喬志偉

(安順學(xué)院 資源環(huán)境與工程學(xué)院，貴州 安順 561000)

磷是作物生長的重要元素之一[1]，由于土壤具有較強(qiáng)的吸磷和固磷特性，土壤中有效磷含量和磷的有效性都較低。可溶性磷肥施入土壤后大部分被結(jié)合成難溶態(tài)磷酸鹽，從而導(dǎo)致磷肥利用率不高，作物缺磷狀況明顯。將土壤中難溶態(tài)磷酸鹽轉(zhuǎn)化成可被植物吸收的有效態(tài)磷是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。溶磷微生物對土壤磷素有效化有積極的作用，溶磷微生物可以將土壤中的難溶態(tài)磷酸鹽轉(zhuǎn)化為有效磷，并分泌促生物質(zhì)促進(jìn)作物生長。通過溶磷微生物的作用，可提高化學(xué)磷肥的利用率，增加土壤中有效磷含量，減少磷素累積，增加作物產(chǎn)量等[2-4]。具有這類特性的微生物包括細(xì)菌、真菌及放線菌[5-6]。不同類型以及同一類型、不同種類溶磷微生物的溶磷能力差異也很大[7-8]。研究表明，在溶磷微生物中，真菌的溶磷能力、遺傳的穩(wěn)定性等方面的特性都優(yōu)于細(xì)菌[9]。

目前關(guān)于溶磷真菌的研究較多[10-13]，但是關(guān)于貴州黃壤溶磷真菌的研究未見報(bào)道。黃壤作為我國西南地區(qū)典型的地帶性土壤，25.3%集中分布在貴州，其面積分別占貴州總面積、土壤面積的41.9%、46.4%，是貴州主要的農(nóng)業(yè)土壤類型，在貴州農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用[14]。該區(qū)域磷肥利用率較低，本試驗(yàn)通過選用溶磷真菌培養(yǎng)基(PVK)平板培養(yǎng)法，從貴州省安順市各縣區(qū)的農(nóng)田黃壤中分離篩選溶磷真菌，并進(jìn)一步研究其溶磷特性，為該區(qū)域溶磷真菌的研究提供菌株資源，并為其進(jìn)一步的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 試驗(yàn)土樣 土樣采集于貴州省安順市西秀區(qū)、開發(fā)區(qū)等周邊的農(nóng)田土壤，采樣地上種植作物為玉米及果樹、蔬菜等。采集表層土壤，去除植物根系、雜草等，在24 h內(nèi)完成溶磷細(xì)菌的分離和篩選。

1.1.2 培養(yǎng)基 PVK培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、Ca2(PO4)35 g、(NH4)2SO40.5 g、NaCl 0.2 g、KCl 0.2 g、MgSO40.1 g、FeSO4·7H2O 0.002 g、MnSO4·4H2O 0.002 g、0.4%溴酚藍(lán)(pH值6.7)10 mL、 酵母浸膏0.5 g、蒸餾水1 L，pH值調(diào)節(jié)到6。

解磷(NBRIP)液體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g、Ca2(PO4)35 g、 MgCl25 g、(NH4)2SO40.1 g、KCl 0.2 g、MgSO40.25 g、蒸餾水1 L，pH值調(diào)節(jié)到6。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)液體培養(yǎng)基：土豆200 g、蔗糖20 g、蒸餾水1 L，pH值調(diào)節(jié)到6。

固體培養(yǎng)基為分別在相應(yīng)液體培養(yǎng)基里加18～20 g瓊脂。

1.2 溶磷真菌的分離篩選

稱取10 g新鮮土樣置于盛有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中，并放入幾粒滅過菌的小玻璃珠，在150 r/min的恒溫振蕩箱中振蕩25 min，土壤懸濁液中土樣含量0.1 g/mL。用滅菌移液管吸取上述土壤懸濁液1 mL，加入9 mL的無菌水，將其稀釋10倍，使土壤懸濁液中土樣含量為0.01 g/mL。同此操作，將土壤懸濁液依次稀釋至土樣含量0.001、0.000 1 g/mL。將不同土樣含量的土壤懸濁液均勻涂布至PVK培養(yǎng)基上,在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d。觀察菌落, 根據(jù)菌落周圍是否產(chǎn)生黃色圈層來初步確定是否產(chǎn)生溶磷真菌,將溶磷真菌通過平板劃線分離法純化后保存于PDA固體培養(yǎng)基制成的試管斜面上。

1.3 溶磷真菌的菌落形態(tài)觀察和18s rRNA序列測定

觀察溶磷真菌在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和顏色。

18s rRNA序列測定：刮取少量在PDA液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h的菌絲體，轉(zhuǎn)移至液氮中進(jìn)行研磨，采取改良后的CTAB法進(jìn)行DNA的抽提[15]，以ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和 ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′為引物對基因組進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物回收并測序，將序列與Blast數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對分析，確定菌株種屬。

1.4 溶磷真菌溶磷能力的測定

1.4.1 菌株的活化及培養(yǎng)液有效磷含量測定 將分離純化后的菌株在PDA液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)96 h后接入無菌水中，在振蕩器上充分振蕩搖勻，制成含有真菌孢子的懸液，待菌數(shù)大于105CFU/mL后備用。將上述真菌孢子懸濁液按照1%(體積比)的接種量接入含有100 mL已滅菌的NBRIP液體培養(yǎng)基的三角瓶中，在恒溫振蕩箱(30 ℃、150 r/min)中振蕩培養(yǎng)7 d后，在離心機(jī)(4 ℃、 6 000 r/min)上離心10 min，取上清液測定有效磷含量以及pH值。

1.4.2 不同碳源、氮源菌株溶磷能力測定 在NBRIP液體培養(yǎng)基中，分別以蔗糖、淀粉、乳糖、甘露醇等量代替葡萄糖作為碳源，培養(yǎng)基的其他成分不變，接菌培養(yǎng)并測定培養(yǎng)液中的有效磷含量，以確定菌株的最佳碳源。之后以KNO3、NH4Cl、NH4NO3、NaNO3為氮源等量替換(NH4)2SO4，接菌培養(yǎng)并測定培養(yǎng)液中的有效磷含量，以此確定菌株的最佳氮源。

1.4.3 溶磷真菌對FePO4、AlPO4溶解能力的測定 在NBRIP液體培養(yǎng)基中，分別用FePO4、AlPO4等量替換Ca3(PO4)2，滅菌后按照1%(體積比)的接種量接種活化后的溶磷真菌孢子懸濁液，在恒溫振蕩箱(30 ℃、150 r/min)中振蕩培養(yǎng)。分別于第1、2、3、4、5、6、7天取發(fā)酵液離心后，取上清液測定有效磷含量和pH值，并設(shè)置不接菌處理作為空白對照，每個(gè)處理重復(fù)3 次。

1.4.4 溶磷真菌培養(yǎng)條件優(yōu)化 選取對真菌培養(yǎng)條件影響較大的4個(gè)因素[碳源、氮源、培養(yǎng)液初始pH值、接種量(體積比)]，其中，碳源為葡萄糖、氮源為(NH4)2SO4，采用4因素3水平正交試驗(yàn)表L9(34)研究最佳培養(yǎng)條件。將菌株懸濁液接種在相應(yīng)的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)7 d后測定培養(yǎng)液有效磷含量，每個(gè)處理重復(fù)3次，試驗(yàn)因素及水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素和水平

共設(shè)9組試驗(yàn)，Ki1、Ki2、Ki3中i代表4個(gè)因素[碳源(A)、氮源(B)、培養(yǎng)液初始pH值(C)、接種量(D)]，1、2、3分別代表3個(gè)水平。KA1、KB1、KC1、KD1分別表示在A、B、C、D因素下水平為1的試驗(yàn)組有效磷含量之和，同理Ki2、Ki3分別表示在不同因素下，水平為2、3的試驗(yàn)組有效磷含量之和。Mi1、Mi2、Mi3分別是3次平行試驗(yàn)的Ki1、Ki2、Ki3的均值，其值大小反映同因素、不同水平對菌株溶磷能力的影響。極差(Ri)為相應(yīng)Mi1、Mi2、Mi3中最大值與最小值的差，Ri值越大，表明該因素對菌株特性影響越大。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003及SAS V8.1對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷真菌的篩選及溶磷能力

對采集的土樣經(jīng)過分離、初篩，得到具有明顯溶磷圈的真菌菌株共8株，將其分別編號為G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8，各菌株培養(yǎng)液有效磷含量見表2。8株溶磷真菌對Ca3(PO4)2都具有較強(qiáng)的溶解能力，各菌株培養(yǎng)液有效磷含量在287.53～533.85 mg/L，均顯著高于不接菌的空白(CK)。

表2 溶磷真菌培養(yǎng)液有效磷含量

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters indicate significant differences (P<0.05), the same below.

對分離篩選出的8株溶磷真菌進(jìn)一步純化，發(fā)現(xiàn)其中有7株菌株在PDA固體培養(yǎng)基平板上生長不好或者溶磷能力顯著下降，只有G8長勢好且溶磷能力保持穩(wěn)定。G8在PDA固體平板培養(yǎng)基上的菌落呈現(xiàn)圓形、緊密、灰綠色，菌落的背面呈現(xiàn)淡棕色。

以G8 DNA為模板，利用18S rDNA 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物后，將G8的測序結(jié)果采用Blast軟件與Genbank 中的序列進(jìn)行比對，G8與Penicilliumsp.(HQ704712.1)及Penicilliumsp.(FJ647577.1)的序列同源性均大于99%，鑒定其屬于青霉菌(Penicilliumsp.)，其系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

本試驗(yàn)以G8作為對象，研究該菌株在不同難溶態(tài)磷源、不同碳源和氮源條件下的溶解能力以及最佳培養(yǎng)條件。

2.2 不同碳源、氮源對G8溶磷能力的影響

由表3可知，不同碳源條件下，G8對Ca3(PO4)2的溶解能力各不相同，培養(yǎng)液中有效磷含量在177.07～534.24 mg/L。在以葡萄糖為碳源時(shí)，G8培養(yǎng)液有效磷含量最高，為 534.24 mg/L，與其他碳源相比，其溶磷能力顯著增強(qiáng)。以淀粉為碳源時(shí)，G8培養(yǎng)液有效磷含量最低，僅為177.07 mg/L，相應(yīng)，G8的溶磷能力最低。不同碳源條件下G8的溶磷能力依次為葡萄糖>甘露醇>蔗糖>乳糖>淀粉。

圖1 溶磷真菌G8的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of phosphorus-soluble fungus G8

表3 不同碳源、氮源條件下G8培養(yǎng)液有效磷含量

不同氮源條件下G8溶磷能力依次為(NH4)2SO4>NH4NO3>NH4Cl>NaNO3>KNO3。以(NH4)2SO4為氮源時(shí)，G8溶磷能力最高，為534.24 mg/L。以NH4NO3、NH4Cl、KNO3、NaNO3為氮源時(shí)，G8培養(yǎng)液中有效磷含量分別為492.38、413.10、356.32、371.26 mg/L?？梢?，以銨態(tài)氮為氮源時(shí)，G8的溶磷能力要顯著高于硝態(tài)氮。

2.3 G8對難溶態(tài)磷酸鹽的溶解能力

由圖2可知，以AlPO4為難溶態(tài)磷源時(shí)，培養(yǎng)液中有效磷含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢，并在第6天達(dá)到最大，為589.74 mg/L。培養(yǎng)液pH值總體呈下降的趨勢，同時(shí)在第6天達(dá)到最低，為1.35。培養(yǎng)液中有效磷含量和pH值的決定系數(shù)(R2)=0.84，呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

圖2 G8對AlPO4的溶解動(dòng)態(tài)及培養(yǎng)液pH值變化Fig.2 Dissolution dynamics of aluminum phosphate of G8 and change of pH value in culture solution

由圖3可知，以FePO4為難溶態(tài)磷源時(shí)，培養(yǎng)液中有效磷含量表現(xiàn)出先增長后略有下降的趨勢。在第5天培養(yǎng)中有效磷含量達(dá)到最大，為201.38 mg/L。同時(shí)，培養(yǎng)液pH值達(dá)到最低，為1.08。培養(yǎng)液中有效磷含量與pH值的決定系數(shù)(R2)=0.96，呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

圖3 G8對FePO4的溶解動(dòng)態(tài)及培養(yǎng)液pH值變化Fig.3 Dissolution dynamics of ferric phosphate of G8 and change of pH value in culture solution

2.4 G8培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

表4中1～9分別代表1～9組試驗(yàn)。由表4可知，MA3>MA2>MA1，MB1>MB2>MB3，MC1>MC2>MC3，MD1>MD2>MD3，由此確定G8最適培養(yǎng)條件為葡萄糖含量15 g/L、(NH4)2SO4含量0.067 g/L、培養(yǎng)液初始pH值6、接種量1%(體積比)。4個(gè)因素的R值分別為300.73、37.36、36.92、7.68，對G8溶磷特性影響大小依次為碳源>氮源>培養(yǎng)液初始pH值>接種量。

表4 G8培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果

確定最佳培養(yǎng)條件后，在NBRIP液體培養(yǎng)基中，加入葡萄糖15 g/L、(NH4)2SO40.067 g/L，Ca3(PO4)25 g/L、MgCl25 g/L、KCl 0.2 g/L、MgSO40.25 g/L，調(diào)節(jié)初始pH值為6，滅菌后按照1%(體積比)的接種量接種G8懸濁液。此條件下培養(yǎng)并測定培養(yǎng)液有效磷含量為604.59 mg/L，與未優(yōu)化前的534.24 mg/L相比增加了70.35 mg/L，G8的溶磷能力增強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過PVK平板分離法從貴州安順黃壤農(nóng)田作物根際土壤中分離篩選出8株溶磷真菌。經(jīng)過多次的分離純化后得到1株溶磷能力較強(qiáng)的真菌菌株G8，結(jié)合該菌株菌落形態(tài)特征和18S rRNA基因序列分析確定其為青霉菌(Penicilliumsp.)。

土壤中存在的溶磷微生物種類繁多，由于土壤類型、作物類型及其他環(huán)境因素不同，導(dǎo)致不同的溶磷微生物溶解難溶態(tài)磷的機(jī)制也不盡相同[16]。解磷微生物通過代謝，分泌低分子質(zhì)量有機(jī)酸類物質(zhì)是重要的機(jī)制之一[17]。低分子質(zhì)量有機(jī)酸和鐵、鋁、鈣等離子發(fā)生螯合反應(yīng)，使難溶態(tài)或不溶態(tài)磷轉(zhuǎn)化為有效態(tài)磷。有研究表明，溶磷微生物通過分泌有機(jī)酸對培養(yǎng)液的酸堿度產(chǎn)生影響，培養(yǎng)液有效磷含量與pH值有顯著的相關(guān)性[15]。同時(shí)也有其他研究表明，培養(yǎng)液有效磷含量與pH值之間沒有必然的聯(lián)系[18-19]。本試驗(yàn)中，AlPO4和FePO4培養(yǎng)液有效磷含量與G8發(fā)酵液pH值之間呈顯著負(fù)相關(guān)，說明G8主要通過分泌有機(jī)酸來溶解難溶態(tài)磷，并導(dǎo)致培養(yǎng)液pH值下降。G8產(chǎn)生的有機(jī)酸越多，pH值就越低，難溶態(tài)磷溶解量就越多，培養(yǎng)液中有效磷含量也越高。

培養(yǎng)基中碳源、氮源的種類對微生物溶磷特性的影響較大，碳源、氮源通過影響有機(jī)酸產(chǎn)生的種類及濃度進(jìn)而影響菌株的溶磷能力[20]。不同菌株對碳源和氮源的利用率也不盡相同，張建峰等[21]研究表明，以蔗糖為碳源時(shí)，溶磷真菌疣藍(lán)狀菌的溶磷量較高。本試驗(yàn)中，不同碳源條件下，以葡萄糖為碳源時(shí)G8培養(yǎng)液有效磷含量最高，為534.24 mg/L，以淀粉為碳源時(shí)G8培養(yǎng)液有效磷含量最低，僅為177.07 mg/L。不同碳源條件下，G8的溶磷能力依次為葡萄糖>甘露醇>蔗糖>乳糖>淀粉，研究結(jié)果與張建峰等[21]的不一致。這可能是因?yàn)槿芰渍婢姆N類和篩選區(qū)域不同，造成其對不同碳源的利用表現(xiàn)出較大差異。不同氮源條件下，G8培養(yǎng)液中有效磷含量在356.32～534.24 mg/L，以(NH4)2SO4為氮源時(shí)G8培養(yǎng)液有效磷含量最高，為 534.24 mg/L。

微生物所處的環(huán)境對其生長、繁殖、代謝活動(dòng)都會(huì)產(chǎn)生較大的影響，研究最適的環(huán)境條件對于微生物的應(yīng)用有重要意義。微生物在培養(yǎng)條件優(yōu)化后可以顯著增加某一些方面的特性和能力[22-24]。本試驗(yàn)中，通過對G8培養(yǎng)條件優(yōu)化，培養(yǎng)液中有效磷含量達(dá)到604.59 mg/L，比優(yōu)化前增加了70.35 mg/L，培養(yǎng)條件優(yōu)化后G8的溶磷能力增強(qiáng)。