張子明 柴國靜 宋淑霞

(河北醫(yī)科大學免疫教研室，河北省重大疾病免疫機制及干預實驗室,石家莊050017)

巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中重要的基質(zhì)細胞，約占腫瘤總重量的一半，被稱為腫瘤相關(guān)巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAM)[1]。TAM是一個不均一的群體，既有促腫瘤作用的M2型巨噬細胞，也有抑制腫瘤的M1型巨噬細胞。由于腫瘤微環(huán)境存在有利于M2型巨噬細胞分化因素，多數(shù)腫瘤的微環(huán)境中存在M2型巨噬細胞，對腫瘤的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移起著關(guān)鍵作用。因此，研究腫瘤微環(huán)境中誘導TAM極化的因素、TAM對腫瘤治療的影響，對提高腫瘤療效意義重大。

1 腫瘤相關(guān)巨噬細胞的極化

多種組織或器官都有單核巨噬細胞分布，如腸、肝臟、肺、皮膚、腹膜和心臟，不同組織定居的巨噬細胞表型各異、功能也不同，因此，可塑性和多樣性是單核巨噬細胞的重要特征[2]。研究表明，不同組織的巨噬細胞受微環(huán)境中不同信號的誘導，發(fā)揮不同的功能，如微生物、組織損傷、細胞因子及微生物代謝產(chǎn)物均可活化單核巨噬細胞。仿照Th1/Th2細胞的分類方法，將被不同激活物激活、發(fā)揮不同功能的單核巨噬細胞也分為M1和M2兩個極化的群體。M1和M2產(chǎn)生細胞因子的能力不同，M1產(chǎn)生高水平的IL-12、CXCL9和CXCL10，低水平的IL-10、CCL17和CCL22；而M2細胞產(chǎn)生的IL-10、CCL17和CCL22水平較高。

1.1M1型巨噬細胞的極化與激活 M1型巨噬細胞是一種對微生物和腫瘤細胞具有殺傷活性的效應細胞。它典型的特征為高抗原呈遞、高產(chǎn)IL-12、IL-23及NO，高表達MHCⅠ類和MHCⅡ類分子[3]。M1細胞通過產(chǎn)生促炎細胞因子、活性氧、氧化物和蛋白酶在微生物的殺滅和組織重建中起重要作用，其激活的主要方式是通過LPS、IFN-γ及GM-CSF三種信號。

1.1.1LPS誘導信號。LPS可被巨噬細胞TLR4所識別，兩者結(jié)合將信號轉(zhuǎn)導到胞內(nèi)，并由兩個銜接蛋白髓樣分化因子88(Myeloid differentiation factor 88,MYD88)和TRIF相關(guān)接頭分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)介導下游信號。MyD88信號途徑介導一系列激酶IRAK4、TRAF6和IKKβ的激活，最終激活NF-κB。NF-κB是調(diào)節(jié)一系列炎性基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。TRAM銜接蛋白通路激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3從而誘導Ⅰ型干擾素(如：IFNα和IFNβ)的表達和分泌。Ⅰ型干擾素與Ⅰ型干擾素受體IFNAR結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄因子STAT1[4-6]。因此LPS介導的M1型巨噬細胞的活化主要受NF-κB、AP-1、IRF、STST1調(diào)控并改變基因的表達。

1.1.2IFN-γ誘導信號。當IFN-γ與IFNGR結(jié)合后，募集Jak1和Jak2接頭蛋白，活化轉(zhuǎn)錄因子IRF1和IRF8，誘導多種細胞因子受體，如IL-6R、IL-12RA和IL-15R的表達，同時促進黏附分子ICAM1、整合素α的表達。另外，IFN-γ還可以通過影響巨噬細胞的糖代謝途徑進而促進M1的分化，如IFN-γ可以促進線粒體產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，誘導低氧誘導因子-1α(Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)高表達，并隨之產(chǎn)生IL-1β等炎癥因子[7]。

圖1 經(jīng)典活化型巨噬細胞(M1型巨噬細胞)Fig.1 Classical activated macrophages (M1 macrophages)Note: LPS,IFN-γ and GM-CF induced differentiation of M1-type macrophages by activating STAT1,NF-κB,AP-1 and IRFs.

1.1.3GM-CSF誘導信號。GM-CSF是一種造血生長因子，來源于T細胞、巨噬細胞、內(nèi)皮細胞和成纖維細胞等[8]。GM-CSF與其受體結(jié)合后，從而招募JAK2并激活STAT5、ERK、NF-κB及IRF5，產(chǎn)生一系列促炎細胞因子。GM-CSF與LPS相比，LPS誘導的巨噬細胞可分泌更高水平的促炎細胞因子[9]。M1型巨噬細胞極化見圖1。

1.2M2型巨噬細胞的極化與激活(圖2) M2型巨噬細胞的特征是高表達Arg-1、YM1、Mrx1、Dectin-1、DC-SIGN、甘露糖受體、清道夫受體A、清道夫受體B-1、CD163、CCR2、CXCR1、CXCR2，同時低表達促炎癥細胞因子，參與組織重塑[10]。根據(jù)刺激物的不同，M2型巨噬細胞可以進一步劃分為M2a、M2b、M2c及M2d四個亞型，它們典型的特征是產(chǎn)生Arg-1酶，高表達IL-10和IL-1RA，低表達IL-12[11，12]。M2a型TAM主要產(chǎn)生趨化因子CCL24、CCL22，分別與CCR3和CCR4結(jié)合促進嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞及Th2細胞募集，介導Th2型免疫應答，并由Th2細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的IL-4或IL-13所誘導。IL-4或IL-13與其受體IL-4Rα或IL-13Rα結(jié)合引發(fā)JAK1和JAK3的募集，進一步激活STAT6和IRF4。M2b型巨噬細胞可分泌CCL1，與CCR1結(jié)合后促進嗜酸性粒細胞、Th2及Treg細胞的募集，參與體液免疫和免疫調(diào)節(jié)作用。M2b由IL-1R或免疫復合物聯(lián)合LPS所誘導，信號傳遞涉及細胞內(nèi)的脾酪氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase，Syc)和磷酸肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase，PI3K)，進而激活丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 (Alanine aminotransferase，ALT)和細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 (Txtracellular regulated protein kinases，ERK)，從而誘導IL-10和TNF-α高表達[11,13]。M2c型巨噬細胞可由糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoids，GC)、TGF-β和IL-10所誘導，主要通過產(chǎn)生CXCL13、CCL16和CCL18促進初始T細胞、嗜酸性粒細胞的募集，介導免疫抑制[11]。糖皮質(zhì)激素擴散到細胞內(nèi)與其受體相結(jié)合形成復合物，進而轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，并抑制NF-κB和AP-1的活性，從而干擾炎癥反應[14]。IL-16和腺苷是誘導M2d分化的重要刺激物。腺苷協(xié)同TLR4(TLR2/7/9)的激動劑是將M2a向M2d分化的開關(guān)。腺苷信號抑制TLR依賴的TNF-α、IL-12等炎癥因子產(chǎn)生，并促進IL-10、VEGF的產(chǎn)生[15]。M1和M2型巨噬細胞的區(qū)別見表1。

圖2 替代活化型巨噬細胞(M2型巨噬細胞)Fig.2 Alternative activated macrophages (M2 macrophages)Note: IL-4 and IL-13 can induce M2a macrophages differentiation by STAT6/IRF4 signals.Differentiation of M2b can be induced by IL-1R or immune complexes by Syc and PI3K activation.M2c differentiation can be induced by glucocorticoid or IL-10 via activation of STAT,NK-κB and MKP-1.M2d differentiation is depended on cAMP production by activation of Adenosine receptor A2A via NF-κB signal.

2 腫瘤微環(huán)境對M2型巨噬細胞的影響

1863年Virchow描述了腫瘤組織中炎性白細胞的存在， 第一次將炎癥與癌癥聯(lián)系起來，并提出“淋巴網(wǎng)狀浸潤”是慢性炎癥引發(fā)腫瘤發(fā)生的原因[16]。TAMs是實體瘤基質(zhì)的主要成分，是具有高可塑性的異質(zhì)細胞，既有經(jīng)典的M1型巨噬細胞，也有M2型巨噬細胞，因此，在腫瘤微環(huán)境中，巨噬細胞是一把雙刃劍。

由于腫瘤微環(huán)境會抑制免疫功能，TAM一般被極化為M2型巨噬細胞并發(fā)揮促瘤作用[17]，但在不同腫瘤組織中，M2型巨噬細胞極化的機制不同。Quail等[18]研究表明，膠質(zhì)瘤組織中有大量CD3+T及CD3+CD8+T細胞的浸潤，并分泌高水平的IL-4。IL-4通過活化NFAT和Stat6兩個轉(zhuǎn)錄因子，誘導M2型TAM分化，并促進TAM分泌IGF-1，進而發(fā)揮促進膠質(zhì)瘤生長的作用。乳酸是實體腫瘤的代謝產(chǎn)物，乳酸通過激活TAM的ERK/STAT3信號分子，誘導M2型TAM分化，并促進乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移[19]。腫瘤相關(guān)成纖維細胞(Cancer-associated fbroblasts，CAFs)是腫瘤微環(huán)境中重要的基質(zhì)細胞，CAFs產(chǎn)生的TGF-β和α-SMA促進腫瘤細胞發(fā)生EMT及轉(zhuǎn)移；CAFs釋放的SDF-1/CXCL12、CCL2促進內(nèi)皮細胞前體向腫瘤組織募集及血管生成。另外，在前列腺腫瘤中，CAFs產(chǎn)生的SDF-1/CXCL12也是誘導M2型TAM極化的誘導因子[20]。有文獻報道，順鉑或卡鉑處理人宮頸癌細胞株HELA、CC8、CSCC7或人卵巢癌細胞株COV413B和CAOV3后的培養(yǎng)上清可誘導人外周血CD14+單核巨噬細胞分化為M2型巨噬細胞[21]；Challagundla等[22]報道，成神經(jīng)細胞瘤(Neuroblastoma,NBL)釋放的外泌體富含miR-21，將此外泌體與單核細胞共培養(yǎng)后，將此單核細胞注射給荷瘤小鼠，可明顯增加荷瘤小鼠對順鉑的抗性。因此，腫瘤微環(huán)境存在多種誘導M2型TAM分化的機制。

3 腫瘤相關(guān)巨噬細胞與腫瘤治療

3.1抑制巨噬細胞的募集 由于腫瘤微環(huán)境中存在多種誘導M2型巨噬細胞極化的因素，抑制巨噬細胞的募集可能有利于腫瘤的治療。抑制巨噬細胞的募集主要是通過防止腫瘤及腫瘤間質(zhì)細胞分泌趨化因子和阻斷巨噬細胞的表面受體。在巨噬細胞募集中起主要作用的是單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)即CCL2，其表達水平和巨噬細胞的募集密切相關(guān)。據(jù)報道，CCL2存在于許多類型的腫瘤微環(huán)境中。小分子抑制劑Bindarit可有效減少CCL2陽性黑色素瘤中CCL2的釋放和巨噬細胞的募集[23]。在Ⅰ期臨床試驗中，抗CCL2抗體carlumab(CNTO 888)在晚期實體瘤患者中顯示出初步的抗腫瘤活性，并且耐受性良好[24]。CCR2抑制劑PF-04136309(是一種口服的小分子CCR2抑制劑，可防止炎性單核細胞從骨髓中滲出，減少TAMs的浸潤)聯(lián)合FOLFIRINOX(為標準化療方案由奧沙利鉑、依立替康、亞葉酸鈣、和氟尿嘧啶構(gòu)成)的CCR2靶向治療對局部晚期胰腺癌和臨界可切除胰腺癌是安全有效的[25]。CCR2抑制劑可以降低TAMs，改善腫瘤微環(huán)境，因此可以為今后癌癥治療的臨床研究提供重要依據(jù)。在前列腺癌中，CCL2可上調(diào)其受體表達，并通過CCL2-CCR2信號上調(diào)CCL22和CCR4的表達，進而CCL22-CCR4軸激活Akt，導致前列腺癌遷移和侵襲[26]。CCR4比CCR2的促腫瘤遷移和侵襲的能力更強。因此靶向CCL22-CCR4軸可能成為治療前列腺癌的潛在靶點[26]。在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者中， CD4+和CD8+T淋巴細胞產(chǎn)生高水平的CCL5，并具有明顯的促瘤作用。因此靶向抑制CCR5可能成為治療腫瘤的一種選擇。Maraviroc是一種高度選擇性的，良好耐受的CCR5抑制劑，經(jīng)過MARACON試驗證實，在術(shù)后轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中，對maraviroc治療沒有顯著的副作用。因此，靶向CCL5-CCR5軸的治療方法值得進一步研究[27]。

表1 M1和M2型巨噬細胞的特征及功能的差異

Tab.1 Differences in characteristics and functions of M1 and M2 macrophages

Type of macrophageM1M2aM2bM2cM2dPolarization inducerIFN-γ,LPS,TNF-αIL-4,IL-13Immune complex,TLR agonists,IL-1βGlucocorticoid,IL-10,TGF-βTLR agonists,Adenosine receptor ligandCharacteristic mole-culesCD80,CD86,CD68,MHCⅡ,IL-1R,TLR-2,TLR-4,iNOS,IL-10low,IL-12highMMR/CD206,IL1Ra; IL-1R II,Arg-1,FIZZ1,Ym1/2IL-10high,IL-12low,CD86MMR/CD206,TLR-1,TLR-8 Arg-1VEGF,IL-12low,TNF-αlow,IL-10highCytokinesTNF-α,IL-1β,IL-6,IL-12,IL-23,IL-27,CXCL9,CX-CL10,CXCL11,CXCL16,CCL5,iNOS,ROSIL-10,TGF-β,CCL17,CCL18,CCL22,CCL24TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-10,CCL1IL-10,TGF-β,CCL16,CCL18,CXCL13IL-10,VEGFFunctionsPromote inflammation,induce Th1 response,anti-tumorAnti-inflammation andissue repairInduce Th2 response,im-mune regulationPhagocytosis ofapoptotic cellsAngiogenes and tumorpromotion

此外，其他的趨化因子(CCL3、CCL4、CCL5、CXCL8、CXCL12)、集落刺激因子-1(Colony stimulating factor-1，CSF-1)、內(nèi)皮性單核細胞活化多肽2(Endothelial monocyte activation polypeptide 2，EMAP2)和生長因子(VEGF)、內(nèi)皮素2、血小板源性生長因子(Platelet derived growth factor，PDGF)等也參與巨噬細胞的募集。所以，可使用針對這些因子的抑制劑進行研究來判定靶向的有效性，從而篩選出針對不同癌癥的潛在靶點。

3.2誘導TAMs向抗腫瘤的表型極化 據(jù)上所述，TAM包括M1型和M2型，兩者的極化受細胞因子等因素決定。因此，可以通過誘導TAMs分化為M1型巨噬細胞，使其成為抗腫瘤的巨噬細胞。一是通過補充Th1型細胞因子或者干擾誘導M2型巨噬細胞極化的途徑；另外，通過引入TLR激動劑激活NF-κB途徑[28]。已知LPS、IFN-γ及GM-CSF為M1型巨噬細胞激活的主要誘導物。在卵巢癌患者中，IFN-α和IFN-γ為代表的免疫療法，具有一定的治療前景，但其治療潛力尚不清楚。除了引入Th1細胞因子或TLR配體外，通過激活共刺激分子如CD40來刺激免疫應答已經(jīng)顯示出有希望的結(jié)果，而且在完全人源化的CD40激動劑抗體聯(lián)合吉西他濱治療中晚期胰腺癌的臨床試驗已經(jīng)完成，且耐受性良好[29]。在動物實驗中，給小鼠使用激動性抗CD40抗體后，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境中M2型巨噬細胞向M1型表型轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為IL-12的分泌顯著增加，并獲得抗原呈遞能力，腫瘤體積也減小[29-32]。S100A9和HDAC4的一種小分子抑制劑Tasquinimod也可以增加腫瘤組織內(nèi)IL-12的分泌量，抑制新血管形成和M2型TAM的浸潤，且使M1型巨噬細胞增加[33，34]。富組氨酸糖蛋白(Histidine rich glycoprotein，HRG)下調(diào)VEGF家族成員胎盤生長因子(Placental growth factor，PLGF)促進抗腫瘤免疫應答和腫瘤血管的正?；筂2型巨噬細胞極化為M1型巨噬細胞。銅綠假單胞菌(綠膿桿菌)甘露糖敏感血凝菌毛株(Pseudomonas aeruginosa-mannose sensitive hemagglutinin,PA-MSHA)能上調(diào)M1型巨噬細胞相關(guān)基因的表達水平，促進巨噬細胞向M1型極化。另一方面，PA-MSHA可以下調(diào)M2型相關(guān)基因的表達，抑制小鼠膀胱癌細胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。該項研究顯示了PA-MSHA在TAMs靶向治療膀胱癌中具有一定潛在價值[35]。STAT3與M2型TAM的極化及功能密切相關(guān)，Cheng等[36]首先描述了靶向STAT3可抑制M2型TAM的功能，并使荷瘤小鼠的免疫耐受性T細胞恢復免疫應答能力。涉及M2巨噬細胞分化的另一個途徑是STAT6途徑。Binnemars等[37]報道，使用AS1517499抑制STAT6磷酸化，可使巨噬細胞向M1表型極化。Pyonteck等[38]報道，CSF-1R 抑制劑BLZ945雖不能有效清除TAM，但可有效抑制膠質(zhì)細胞瘤生長，其機制是BLZ945可促進膠質(zhì)瘤細胞分泌GM-CSF及IFN-γ，從而誘導TAM向M1型轉(zhuǎn)化。

因此，針對M2型巨噬細胞向M1型巨噬細胞極化過程中的關(guān)鍵靶點，可以設(shè)計不同的治療方案，以尋求潛在醫(yī)療價值。

3.3耗竭TAMs 目前，實現(xiàn)這一目標最有效的方法是使用對巨噬細胞有毒性的化合物。常用的藥物是雙膦酸鹽，包括氯膦酸鹽、唑來膦酸和曲貝替定[39]。有實驗表明，載有氯膦酸鹽的脂質(zhì)體導致TAMs降低，從而導致腫瘤細胞生長的降低[40]。使用唑來膦酸與STAT3抑制劑索拉非尼的組合在肝細胞癌的裸鼠異種移植模型中顯示可顯著抑制腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和血管生成[41]。曲貝替定是提取自海洋生物加勒比海鞘的一種生物堿，對巨噬細胞和TAMs具有選擇性細胞毒性，同時不損傷其他免疫細胞，因而具有抗腫瘤活性[42]，在歐洲由EMEA批準用于治療肉瘤和卵巢癌。除此之外，Cieslewicz等[43]通過噬菌體肽庫篩選技術(shù)得到了一種名為M2pep的肽。這種肽能夠識別并選擇性結(jié)合荷瘤小鼠體內(nèi)的M2型巨噬細胞，從而達到耗竭TAMs的目的。

3.4阻斷TAMs的促腫瘤功能 主要為阻斷TAMs的免疫抑制功能和抑制 TAMs的促血管生成作用。膀胱癌中使用mPGES1和COX2的藥物抑制劑或前列腺素脫氫酶，可抑制前列腺素2的生成，從而有效降低PD-L1的表達和減弱TAMs的免疫抑制功能[44]。此外，采用表達VEGFR-3的腺病毒可以阻斷VEGF-C/D信號通路，從而抑制TAMs的促血管生成作用[45]。

4 展望

腫瘤為了逃避免疫監(jiān)視作用，通過分泌特定的因子募集巨噬細胞到腫瘤組織，誘導巨噬細胞向促瘤作用的M2極化，參與腫瘤的生長、遷移、腫瘤血管生成、抑制NK和CTL對腫瘤的殺傷、對抗放化療的打擊。因此，通過阻斷巨噬細胞到達腫瘤組織、清除巨噬細胞、抑制腫瘤微環(huán)境的TAM的活化或再極化為抑瘤作用的M1型巨噬細胞等靶向巨噬細胞的策略，已成為腫瘤免疫研究領(lǐng)域的熱點問題。但腫瘤治療是一個系統(tǒng)工程，任何單一的療法效果都很局限。因此，應根據(jù)不同類型的腫瘤，將巨噬細胞靶向策略與目前常用的放化療、抗腫瘤血管、小分子靶向藥、免疫卡控點等多種療法進行聯(lián)合，以期達到最佳的個體化治療效果。