張富榮，戎素平2，張艷彥3，楊 進(jìn)，李發(fā)虎，黃修梅

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014019；2.烏蘭察布市種子管理站，內(nèi)蒙古 烏蘭察布 012000； 3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，呼和浩特 010010)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是全球和中國(guó)第四大糧食作物[1]。中國(guó)馬鈴薯種植面積居世界首位，但平均單產(chǎn)僅為發(fā)達(dá)國(guó)家單產(chǎn)的1/3，其關(guān)鍵制約因素是病毒病積累引起的種薯質(zhì)量不合格[2-3]。據(jù)報(bào)道，感染馬鈴薯的病毒達(dá)40種以上，在中國(guó)危害比較嚴(yán)重的主要有馬鈴薯X病毒(PVX)、馬鈴薯Y病毒(PVY)、馬鈴薯S病毒(PVS)、馬鈴薯A病毒(PVA)、馬鈴薯M病毒(PVM)以及馬鈴薯卷葉病毒(PLRV)[4]。其中，PVY和PLRV被所有的馬鈴薯種植國(guó)家認(rèn)為是最嚴(yán)重的威脅，嚴(yán)重影響了馬鈴薯產(chǎn)量及品質(zhì)[5]。PVY與其他病毒復(fù)合侵染后，可致馬鈴薯減產(chǎn)80%[6]。近年來(lái)，種薯質(zhì)量調(diào)查方面主要是田間質(zhì)量調(diào)查[7-8]，對(duì)馬鈴薯種薯收獲后病毒侵染情況鮮有報(bào)道。因此本研究調(diào)查種薯收獲后病毒侵染情況，探討主要病毒病PVY和PLRV單獨(dú)侵染與復(fù)合侵染對(duì)種薯產(chǎn)量的影響，以期為種薯生產(chǎn)與質(zhì)量控制提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病毒侵染情況調(diào)查參照《馬鈴薯種薯》GB 18133-2012[9]，從5家種薯企業(yè)收獲后的原原種、原種和一級(jí)種的種薯批中抽取塊莖樣品數(shù)量。病毒接種試驗(yàn)材料為經(jīng)DAS-ELISA檢測(cè)合格的克新一號(hào)和費(fèi)烏瑞它的原原種。

1.2 病毒檢測(cè)方法

塊莖打破休眠栽植，苗高15 cm左右開(kāi)始采用雙抗體夾心酶聯(lián)檢測(cè)法(DAS-ELISA)檢測(cè)馬鈴薯PVX、PVY、PVS、PLRV、PVA和PVM 6種病毒，檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自英國(guó)Adgen試劑公司，其他化學(xué)試劑為分析純。

1.3 病毒接種

試驗(yàn)設(shè)接種PVY、PLRV、PVY+PLRV和不接病毒(ck)4個(gè)處理。在防蟲(chóng)網(wǎng)室內(nèi)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次，行長(zhǎng)3 m，單行區(qū)，密度80 cm×30 cm，小區(qū)面積為2.4 cm2，各病毒組間隔1個(gè)空行區(qū)。當(dāng)馬鈴薯植株生長(zhǎng)至4～6葉期時(shí)，采用摩擦接種的方法將病毒汁液分別接種至馬鈴薯葉片，具體方法：將帶有病毒的植物葉片放于磷酸緩沖液(PB)研磨[m(攜病毒葉片)∶V(緩沖液)=1∶10]，研磨后2 000 r/min離心2 min，上清液即為研究所用的病毒液，其中PVY+PLRV是使用分別帶有PVY和PLRV葉片按照重量比1∶1混合研磨。每株植物均使用約400μL的病毒混合液，分別接水平差異顯著。下同。

表1 不同級(jí)別馬鈴薯脫毒種薯收獲后病毒病情況統(tǒng)計(jì)

種薯級(jí)別檢測(cè)樣品個(gè)數(shù) 單獨(dú)侵染 復(fù)合侵染 PVYPLRVPVXPVAPVMPVSPVY+PLRV其它總病毒率(%)原原種400000000000原種4041530000104.4一級(jí)種4162271000307.2

表2 ELISA檢測(cè)PVY、PLRV和PVX的吸光度值

種薯級(jí)別PVYPLRVPVX原種1.2498±1.2809b0.9364±0.8058b—一級(jí)種1.8624±0.7006a1.2470±0.8547a0.8804陽(yáng)性對(duì)照1.3790±0.1534b1.2894±0.1407a1.1387±0.1445陰性對(duì)照0.1665±0.01254c0.1559±0.0197c0.1255±0.0163

注：樣品濃度為樣品﹕提取液=1 g﹕5 mL；顯色時(shí)間以25 ℃顯色60 min。不同的小寫(xiě)字母表示在0.05

表3 馬鈴薯克新一號(hào)單獨(dú)侵染與復(fù)合侵染PVY和PLRV后對(duì)產(chǎn)量的影響

病毒種類(lèi)株高(cm)結(jié)薯數(shù)個(gè)(株)單株產(chǎn)量(g/株)單株減產(chǎn)(%)商品薯率(%)商品薯率減產(chǎn)(%)對(duì)照62.07±1.89a8.28±1.11a736±27.7a73.5±4.90aPVY57.33±2.00b7.29±1.38a653±41.6b11.161.8±6.76b15.3PLRV53.17±0.55c7.86±1.22a669±21.9b8.8663.2±5.63b13.4PVY+PLRV48.07±1.04d5.57±0.98b510±52.3c25.251.4±3.51c30.5

表4 馬鈴薯費(fèi)烏瑞它單獨(dú)侵染與復(fù)合侵染PVY和PLRV后對(duì)種薯產(chǎn)量的影響

病毒種類(lèi)株高(cm)結(jié)薯數(shù)個(gè)(株)單株產(chǎn)量(g/株)單株減產(chǎn)(%)商品薯率(%)商品薯率減產(chǎn)(%)對(duì)照39.40±3.44a6.05±0.82a473±25.34a79.2±6.42aPVY30.67±4.12b5.72±1.11a393±23.81b17.463.6±6.95b19.5PLRV32.06±2.19b5.57±1.13a405±17.86b14.465.0±7.68b17.7PVY+PLRV23.73±1.61c4.57±0.79b328±43.49c30.749.4±3.78c37.5

種2片葉片，5 d后進(jìn)行第2次重復(fù)接種，接種10 d后采用DAS-ELISA方法確定接種是否成功。田間管理同原種生產(chǎn)管理，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件和SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析。

商品薯率(%)=(每株75 g以上的塊莖重量/全株總重量)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同級(jí)別脫毒馬鈴薯種薯收獲后病毒病侵染情況調(diào)查

本次調(diào)查種薯薯塊涉及原原種、原種和一級(jí)種3個(gè)級(jí)別。采用ELISA共檢測(cè)了6種病毒，檢出3種病毒(表1)，分別為PVY、PLRV和PVX。原原種未發(fā)現(xiàn)病毒。原種檢出PVY和PLRV，侵染率分別為3.7%和0.7%，總病毒病為4.4%。一級(jí)種共檢出PVY、PLRV和PVX 3種病毒，侵染率分別為5.3%、1.7%和0.2%，總病毒病為7.2%。復(fù)合侵染僅發(fā)現(xiàn)PVY和PLRV，原種和一級(jí)種的復(fù)合侵染率分別為0.2%和0.7%。PVY侵染最為嚴(yán)重，其次為PLRV，一級(jí)種的侵染率大于原種的侵染率。

2.2 DAS-ELISA檢測(cè)PVY和PLRV的病毒含量

樣品的吸光度值為陰性樣品數(shù)值的2倍及以上判定為陽(yáng)性。如表2所示，各陽(yáng)性樣品分種薯級(jí)別的吸光度值存在顯著差異。對(duì)于PVY陽(yáng)性樣品，一級(jí)種和原種的吸光度平均值分別是陰性對(duì)照的11倍和7.5倍，其中一級(jí)種的吸光度值顯著高于原種，原種和陽(yáng)性對(duì)照差異不顯著。對(duì)于PLRV陽(yáng)性樣品，一級(jí)種和原種的吸光度平均值分別是陰性對(duì)照的8倍和6倍，其中一級(jí)種的吸光度值顯著高于原種，和陽(yáng)性對(duì)照差異不顯著。PVX僅檢測(cè)出1株，是陰性的7倍。由于病毒檢測(cè)的結(jié)果中吸光度值與病毒含量呈顯著正相關(guān)，超出陰性2倍就判定為陽(yáng)性，由此可見(jiàn)，各陽(yáng)性樣品病毒含量非常高，判定為陽(yáng)性的樣品數(shù)據(jù)結(jié)果可靠。一級(jí)種個(gè)別陽(yáng)性樣品的PVY和PLRV的吸光度值可能低于原種的平均水平，但其平均值卻顯著高于原種，說(shuō)明馬鈴薯隨著繁殖代數(shù)增加，病毒含量也呈遞增趨勢(shì)。

2.3 PVY和PLRV單獨(dú)侵染與復(fù)合侵染對(duì)馬鈴薯種薯產(chǎn)量的影響

從表3可知，馬鈴薯克新一號(hào)單獨(dú)侵染和復(fù)合侵染PVY和PLRV后，植株株高、單株產(chǎn)量和商品薯率均顯著下降，結(jié)薯個(gè)數(shù)PVY+PLRV顯著低于其余處理。侵染PVY+PLRV、PVY、PLRV后平均單株產(chǎn)量顯著降低了25.2%、11.1%、8.86%；商品薯率顯著降低了30.5%、15.3%、13.4%，其中PVY+PLRV顯著最低，PVY和PLRV間未形成顯著差異，但均顯著低于對(duì)照。

與克新一號(hào)相似，馬鈴薯費(fèi)烏瑞它單獨(dú)侵染和復(fù)合侵染PVY和PLRV后，植株株高、單株產(chǎn)量和商品薯率呈顯著下降，結(jié)薯個(gè)數(shù)PVY+PLRV顯著最低，PVY、PLRV和對(duì)照間未形成顯著差異(表4)。侵染PVY+PLRV、PVY、PLRV后平均單株產(chǎn)量顯著降低了30.7%、17.4%、14.4%；商品薯率顯著降低了37.5%、19.5%、17.7%，其中PVY+PLRV顯著最低、PVY和PLRV間未形成顯著差異。馬鈴薯的2個(gè)品種復(fù)合侵染比單獨(dú)侵染減產(chǎn)嚴(yán)重，PVY比PLRV對(duì)產(chǎn)量的影響嚴(yán)重，費(fèi)烏瑞它減產(chǎn)嚴(yán)重。

3 討 論

白艷菊等在2004—2005年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，北方馬鈴薯田PVY病毒發(fā)生嚴(yán)重，其氣候條件有利于PVY病毒的傳播，試管苗和原原種PVY病毒檢出率為13.3%，而大田高達(dá)47.2%[7]。范國(guó)權(quán)等2009年對(duì)9省區(qū)馬鈴薯脫毒種薯質(zhì)量的調(diào)查結(jié)果表明，大田種薯樣品PVY檢出率最高，為16.74%[8]。Muhammad Fahim Abbas等在2011—2012年利用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)調(diào)查了巴基斯坦馬鈴薯病毒病發(fā)生情況，結(jié)果表明，平均發(fā)病率為52.3%，同步感染1種，2種，3種，4種和5種病毒的百分率分別為41.89%，21.78%，16.2%，17.87%和2.23%[10]。本試驗(yàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，原原種病毒侵染率為0%，原種PVY和PLRV的侵染率分別為3.7%和0.7%，一級(jí)種PVY、PLRV和PVX的侵染率分別5.3%、1.7%和0.2%，病毒侵染率低于以往調(diào)查，這可能與本次調(diào)查為薯塊，隨機(jī)抽取，避免了田間調(diào)查人為選擇有病毒癥狀樣品的可能有關(guān)，因此薯塊調(diào)查更具有代表性。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，原原種、原種和一級(jí)種的總病毒侵染率分別為0%、4.4%和7.2%，《馬鈴薯種薯》GB 18133-2012規(guī)定原原種、原種和一級(jí)種的總病毒允許率分別為0%、1%和5%，因此原原種滿足國(guó)家質(zhì)量要求，而原種和一級(jí)種分別高出國(guó)家種用標(biāo)準(zhǔn)3.4倍和0.44倍，其中PVY侵染最為嚴(yán)重，田間觀察也發(fā)現(xiàn)，侵染PVY的病毒株最為明顯，這可能與PVY的容易傳播有關(guān)，PVY既可通過(guò)汁液摩擦傳播，又可通過(guò)蚜蟲(chóng)傳播，且蚜傳效率較高，因此在種薯生產(chǎn)中蚜蟲(chóng)防治和及時(shí)拔出病毒株至關(guān)重要。

Hoa et al報(bào)道，在菲律賓輕微侵染和嚴(yán)重侵染PVY和PLRV可分別引起49%和61%的產(chǎn)量損失[11]，本試驗(yàn)結(jié)果表明，馬鈴薯克新一號(hào)和費(fèi)烏瑞它單獨(dú)侵染和復(fù)合侵染PVY和PLRV后植株株高、單株產(chǎn)量和商品薯率均顯著下降，侵染PVY+PLRV、PVY、PLRV后，克新一號(hào)平均單株產(chǎn)量顯著降低了25.2%、11.1%、8.86%；費(fèi)烏瑞它顯著降低了30.7%、17.4%、14.4%，復(fù)合侵染導(dǎo)致的產(chǎn)量下降遠(yuǎn)大于單獨(dú)侵染，不同的病毒含量導(dǎo)致的減產(chǎn)幅度不同，不同品種抗性不同,克新一號(hào)對(duì)病毒抗性優(yōu)于費(fèi)烏瑞它。M.S Rahman等研究認(rèn)為，病毒導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)的原因是塊莖數(shù)量減少、塊莖變小或者二者都有可能[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，結(jié)薯個(gè)數(shù)僅復(fù)合侵染上形成顯著差異，原因可能是一定的病毒含量對(duì)結(jié)薯個(gè)數(shù)影響不大，而使單薯重下降導(dǎo)致減產(chǎn)，當(dāng)病毒積累達(dá)到一定值時(shí)，既影響了單薯重，又影響了單株結(jié)薯數(shù)。