)萌發(fā)率均最高，其次為紫云英，再次為白車軸草(圖4)。

2.4 幼苗生長

萌發(fā)結(jié)束以后，不同鈣離子濃度處理3種牧草幼苗生長差異明顯(圖5)。白車軸草幼苗濕重隨鈣離子濃度增加呈減小趨勢，由鈣離子濃度為0 mol·L-1時的(0.006 1±0.002 7)g減少到鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時的(0.003 2±0.000 5)g。紫云英幼苗濕重隨鈣離子濃度也呈減小趨勢，由鈣離子濃度為0 mol·L-1時的(0.032 5±0.008 2)g減少到鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時的(0.007 6±0.000 9)g，且鈣離子濃度為0 mol·L-1時紫云英幼苗已經(jīng)長出第一片真葉。紫花苜蓿幼苗濕重隨鈣離子濃度增加呈先增大后減小趨勢，鈣離子濃度為0.03 mol·L-1時幼苗濕重最大達(dá)(0.023 7±0.003 2)g，其后濕重一直減小，到鈣離子濃度為0.15 mol·L-1時最小為(0.004 9±0.000 8)g。

圖4 不同鈣離子濃度下牧草種子的恢復(fù)萌發(fā)率

3 討 論

3.1 鈣離子脅迫對3種牧草種子萌發(fā)的影響

紫花苜蓿、白車軸草和紫云英作為優(yōu)良的牧草和綠肥作物，以其重要的飼用價值和水土保持價值，是喀斯特地區(qū)發(fā)展草地畜牧業(yè)，帶動經(jīng)濟(jì)發(fā)展與改善生態(tài)環(huán)境的重要備選牧草品種。研究表明，白車軸草和紫云英種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均隨鈣離子濃度的增加總體呈減小趨勢，鈣離子濃度較高時(0.12～0.15 mol·L-1)下降尤其明顯。原因可能是隨著鈣離子濃度增加，脅迫增強(qiáng)，引起種子周圍水勢降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外水勢差隨之減小，致使種子吸水困難，加之胚乳內(nèi)儲藏物質(zhì)不能動員，呼吸作用受到強(qiáng)烈抑制，種子難以萌發(fā)[24]。Cai等研究發(fā)現(xiàn)，高濃度鈣離子(0.09 mol·L-1)能夠明顯抑制蘿卜(Raphanussativus)種子萌發(fā)[25]，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相一致。同時，隨鈣離子濃度的增加，紫花苜蓿種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢呈先增大后減小趨勢。這與劉小麗等[26]對不同鈣離子濃度處理下香椿(Toonasinensis)種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)的變化結(jié)果相一致?？偟膩碚f，低濃度鈣離子脅迫對3種牧草種子發(fā)芽影響有限，而高濃度鈣離子脅迫能夠明顯抑制3種牧草種子萌發(fā)，且低濃度鈣離子(0.03～0.06 mol·L-1)脅迫可以促進(jìn)紫花苜蓿種子萌發(fā)，提高其發(fā)芽率，對高鈣環(huán)境的適應(yīng)能力優(yōu)于白車軸草和紫云英。

3.2 3種牧草種子鈣離子脅迫去除后的恢復(fù)萌發(fā)能力

將萌發(fā)試驗(yàn)中不同鈣離子濃度處理下未萌發(fā)的種子，經(jīng)過反復(fù)清洗后轉(zhuǎn)入到蒸餾水中繼續(xù)培養(yǎng)，3種牧草種子均快速恢復(fù)萌發(fā)。高濃度鈣離子濃度溶液中轉(zhuǎn)移來的3種牧草種子其恢復(fù)萌發(fā)率均高于低濃度鈣離子濃度溶液中轉(zhuǎn)移來的種子，且紫花苜?；謴?fù)萌發(fā)率大于白車軸草和紫云英。原因可能是鈣離子濃度并沒有超過3種牧草種子的耐受極限，沒有對牧草種子造成永久性的傷害。這與黃振英[27]、呂朝燕[28]等對NaCl脅迫下梭梭(Haloxylonammodendron)種子萌發(fā)的研究結(jié)果一致。同時，UNGAR[29]對部分一年生鹽生植物(Salicorniaeuropaea，Spergulariamarina，Suaedadepressa以及Suaedalinearis)在NaCl脅迫條件下的種子萌發(fā)過程進(jìn)行了系統(tǒng)研究，其在恢復(fù)試驗(yàn)中觀察到了與本試驗(yàn)類似的恢復(fù)萌發(fā)現(xiàn)象?？梢哉J(rèn)為，在鹽脅迫尚未超過植物種子耐受閾限時，鹽濃度引起的滲透壓改變限制了種子的萌發(fā)，而不是金屬離子的毒性對種子造成了永久性損害，當(dāng)鹽脅迫減輕或消失以后，植物種子仍然具備較強(qiáng)的萌發(fā)能力?？梢姡}離子脅迫去除以后，3種牧草種子均具有較強(qiáng)的恢復(fù)萌發(fā)能力，且紫花苜蓿好于白車軸草和紫云英。

3.3 鈣離子脅迫對3種牧草幼苗生長的影響

鈣離子在植物生長發(fā)育過程當(dāng)中具有非常重要的作用，然而在喀斯特地區(qū), 土壤中過多的鈣離子可以抑制植物的正常生長，降低作物的產(chǎn)量, 甚至給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來嚴(yán)重影響[30]。試驗(yàn)結(jié)果表明，白車軸草和紫云英幼苗生長受到鈣離子濃度的明顯抑制，幼苗濕重隨鈣離子濃度增加而呈下降趨勢。Kanashiro等[31]通過在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度鈣離子，發(fā)現(xiàn)在鈣離子濃度(0.12 mol·L-1)較高時，鳳梨科植物(Aechmeablanchetiana)幼苗的干重和鮮重均顯著降低，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。同時，紫花苜蓿幼苗在鈣離子濃度(0.03 mol·L-1)較低時，其生長好于其他處理，可以認(rèn)為該鈣離子濃度是紫花苜蓿幼苗生長的最適濃度。Al-Whaibi等[32]用不同濃度(0～0.10 mol·L-1)的CaCl2溶液處理蠶豆(Viciafaba)幼苗，研究發(fā)現(xiàn)0.06 mol·L-1為蠶豆幼苗生長的最適濃度，與本試驗(yàn)研究結(jié)果類似?？偟膩碚f，鈣離子能夠明顯抑制3種牧草幼苗的生長，低濃度鈣離子(0.03 mol·L-1)脅迫可以促進(jìn)紫花苜蓿幼苗的生長。因此，初步認(rèn)為紫花苜蓿對高鈣環(huán)境的適應(yīng)能力要好于白車軸草和紫云英，是喀斯特地區(qū)較為適宜的栽培牧草品種。