(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 ， 長沙 410081； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所， 北京 100081)

種子的老化或劣變是指隨著種子貯藏時間的延長而發(fā)生的不可逆的種子活力或萌發(fā)力下降的過程。大量研究表明，種子老化過程中，細(xì)胞膜磷脂中的多不飽和脂肪酸在活性氧(ROS)的作用下發(fā)生脂質(zhì)過氧化，其終產(chǎn)物包括一些小分子醛類物質(zhì)，丙二醛(MDA)和4-羥基壬烯醛(4-HNE)等，會產(chǎn)生細(xì)胞毒害作用，影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和正常生理活動甚至導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[1]。

大豆種子含有大約40%的蛋白質(zhì)和20%的油脂，屬短命種子[2]，在儲藏過程中容易老化或劣變，導(dǎo)致種子質(zhì)量下降，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大損失。由于種子自然老化歷時長，因此，通常采用人工加速老化法模擬自然老化來預(yù)測大豆種質(zhì)的儲藏耐性及探討有關(guān)的生理生化機(jī)制[4-9]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，與未老化種子相比，自然老化的水稻種子中4-HNE含量顯著升高，可作為水稻種子老化早期的預(yù)警指標(biāo)[3]，但迄今鮮見對大豆中4-HNE等小分子醛類的研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)比較了大豆種子在人工老化和自然老化過程中，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的MDA和4-HNE等的含量變化、4-HNE積累的組織特異性及其合成和清除相關(guān)的基因表達(dá)調(diào)控的差異，以期為生產(chǎn)實(shí)踐中監(jiān)控大豆種子活力提供合適的生理生化指標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及處理

大豆[Glycinemax(L.) Merr.]品種“中豆27”，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

大豆種子置于 25 ℃、75% RH條件下平衡1周, 測得種子萌發(fā)率為99%，含水量為11.6%。 人工老化處理：種子用鋁箔袋密封包裝，于40 ℃老化箱中分別人工老化8，12，19 d，種子萌發(fā)率分別降至80%、50%和7%；自然老化處理：種子用鋁箔袋密封包裝,于室溫條件下分別貯藏60，75，150 d，種子萌發(fā)率分別降至80%、50%和4%。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1電導(dǎo)率檢測

每個處理選取大小一致且無損傷的種子10粒, 5次重復(fù)。用去離子水沖洗3次，濾紙吸干種子表面水分后裝于潔凈試管中，加入25 mL去離子水，25 ℃保溫，用電導(dǎo)儀測定種子浸泡液的初始電導(dǎo)率(a1)，然后分別測定種子浸泡6，12，18 h和 24 h的浸泡液電導(dǎo)率 (a2)，再將裝有種子連同浸泡液的試管置于100 ℃水浴中15 min，取出冷卻至25 ℃，再次測定種子浸泡液電導(dǎo)率(a3)。

表1 用于檢測大豆老化種子胚中4-HNE合成及清除相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄水平的引物

途徑酶基因名稱基因功能正向引物(5′-3′)反向引物(5′-3′)合成 15-脂氧合酶LOX1.1種子亞油酸13S-脂氧合酶-1GGGCCGTAGTGTCTCCCTTCTGCAGACTCTCCTGCTCCCA 氫過氧化物裂解酶LOC100810890 類9二乙烯醚合酶GCGCAGGGTGGGTTAGTGAACTGATCCAACGCCCGGAGAC 烯醛加氧酶LOX1.2 脂氧合酶-2ATGGATGACCGATGAAGAAAATAACCTCCGACTTGCTALOX1.3 脂氧合酶-3ATTGAGGATCCATCGTGCCCGCAGGCTTGGAGTTCAGGATLOX1.4 種子亞油酸9S-脂氧合酶GGCCAAGGCGTCAGCTTAGTATCCTGCCTTGCTCCCAACG 環(huán)化酶LOC100802743 類環(huán)化酶2GGGCAAAGCATGGAAGTGACATGTGCCACAGCTCCTTCAALOC100799842未標(biāo)記蛋白 GCTGTCCGTTGGAGGTGCTAGTGTCACTGCCGTGTTTGCCLOC 100800915可能的環(huán)化酶4AAAGGAAAATTCTGCACGCAAAACTTCGCCACCCTTGAACALOC100800378可能的環(huán)化酶5GCTTCCTCTCATGCCTCAGAAAAGGAAGCCAAGATCCCATTCCLOC100306686未標(biāo)記蛋白 GCAAGCATGGAAGTGACTCTGGTGCTAGCAAGCCATCCAGCGTALOC106794499 可能的環(huán)化酶4CGACAGGAACCACGATGGCAGTCAAAGTACCGGGCGGGTTLOC100813066環(huán)化酶2TTGGCTGGGCTGCCAGTAAGTCAAAGCAACGCCTCACAGC清除 醇脫氫酶LOC100783318 醇脫氫酶AGGTAGCTCCACCACAGGCAGCACATGATCACCGGGCTTGLOC100775490 類2環(huán)化酶脫氫酶1TCATCGTCGTGGCTTTGTGAGAAGGGTGAGAGATGCCACTLOC100800668類醇脫氫酶1ACTACAAACCACGCACCGATCATCTCACTCTTGCATGCGGLOC100783858 ADH2醇脫氫酶家族蛋白質(zhì)CGCACTGACCTTCCTTCTGTTGCATCTGATGGACTCCCCTLOC547658 醇脫氫酶1TTCAGGGATTGTGGAGAGCGCACTCAGCATAACACCCCTGT 醛脫氫酶LOC100803104 醛脫氫酶家族3成員H1ACTGAGCCACATTAGCGTTGATATATACTACACGAGAGAGACGCLOC100811186 醛脫氫酶家族7成員A1TTCCCCATCCCATGTGTGTCCCAATGTTGGAGGAGCCCAALOC100811501 醛脫氫酶家族2成員B4ATGCGAGCACTGAGGGTTGGACCCTTCTCCCTGCCAATGCLOC100782019醛脫氫酶家族2成員B7TGTGCTGAGCAGAGATGTCACCCTTTACCCCATTGTGAACG 細(xì)胞色素P450GLYMA11G06381類細(xì)胞色素P450 82A3TCAAATCGTGGTTTGTCGTCTACCACGGGTTTTCACGATCAGLYMA17G01110類細(xì)胞色素P450 71D8ACTGGCATGATGCAGACAGCCCCGGGCACATTCTCCTTCCGLYMA19G32880 類3,9-二羥基紫檀酸6A單加氧酶TTCCGAGGGCTAACCCCATATCTCTCTTTCACTGGGTATTGATGAGLYMA03G29950類細(xì)胞色素P450 93A1ACTCTGCATGTCCGAGCTTCTGACTCAGCGTCATTCTGGATGLYMA07G05820 細(xì)胞色素P450 78A3TGTGAAATGGCTAACCCGCTGGCCATGCACCTGCTACTTA 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GLYMA15G40260類3谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶3TGGCAGACGAGGTTGTTCTAGGGCAAGATGGGAGCTTTGTGLYMA07G16810可能的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶CCCTTTTGTGCACGAAGTCCACAGCAATAACTCAACAAGACACAGLYMA07G16830可能的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶TCAAAGCCCGCTATGAAAGTCTACTGAAATGGCCAAAACGAAA

相對電導(dǎo)率(%)=[(a2-a1)/(a3-a1)]×100。

1.2.2丙二醛檢測

采用王愛國等[10]的TBA比色法。取0.1 g(干重，DW)的大豆胚軸，每個處理3次重復(fù)。

MDA含量(μmol·g-1)=C×(V/W)。

1.2.34-HNE的提取及檢測

采用Fu SZ[4]的方法。

1.2.44-HNE免疫組化染色

大豆種子吸脹20 h，胚軸經(jīng)脫水，透明，浸蠟，包埋后連續(xù)切片獲 8μm厚的薄片，切片于50 ℃烘烤后經(jīng)二甲苯脫蠟，70%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，100%乙醇2次，逐級脫水，復(fù)水后加5%BSA封閉20 min，加入兔抗4-HNE 抗體(1∶150)，室溫孵育90 min，滴加二抗和SABC-AP，BCIP/NBT 顯色，脫水透明后封片觀察。每個處理10次重復(fù)。用封閉液代替一抗作陰性對照，4-HNE處理過的切片染色結(jié)果作陽性對照。

1.2.54-HNE基因表達(dá)分析

每個處理剝?nèi)∥?0 h種子胚軸30顆，3次重復(fù)。送北京源宜基因科技股份有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。Ayala A 等[11]報(bào)道的大豆的8類29個4-HNE合成及清除相關(guān)酶的基因，利用Primer 5(Premier Biosoft,Palo Alto,CA,USA)設(shè)計(jì)RT-PCR引物(表1)，由北京三博遠(yuǎn)志公司進(jìn)行引物合成。用北京天根公司的RNA提取試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行總RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄；用ABI 7500 fast Real Time PCR (Applied Biosystems, USA)和Tiangen SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)進(jìn)行qRT-PCR，以大豆act11.1基因?yàn)閮?nèi)參基因。PCR產(chǎn)物送北京源宜基因科技股份有限公司測序。

1.2.6數(shù)據(jù)分析

每個處理3次重復(fù)的平均值，用PASW statistics 18軟件和One-way ANOVA軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。處理間p<0.05時視為具有顯著性差異。免疫組化染色利用 Image Pro Plus 軟件(版本 6.0)進(jìn)行半定量統(tǒng)計(jì)分析。用Graphpad 5軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子老化過程中種子浸泡液的電導(dǎo)率變化

種子浸泡液電導(dǎo)率可以表示細(xì)胞膜的完整性。圖1 結(jié)果表明，未老化大豆種子浸泡0～24 h期間相對電導(dǎo)率保持在20%以下；老化后種子相對電導(dǎo)率則隨老化程度而增大，說明老化處理導(dǎo)致細(xì)胞膜完整性下降；相同萌發(fā)率的自然老化種子浸泡24 h，其相對電導(dǎo)率高于人工老化種子17%～23%，表明自然老化細(xì)胞膜完整性受損更嚴(yán)重。

2.2 種子老化過程中MDA含量的變化

相比未老化種子，人工老化至萌發(fā)率為80%、50%和7%的種子的MDA含量分別增加了3.2%、20.6%和22.4%(圖2 a)；而自然老化至萌發(fā)率為80%、50%和4%的種子MDA的含量分別增加了5.4%、18.5%和12.2%(圖2 c)，表明人工老化和自然老化均引起MDA含量的增加。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，MDA含量與萌發(fā)率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，說明膜脂氧化越嚴(yán)重，種子活力越低。未老化種子以及人工老化和自然老化至萌發(fā)率為80%和50%的種子吸脹后，MDA含量均比未吸脹種子明顯下降(圖2 b)，說明萌發(fā)率在50%以上的種子吸脹時可部分抑制或修復(fù)脂質(zhì)過氧化作用。但人工老化至萌發(fā)率為7%的種子吸脹后，MDA含量比未吸脹種子高，自然老化至4%的種子吸脹后的MDA含量與未吸脹種子相近(圖2 c、d)，說明老化程度嚴(yán)重的種子吸脹時可能已失去修復(fù)能力。

注：AA為人工老化；NA為自然老化； 80%、50%、7%和4%為萌發(fā)率。圖1 大豆種子浸泡液的電導(dǎo)率變化

2.3 種子老化過程中4-HNE的含量變化

相比未老化種子，人工老化至萌發(fā)率為80%、50%和7%的種子的4-HNE含量分別增加了19.2%、16.5%和88.0%(圖3 a)，表明人工老化加劇了脂質(zhì)過氧化。自然老化至萌發(fā)率為80%和50%的種子中，4-HNE含量分別下降了49.6%和32.8%，而自然老化至萌發(fā)率為4%的種子的4-HNE含量上升了33.6% (圖3 c)。表明不同老化條件下種子的4-HNE的合成與代謝可能存在差別。對比不同老化處理至相同萌發(fā)率的種子，發(fā)現(xiàn)人工老化條件下4-HNE積累量更高，說明人工老化脂質(zhì)過氧化程度更嚴(yán)重。

老化至不同萌發(fā)率的種子吸脹后的4-HNE含量變化規(guī)律與未吸脹時不同，且自然老化和人工老化的變化模式也有差異(圖3)，表明4-HNE在自然老化和人工老化處理的種子中，其合成與代謝可能存在差異，這種差異可能與4-HNE的揮發(fā)性和不穩(wěn)定性[12]有關(guān)，或者是自然老化和人工老化條件下細(xì)胞膜完整性變化不一致，也可能是檢測4-HNE時的人為誤差導(dǎo)致，原因需要進(jìn)一步分析。

注：AA為人工老化；NA為自然老化，0 h和20 h表示吸脹0 h和20 h。圖中不同小寫字母表示各處理間差異顯著(p<0.05)。下同。圖2 老化對大豆種子MDA含量的影響

圖3 老化對大豆種子4-HNE含量的影響

2.4 4-HNE免疫組化染色結(jié)果

以吸脹20 h的胚軸為材料，采用免疫組化染色的方法，檢測老化過程中4-HNE積累的組織表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著種子活力下降，切片的染色強(qiáng)度加深且面積擴(kuò)大(圖4)。相比未老化種子，人工老化至萌發(fā)率為80%、50%和7%種子切片染色強(qiáng)度分別增加了50.1%、122.7%和212.1%；但自然老化至萌發(fā)率為80%種子的切片染色強(qiáng)度明顯高于50%萌發(fā)率的種子(圖4)，也顯著高于萌發(fā)率為80%的人工老化種子。該結(jié)果與圖3的4-HNE在不同處理之間的含量差異存在明顯的非相關(guān)性，其原因有待進(jìn)一步分析。

圖4 人工老化和自然老化的大豆種子胚4-HNE免疫組化染色結(jié)果

2.5 種子老化過程中4-HNE代謝相關(guān)基因表達(dá)分析

參與4-HNE合成的代謝途徑有4類酶12個基因，參與其清除的代謝途徑有4類酶17個基因。轉(zhuǎn)錄組測序發(fā)現(xiàn)，與未老化的種子相比，隨著老化時間的延長，差異表達(dá)的基因數(shù)量逐漸增加(表2)。對4-HNE代謝途徑相關(guān)基因的分析發(fā)現(xiàn)，相同基因在不同老化方式老化至相同萌發(fā)率水平的種子中表達(dá)模式不同(表3)，說明不同老化方式處理的種子中4-HNE的代謝可能存在差異。

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)引物，檢測了4-HNE的合成和代謝相關(guān)的29個基因的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn),老化誘導(dǎo)了4-HNE的合成，同時啟動清除機(jī)制的加強(qiáng)，說明老化影響了4-HNE合成和清除的酶系統(tǒng)。

表2 大豆種子中4-HNE合成和清除相關(guān)的差異表達(dá)基因轉(zhuǎn)錄本的比較

Group1_VS_Group2基因數(shù)/個差異基因數(shù)/個上調(diào)數(shù)/個下調(diào)節(jié)數(shù)/個CK_VS_AA8059000CK_VS_AA5055312CK_VS_AA764251312CK_VS_NA8054523CK_VS_NA5053943CK_VS_NA45918108

注：CK為未老化的種子；AA為人工老化；NA為自然老化；萌發(fā)率分別為80%、50%、7%、4%。

對比2種老化方式種子發(fā)現(xiàn)，4-HNE合成途徑中萌發(fā)率為80%和50%的種子表達(dá)顯著上升的基因，在人工老化中分別有5個和7個，在自然老化中分別有4個和7個。LOC100800915和LOC106794499基因在人工老化至種子萌發(fā)率為7%時，在自然老化老化至種子萌發(fā)率為80%時表達(dá)量顯著上升；LOX1.2，LOX1.3和LOC100813066基因在人工老化至種子萌發(fā)率7%時，自然老化至種子萌發(fā)率50%表達(dá)量顯著上升(圖5 A和圖6 A)。4-HNE清除代謝途徑中LOC100800668、LOC100783858、LOC100811186、LOC100782019、GLYMA11G06381、GLYMA17G01110、GLYMA19G32880、GLYMA15G40260和GLYMA07G16830等 9個基因在人工老化種子至萌發(fā)率80%時表達(dá)顯著上升，LOC100783318、LOC100800668、LOC100811501、LOC10072019、GLYMA19G32880、GLYMA03G29950和GLYMA07G16830等7個基因在自然老化種子至萌發(fā)率80%時表達(dá)顯著上升，其中LOC100800668、LOC100782019、GLYMA19G32880和GLYMA07G16830等4個基因在人工老化和自然老化種子中表達(dá)模式相近，人工老化比自然老化表達(dá)量大約2倍有3個，人工老化比自然老化表達(dá)量大約3倍有4個；人工老化種子中有16個基因在萌發(fā)率為50%時表達(dá)顯著上升，自然老化只有14個，其中人工老化比自然老化表達(dá)量大約2倍有3個，說明自然老化萌發(fā)率為80%和50%種子4-HNE清除能力比人工老化弱。清除相關(guān)酶的差異更明顯，萌發(fā)率為80%和50%時，alcohol-dehydrogenase和glutathiones-transferase在人工老化種子表達(dá)大于自然老化，尤其是glutathiones-transferase在人工老化種子表達(dá)是自然老化約2倍。cytochrome P 450在人工老化萌發(fā)率80%種子表達(dá)是自然老化約2倍。aldehyde dehydrogenase在自然老化中略高(圖5 B和圖6 B)。說明老化方式影響了4-HNE合成和清除的酶系統(tǒng)(見圖5和圖6)。

表3 與4-HNE合成和清除代謝相關(guān)的調(diào)控基因

途徑酶基因ID 基因名稱 基因功能變化模式人工老化自然老化合成15-脂氧合酶glyma13g347600LOX1.1種子亞油酸13S-脂氧合酶-1↓↑氫過氧化物裂解酶glyma11g122700LOC100810890 類9二乙烯醚合酶↓↑烯醛加氧酶glyma15g026300LOX1.3 脂氧合酶-3↑↓↑↓環(huán)化酶glyma09g124200LOC100800915可能的環(huán)化酶4↓↓glyma09g124700LOC106794499可能的環(huán)化酶4↑↓↓glyma19g247500LOC100813066 脂氧合酶-2↑↓清除醇脫氫酶glyma14g121200LOC100800668類醇脫氫酶1↑↓↓glyma04g240800LOC100783858 ADH2醇脫氫酶家族蛋白質(zhì)↓↑醛脫氫酶glyma15g178400LOC100811186家族7成員A1↓↑細(xì)胞色素P450glyma17g007200GLYMA17G01110類細(xì)胞色素P450 71D8↑↓↑↓glyma19g146800GLYMA19G32880 類3,9-二羥基紫檀酸6A單加氧酶↑↑↓glyma03g143700GLYMA03G29950類細(xì)胞色素P450 93A1↓—glyma07g052300GLYMA07G05820 細(xì)胞色素P450 78A3↓↑谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶glyma07g139700GLYMA07G16810可能的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶↑↓↓glyma07g139800GLYMA07G16830可能的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶—↑

注：“↑”，上調(diào)；“↓”，下調(diào)；↑↓，上調(diào)和下調(diào)；“—”，沒有差異。

3 討 論

3.1 老化處理加劇了大豆脂質(zhì)過氧化和基因表達(dá)差異

大豆是高蛋白、高油分種子，膜脂中高含量脂肪酸很容易發(fā)生過氧化作用產(chǎn)生活躍的自由基而造成膜的損傷，使細(xì)胞正常生理活動受到抑制[13-14]。本研究的結(jié)果表明，隨著種子老化，其浸泡液相對電導(dǎo)率逐漸增加(圖1)，表明老化破壞了大豆胚軸細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，這與董發(fā)才[15]的結(jié)果一致。MDA是衡量種子老化過程中脂質(zhì)過氧化程度的一個重要指標(biāo)[16]，4-HNE則是生物活性最高的脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物[3]。研究表明，老化導(dǎo)致MDA和4-HNE的含量上升，但MDA含量變化不如4-HNE顯著，說明可能4-HNE與種子老化和脂質(zhì)過氧化損傷關(guān)系更為密切[4]。轉(zhuǎn)錄組表明，隨著老化時間的延長，4-HNE代謝相關(guān)基因表達(dá)差異越大。LOX1.4，LOC100306686基因在人工老化和自然老化種子中的表達(dá)均隨種子活力下降而下降，說明老化后這2個基因的表達(dá)可能被抑制；另一方面，種子老化后4-HNE合成和清除大多數(shù)基因均隨萌發(fā)率降低而表達(dá)量上升，老化影響了4-HNE合成和清除的酶系統(tǒng)。

3.2 人工老化和自然老化對大豆種子中MDA和4-HNE含量的影響存在差異

研究表明，人工老化與自然條件下老化的機(jī)制是一致的，只是劣變的速度大大提高了[14,17-24]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，浸泡24 h的自然老化種子比相同萌發(fā)率的人工老化種子的相對電導(dǎo)率高，表明自然老化細(xì)胞膜完整性受損更嚴(yán)重，與李穩(wěn)香等[25]的研究結(jié)果不同。相同萌發(fā)率的人工老化種子和自然老化種子中MDA含量沒明顯差異；但4-HNE含量在萌發(fā)率為50%和80%的人工老化種子高于自然老化種子，說明人工老化與自然老化種子中4-HNE的形成和清除機(jī)制可能存在差異。

4 結(jié) 論

大豆-種子老化過程中發(fā)生脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致MDA和4-HNE等小分子醛類物質(zhì)積累，膜完整性破壞，相對電導(dǎo)率上升，這些皆可作為大豆種子老化的指標(biāo)。人工老化引起的脂質(zhì)過氧化損傷程度大于自然老化，自然老化種子的吸脹修復(fù)能力小于人工老化種子。老化和不同老化方式都對4-HNE合成和清除酶系統(tǒng)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致4-HNE在老化至不同萌發(fā)率水平和不同老化處理至同一萌發(fā)率水平的種子中積累存在差異。