(江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 句容 212400)

月季為薔薇科(Rosaceae)薔薇屬(Rosa)落葉或半常綠灌木，也有蔓狀或藤本狀，素有“花中皇后”之美稱[1-2]。按照美國(guó)月季協(xié)會(huì)1966年的定義，1867年首次育出的雜種香水月季系統(tǒng)的第一個(gè)品種后的品種群稱為現(xiàn)代月季(RosehybridaHort．)，而1867年之前的品種稱為古老月季(RosachinensisJacq.)[3-4]。月季具有極佳的觀賞性，種質(zhì)資源豐富，品種繁多[5]，對(duì)氣候、土壤要求不嚴(yán)格，但以疏松、肥沃、排水良好的微酸性土壤為宜，喜溫暖、空氣流通較好的環(huán)境栽培。江浙地區(qū)夏季具有高濕高熱的氣候條件，而許多引種栽培的現(xiàn)代月季品種耐熱性不好，因此培育耐熱性好的月季品種，是現(xiàn)代月季育種的一個(gè)重要方向。傳統(tǒng)的育種方法主要是通過(guò)雜交育種，目前，雜交育種仍然是月季新品種選育的主要途徑。父本花粉生活力的高低是影響雜交結(jié)實(shí)率的一個(gè)重要因素，根據(jù)花粉生活力的高低選用不同的品種做父本，或采用不同的授粉方式，將能有效提高結(jié)實(shí)率。因此，在雜交育種前需要對(duì)花粉進(jìn)行生活力測(cè)定。在月季花粉生活力測(cè)定方面的研究報(bào)道較少，目前僅見(jiàn)楊攀等[5]、張顥等[6]、周家杏等[7]、王其剛等[8]、張立磊等[9]的報(bào)道。因此，本研究以現(xiàn)代月季的4個(gè)品種為試材，選用4種不同的測(cè)定方法，對(duì)不同貯藏方法下的花粉生活力進(jìn)行了測(cè)定，以期為月季的人工授粉、雜交育種等工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 材 料

材料為生長(zhǎng)于江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院示范園區(qū)江蘇農(nóng)博園月季種質(zhì)資源圃內(nèi)的4個(gè)月季品種：歡笑“Bright Smile”、金獎(jiǎng)?wù)隆癎old Medal”、粉扇“Fenshan”、緋扇“Hiohgi”。

1.2 方 法

1.2.1花粉的采集

于09：00—11：00時(shí)期間選取即將綻放的花蕾，帶回實(shí)驗(yàn)室，用消毒過(guò)的鑷子取下花藥，將花藥置于硫酸紙上，放入硅膠干燥器內(nèi)，干燥5 h后收集花粉。

1.2.2花粉檢測(cè)方法的篩選

為了篩選出適宜不同月季品種的花粉生活力檢測(cè)方法，采用了雙因素(品種(4個(gè)水平)、染色方法(4個(gè)水平))的完全隨機(jī)組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1) TTC染色法：將待測(cè)的花粉置于凹形載玻片上，滴入2滴0.5%TTC溶液，用鑷子輕輕攪蕩使花粉均勻散開(kāi)后輕輕蓋上蓋玻片，置于30 ℃的恒溫箱中30 min，然后在顯微鏡下觀察，有活力的花粉被染成紅色[7]。

2) 醋酸洋紅染色法：利用1%的醋酸洋紅做為染色液，方法同TTC法，染完后將載玻片置于30 ℃下放置10 min，有活力的花粉被染成深紅色，沒(méi)有活力的花粉呈淺紅色或無(wú)色。

3) 亞甲基藍(lán)染色法：用0.1%的亞甲基藍(lán)溶液進(jìn)行染色，染色后靜置1～2 min，然后鏡檢，凡是染成藍(lán)色的表示有生活力，沒(méi)有著色或者著色過(guò)淺者為喪失生活力的花粉[7]。

4) 碘-碘化鉀染色法：將1 g KI溶于10 mL蒸餾水中，加入0.5 g I2，待其全部溶解后，加蒸餾水至200 mL，配好試劑后，貯于棕色瓶中備用[10]。將花粉置于載玻片，滴2滴I2-KI溶液，置于30 ℃恒溫箱中30 min，在顯微鏡下觀察，有生活力的花粉染成藍(lán)色，生活力衰弱或內(nèi)含物少的花粉呈黃褐色[5]。

以上染色方法，觀察時(shí)每個(gè)載玻片均統(tǒng)計(jì)3～5個(gè)視野，共統(tǒng)計(jì)100粒花粉，計(jì)算染色率作為花粉生活力，每種染色法均重復(fù)3次。

1.2.3貯藏方法對(duì)花粉生活力的影響

將收集的不同品種花粉分別裝入冷凍管中，每品種均選用4種方法進(jìn)行貯藏：常溫即將裝有花粉的冷凍管直接置于室溫下；常溫干燥，將花粉置于裝有硅膠的干燥器內(nèi)貯藏；低溫干燥，將花粉置于干燥器中再放在4 ℃低溫下貯藏；冷凍貯藏，將花粉置于-20 ℃的冰箱中貯藏[11-12]。觀察方法：常溫貯存的每天進(jìn)行觀察；低溫干燥的每3 d觀察1次；冷凍貯藏的每隔7 d觀察1次。花粉均采用亞甲基藍(lán)染色法，觀察時(shí)每個(gè)載玻片均統(tǒng)計(jì)3～5個(gè)視野，共統(tǒng)計(jì)100粒花粉，計(jì)算染色率作為花粉生活力，每種處理重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同檢測(cè)方法的比較

由于不同品種花粉形態(tài)大小、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的差異，花粉生活力差異也較大。同一品種采用不同的檢測(cè)方法檢測(cè)出的花粉生活力不同。圖1顯示，4個(gè)品種均以TTC檢測(cè)法的花粉生活力最低，歡笑以碘-碘化鉀和醋酸洋紅檢測(cè)出的花粉生活力最高，分別為62.0%和60.2%，差異不顯著；金獎(jiǎng)?wù)乱缘?碘化鉀檢測(cè)的生活力最高，為69.3。粉扇以亞甲基藍(lán)檢測(cè)的成活率最高，為72.0%，醋酸洋紅檢測(cè)的成活率為65.3，且兩者差異不顯著，緋扇以亞甲基藍(lán)檢測(cè)成活率最高，為78.2%，且與其它檢測(cè)結(jié)果差異顯著。結(jié)果表明，4個(gè)品種花粉的檢測(cè)不適宜用TTC，歡笑和金獎(jiǎng)?wù)逻m宜用碘-碘化鉀檢測(cè)，粉扇和緋扇適宜用亞甲基藍(lán)檢測(cè)。

2.2 不同貯藏方法的花粉生活力比較

2.2.1常溫貯藏

常溫貯藏條件下，花粉生活力每天進(jìn)行觀測(cè)，均選用亞甲基藍(lán)作為染色劑，對(duì)比常溫貯藏和常溫干燥貯藏對(duì)花粉生活力的影響。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 常溫貯藏花粉生活力變化情況

貯藏方法品種0d(%) 1d(%)2d(%)3d(%) 4d(%) 5d(%)6d(%)常溫歡笑51.349.736.718.28.76.72.0金獎(jiǎng)?wù)?6.740.732.020.414.37.31.3粉扇72.050.034.720.212.05.41.3緋扇78.256.036.024.214.76.23.0常溫干燥歡笑51.350.744.026.716.013.37.3金獎(jiǎng)?wù)?6.747.340.724.723.318.09.3粉扇72.050.046.024.719.312.76.0緋扇78.256.049.228.722.014.29.2

圖1 不同品種花粉生活力比較

利用反正弦轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本等方差t檢驗(yàn)，對(duì)常溫與常溫干燥貯藏方法下的花粉生活力進(jìn)行分析，得出t=-0.981，顯著性(雙尾)p=0.331>0.05所以，常溫與常溫干燥貯藏方法下花粉生活力沒(méi)有顯著差異。

2.2.2低溫冷藏

低溫冷藏條件下，花粉生活力每3 d觀察1次，連續(xù)觀察6次，具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 低溫冷藏下的花粉生活力

品種0d(%)3d(%)6d(%)9d(%)12d(%)15d(%)歡笑51.341.332.028.011.38.4金獎(jiǎng)?wù)?6.740.732.729.316.012.2粉扇72.048.024.026.012.07.4緋扇78.254.728.727.313.38.2

對(duì)上述數(shù)據(jù)經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行“分析一般線性模型-單變量”的雙因素方差分析，試驗(yàn)因素分別為品種(4水平)、時(shí)間(6水平)。

結(jié)果表明，品種間F值為1.038，顯著性p值為0.404<0.05，即品種間花粉生活力差異不顯著；不同貯藏時(shí)間間的F值為49.851，顯著性p值為0.000<0.05，即不同貯藏時(shí)間間存在顯著差異。S-N-K多重比較結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 貯藏時(shí)間的多重比較

貯藏時(shí)間(d)轉(zhuǎn)換后的平均數(shù)反轉(zhuǎn)換的成活率(%)053.703a65.0342.795b46.2632.764c29.3931.719c27.61221.219d13.11517.429d9.0

以貯藏時(shí)間為橫軸，對(duì)各品種的花粉生活力平均值作圖，如圖2所示，隨著低溫冷藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各品種的生活力均呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，貯藏15 d后各品種成活率降至10%左右，而4種花粉的生活力降幅差異并不明顯。

圖2 不同貯藏時(shí)間下各品種的生活力變化趨勢(shì)

2.2.3低溫冷凍

低溫冷凍條件下，花粉生活力每隔7 d觀察1次，連續(xù)觀察5次，具體結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 低溫冷凍下的花粉生活力

品種第0天(%)第8天(%)第15天(%)第23天(%)第30天(%)歡笑51.336.719.37.20金獎(jiǎng)?wù)?6.728.723.312.43.2粉扇72.030.724.08.30緋扇78.231.323.29.21.2

對(duì)上述數(shù)據(jù)經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換后，進(jìn)行“分析-一般線性模型-單變量”的雙因素方差分析，試驗(yàn)因素分別為品種(4水平)、時(shí)間(6水平)。

結(jié)果表明，品種間F值為1.082，顯著性p值為0.394<0.05，即品種間花粉生活力差異不顯著；不同貯藏時(shí)間間的F值為72.856，顯著性p值為0.000<0.05，即不同貯藏時(shí)間間存在顯著差異。S-N-K多重比較結(jié)果見(jiàn)表5。

以貯藏時(shí)間為橫軸，對(duì)各品種的估算邊際平均值作輪廓圖，如圖3所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各品種的生活力均呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)，而各品種成活率的趨勢(shì)線幾乎平行，代表品種間差異不顯著。

表5 不同貯藏時(shí)間的多重比較

貯藏時(shí)間(d)轉(zhuǎn)換后的平均數(shù)反轉(zhuǎn)換的成活率(%)053.703a65.0834.336b31.81528.263b22.42317.656c9.2304.149d0.5

圖3 不同貯藏時(shí)間各品種的生活力趨勢(shì)

2.2.4冷藏與冷凍處理的花粉生活力比較

以貯藏15 d的冷藏和冷凍2種處理方法的花粉生活力進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 冷藏與冷凍處理結(jié)果比較表

品種冷藏(%)冷凍(%)冷凍/冷藏歡笑8.419.32.3金獎(jiǎng)?wù)?2.223.31.9粉扇7.424.03.2緋扇8.223.22.8

從表6中可看出，貯藏15 d后，冷凍處理和冷藏處理下，各品種的花粉生活力明顯不同，總趨勢(shì)為冷凍貯藏的花粉生活力明顯高于冷藏處理的，冷凍處理的生活力是冷藏處理的生活力的2～3倍。

3 結(jié)論與討論

3.1 不同檢測(cè)方法的比較

試驗(yàn)中檢測(cè)的4個(gè)品種的花粉由于形態(tài)大小、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等的差異，花粉生活力差異也較大。同一品種采用不同的檢測(cè)方法檢測(cè)出的花粉生活力不同。4個(gè)品種均以TTC檢測(cè)法的花粉生活力最低，碘-碘化鉀、醋酸洋紅、亞甲基藍(lán)檢測(cè)的結(jié)果都較高，分析不同檢測(cè)方法的差異性，得出歡笑和金獎(jiǎng)?wù)逻m宜用碘-碘化鉀檢測(cè)，成活率最高，分別為62.0%和69.3%，粉扇和緋扇適宜用亞甲基藍(lán)檢測(cè)，成活率最高，分別為72.0%和78.2%。

3.2 不同貯藏方法的花粉生活力比較

常溫貯藏與常溫干燥貯藏方法下花粉生活力沒(méi)有顯著差異。但溫度條件對(duì)花粉生活力的影響較為顯著，低溫條件下能明顯延長(zhǎng)測(cè)試品種的花粉生活力，低溫冷凍條件下貯藏15 d，花粉生活力仍能超過(guò)20%，而低溫冷藏僅不足10%，常溫貯藏條件下無(wú)論常溫干燥還是直接的常溫貯藏6 d后降至10%以下，因此，貯藏溫度越低花粉的貯藏效果越好，究其原因是貯藏溫度降低，花粉呼吸強(qiáng)度和酶活性隨之降低[13-14]的緣故。

因此，在進(jìn)行月季雜交育種時(shí)，父母本花期不遇時(shí)可在低溫冷凍條件下貯藏父本花粉，以維持其旺盛的生活力。由于4種花粉的生活力差異不顯著，在父本花粉的選擇上可以直接根據(jù)育種目標(biāo)進(jìn)行親本的選擇。