呂 娟 趙紅梅 孫桂芳 王潤青

(鄭州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,鄭州450000)

腦卒中是指腦部血管破裂和阻塞導(dǎo)致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一組疾病，常分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中約占80%[1]。腦卒中具有高致病率、高致殘率和高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅人類的健康，術(shù)后康復(fù)需要耗費(fèi)大量的資源[2,3]。目前對不同類型和階段的腦卒中，缺少有效而統(tǒng)一的治療方案，因此研究腦卒中有效治療藥物尤為重要[4]。加蘭他敏是從石蒜科植物中提取出來的生物堿，臨床上主要用于治療中度阿爾茲海默癥和各種記憶功能障礙[5,6]。除了上述用途，加蘭他敏還被用于治療肌無力、肌病、肌肉萎縮癥以及與中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂相關(guān)的感覺和運(yùn)動(dòng)功能障礙[7]。加蘭他敏是乙酰膽堿受體的配體，與之結(jié)合后，引起乙酰膽堿受體結(jié)構(gòu)改變；同時(shí)加蘭他敏能抑制乙酰膽堿酯酶的活性，使乙酰膽堿含量增加[8]。目前加蘭他敏的研究主要集中在神經(jīng)退行性疾病和肌肉萎縮方面，也有研究指出加蘭他敏影響神經(jīng)元的功能和存活,具有神經(jīng)保護(hù)作用[9]，但對腦缺血再灌注損傷的研究還未見報(bào)道。核因子E2相關(guān)因子(Nuclear factor E2 related factor，Nrf2)是抗氧化調(diào)節(jié)的重要蛋白，當(dāng)機(jī)體受損時(shí)，Nrf2通過調(diào)節(jié)抗氧化蛋白、炎癥因子、凋亡蛋白的表達(dá)，對機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)作用。本文研究加蘭他敏對大鼠腦缺血再灌注后免疫反應(yīng)和神經(jīng)再生的影響及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 清潔級SD大鼠由廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。加蘭他敏購自蘇州麥倫生物；水合氯醛購自上海麥克林；HE染色試劑盒購自北京索萊寶生物；免疫組化試劑盒購自默沙克生物；NF-200、GAP-43、RGMa、Nrf2、HO-1和NQO1一抗，生物素標(biāo)記的二抗及顯色液購自Abcam;大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18 ELISA檢測試劑盒購自南京森貝伽生物；活性氧ROS檢測試劑盒購自碧云天生物。

1.2方法

1.2.1大鼠分組及模型構(gòu)建 將30只SD大鼠隨機(jī)分成5組:健康對照組、假手術(shù)組、I/R模型組、I/R 加低劑量GAL組(10 mg/kg)、I/R加高劑量GAL組(50 mg/kg)。線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈阻斷(MCAO)模型：10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，大鼠采取仰臥位固定，在頸正中切口，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。用動(dòng)脈夾暫時(shí)阻塞頸內(nèi)動(dòng)脈，用細(xì)線將左側(cè)頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端系牢，輕推栓線至18 mm處。縫合傷口，2 h后拔出線栓。大鼠向一側(cè)移動(dòng)，提尾對側(cè)前肢內(nèi)收，表明模型建立成功。

1.2.2HE染色 麻醉大鼠后，剖開胸腔，經(jīng)主動(dòng)脈灌注，生理鹽水清洗血液，4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定30 min后取材。常規(guī)石蠟包埋，切片，用二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水；蘇木素染色5 min，自來水沖洗；鹽水乙醇分化，自來水浸泡15 min；加伊紅2 min，常規(guī)脫水，透明，中性樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3免疫組化 PBS清洗后，滴加牛血清，室溫孵育1 h；PBS清洗，加一抗，室溫下孵育24 h，PBS清洗；加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，PBS清洗；加生物素過氧化物酶溶液，室溫孵育1 h，PBS清洗；加DAB顯色液，顯微鏡下觀察合適時(shí)間，蒸餾水清洗2次，阻斷顯色反應(yīng)，PBS清洗；中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照，并使用ImagePro Plus6.0分析。

1.2.4Western blot 取少量組織塊，用干凈的剪刀盡量剪碎，加含PMSF的細(xì)胞裂解液，置于冰上裂解30 min。15 000 r/min離心5 min取上清，BSA法測定蛋白濃度，加上樣緩沖液制作蛋白樣品。等量的蛋白樣品用12%的變性蛋白凝膠分離，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，TBST清洗。5%脫脂牛奶的封閉液中，室溫下孵育1 h；加1∶1 000的一抗，4°C緩慢搖晃過夜，TBST清洗；加二抗，室溫孵育2 h，TBST清洗；加顯色液，凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照，使用Image Lab軟件分析目的蛋白的灰度值，得出相對表達(dá)量。

1.2.5ELISA 大鼠處死前，麻醉，從腹主動(dòng)脈取血。室溫靜置40 min，2 500 r/min離心10 min，取上層血清，加鹽酸稀釋。稀釋抗體加到96孔板中，4°C過夜，棄孔內(nèi)溶液，加洗滌液洗3次。加待檢測樣品，37°C孵育1 h，洗滌；加入新鮮的酶標(biāo)抗體，37℃ 30 min，洗滌，加底物液顯色，避光反應(yīng)5 min后加終止液。酶標(biāo)儀下450 nm檢測，使用相關(guān)軟件分析數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件統(tǒng)計(jì)和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析后，兩組間用t檢驗(yàn)。P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1加蘭他敏緩解腦缺血再灌注對大鼠腦組織的損傷 HE染色結(jié)果顯示，健康對照組和假手術(shù)組神經(jīng)元呈圓形，細(xì)胞核著色均勻，細(xì)胞排列規(guī)則，較少出現(xiàn)死細(xì)胞(圖1)。I/R模型組染色結(jié)果顯示，細(xì)胞排列不規(guī)則，細(xì)胞線不清晰，錐體細(xì)胞出現(xiàn)大量壞死，細(xì)胞質(zhì)間隙明顯變大，出現(xiàn)空泡，神經(jīng)數(shù)目比健康組少(圖1)。I/R模型大鼠經(jīng)GAL加藥處理后，CA1區(qū)細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞排列緊密，數(shù)目明顯增多(圖1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加蘭他敏抑制腦缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠CA1區(qū)組織病變。

2.2加蘭他敏上調(diào)NF-200的表達(dá) 假手術(shù)組與健康對照組相比，NF-200陽性細(xì)胞數(shù)目沒有明顯的變化(圖2)。I/R模型組與假手術(shù)組相比，NF-200免疫組化陽性細(xì)胞明顯減少(圖2，P<0.01)。I/R模型加GAL處理后，NF-200陽性細(xì)胞明顯增加，且GAL加藥濃度與NF-200陽性細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)(圖2，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加蘭他敏促進(jìn)腦缺血再灌注的大鼠腦神經(jīng)再生。

2.3加蘭他敏誘導(dǎo)缺血再灌注大鼠腦損傷部位神經(jīng)再生 假手術(shù)組與健康對照組相比較，NF-200、GAP-43和RGMa的表達(dá)沒有明顯變化(圖3，P<0.05)。I/R模型組與假手術(shù)組相比，NF-200和GAP-43的表達(dá)明顯下調(diào)，RGMa的表達(dá)明顯上調(diào)(圖3，P<0.05)。I/R模型大鼠經(jīng)GAL加藥處理后，NF-200和GAP的表達(dá)顯著上調(diào)，RGMa的表達(dá)顯著下調(diào)(圖3，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過上調(diào)NF-200和GAP-43，促進(jìn)神經(jīng)再生。

圖1 加蘭他敏對腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)病理損傷的影響Fig.1 Effects of Galanthamine on pathologic lesion of CA1 in rats with cerebral ischemia reperfusion

圖2 加蘭他敏對腦缺血再灌注大鼠受損部位NF-200表達(dá)的影響

Fig.2 Effect of Galanthamine on expression of NF-200 in damaged part of MCAO rats

Note: **.P<0.01 compared with the Healthy control group;#.P<0.05,compared with the I/R group.

2.4加蘭他敏抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠腦組織炎癥反應(yīng) 假手術(shù)組與健康對照組相比，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量沒有出現(xiàn)明顯變化(圖4，P<0.05)。I/R模型組與假手術(shù)組相比，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量顯著上升(圖4，P<0.05)。I/R模型大鼠加GAL后，血液中促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-18含量顯著下降，且促炎因子的含量與GAL 的含量呈負(fù)相關(guān)(圖4，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加蘭他敏能抑制腦缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

2.5加蘭他敏對氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 假手術(shù)組與健康模型組相比，Nrf2、HO-1、NQO-1的表達(dá)沒有明顯的變化(圖5，P<0.05)。I/R模型組與假手術(shù)組相比，Nrf2、HO-1、NQO-1的表達(dá)顯著下調(diào)(圖5，P<0.05)。I/R模型大鼠加GAL后，Nrf2、HO-1、NQO-1的表達(dá)顯著上調(diào)(圖5，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加蘭他敏抑制腦缺血再灌注誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

2.6加蘭他敏降低腦缺血再灌注大鼠腦組織中ROS的含量 假手術(shù)組與健康對照組相比，腦組織中ROS的含量沒有明顯的變化(圖6，P<0.05)。I/R 模型組與假手術(shù)組相比較，ROS的含量顯著上升(圖6，P<0.05)。I/R模型大鼠加GAL處理后，ROS的含量顯著降低，且ROS的含量與GAL的濃度負(fù)相關(guān)(圖6，P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加蘭他敏降低腦缺血再灌注大鼠腦組織中ROS的含量。

圖3 加蘭他敏對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)再生的影響Fig.3 Effect of Galanthamine on nerve regeneration in MCAO ratsNote: **.P<0.01 compared with the Healthy control group;#.P<0.05,##.P<0.01 compared with the I/R group.

圖4 加蘭他敏對腦缺血再灌注大鼠炎癥反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of Galanthamine on imflammatory response in MCAO ratsNote: **.P<0.01 compared with the Healthy control group;#.P<0.05 compared with the I/R group；##.P<0.01 compared with the I/R group.

圖5 加蘭他敏對氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of Galanthamine on expression of oxidative stress related protein related proteinsNote: **.P<0.01 compared with the Healthy control group;##.P<0.01 compared with the I/R group.

圖6 加蘭他敏對腦缺血再灌注大鼠腦組織ROS含量的影響Fig.6 Effects of Galanthamine on ROS content in cerebral ischemia reperfusion ratsNote: **.P<0.01 compared with the Healthy control group;##.P<0.01 compared with the I/R group.

3 討論

腦缺血再灌注是指腦缺血一段時(shí)間恢復(fù)血流后，產(chǎn)生一系列反應(yīng)，使腦組織的損傷加重，甚至是不可逆損傷[10]。MCAO常用于腦缺血生理病理及神經(jīng)保護(hù)的研究[11]。加蘭他敏是乙酰膽堿酯酶的選擇性抑制劑，主要用于治療輕中度阿爾茲海默癥，可以緩解藥物或損傷誘導(dǎo)的認(rèn)知缺陷[12]。各組大鼠腦組織CA1區(qū)HE染色結(jié)果顯示，加蘭他敏緩解腦缺血再灌注誘導(dǎo)的大鼠CA1區(qū)組織病變。

NF-200是在神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的中間絲，與微管、微絲組成神經(jīng)細(xì)胞的骨架，在細(xì)胞中為軸突提供支撐，調(diào)節(jié)軸突直徑，同時(shí)對神經(jīng)傳導(dǎo)也有重要作用[13,14]。在神經(jīng)退行性疾病中，NF-200會(huì)被釋放到腦脊液和血液中，因此NF-200的免疫染色作為神經(jīng)細(xì)胞軸突損傷的標(biāo)志[15]。NF-200抗體常用于神經(jīng)病理學(xué)檢測，將神經(jīng)元從神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中區(qū)分開來，因此可以用來檢測組織中神經(jīng)元的數(shù)目[16,17]。免疫組化檢測NF-200的表達(dá)，結(jié)果顯示加蘭他敏提升大鼠腦缺血再灌注后CA1區(qū)神經(jīng)元的數(shù)目。

GAP-43是軸突膜蛋白，是一種神經(jīng)特異性的蛋白質(zhì)，參與神經(jīng)細(xì)胞外生長及突觸發(fā)育和神經(jīng)細(xì)胞再生，在神經(jīng)發(fā)育和再生過程中高表達(dá)[18]。在神經(jīng)元的研究過程中，常常將NF-200和GAP-43作為神經(jīng)元軸突的標(biāo)志[19,20]。RGMa是軸突再生抑制蛋白，與神經(jīng)生長發(fā)育關(guān)系密切，如介導(dǎo)排斥性軸突導(dǎo)向信號和神經(jīng)管閉合，調(diào)控神經(jīng)增殖、分化、誘導(dǎo)生長錐塌陷[21,22]。加蘭他敏處理后，NF-200和GAP-43的表達(dá)顯著上調(diào)，RGMa的表達(dá)顯著下調(diào)，表明加蘭他敏誘導(dǎo)大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)再生。

急性炎癥反應(yīng)在缺血再灌注引起的繼發(fā)性腦損傷中起著重要的作用。缺血灶局部存在大量促炎因子，促進(jìn)白細(xì)胞浸潤，釋放大量的炎性介質(zhì)，加重缺血區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的損傷[23]。P38和JNK激活后，促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，而Nrf2能抑制P38、JNK的磷酸化激活[24]。本實(shí)驗(yàn)中觀察到加蘭他敏上調(diào)Nrf2的表達(dá)，結(jié)果與前人研究一致。酶聯(lián)免疫吸附測定結(jié)果顯示，加蘭他敏加藥組促炎因子的含量顯著降低，表明加蘭他敏抑制腦缺血再灌注誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

Nrf2是外源性有毒物質(zhì)和氧化應(yīng)激的感受器，在參與細(xì)胞抗氧化應(yīng)激和外源性有毒物質(zhì)誘導(dǎo)的主要防御機(jī)制中發(fā)揮重要的作用，通過調(diào)節(jié)抗氧化蛋白的表達(dá)，使機(jī)體免受炎癥誘發(fā)的氧化損傷[25]。正常情況下，Nrf2在細(xì)胞質(zhì)中被迅速降解，當(dāng)氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核與DNA啟動(dòng)子相結(jié)合，啟動(dòng)抗氧化蛋白基因的轉(zhuǎn)錄。HO-1和NQO1都是Nrf2下游蛋白，HO-1是血紅素氧合酶，催化血紅素降解，其產(chǎn)物都有抗氧化損傷的功能。大量研究顯示，Nrf2的過表達(dá)對腦缺血再灌注損傷具有積極作用。如Miao等[26]研究發(fā)現(xiàn)，異黃酮通過上調(diào)Nrf2的表達(dá)，減輕卵巢切除后大鼠短暫性腦缺血誘導(dǎo)的損傷。Satoh等[27]研究發(fā)現(xiàn)，鼠尾草酸通過激活Keap1/Nrf2信號通路，對體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)細(xì)胞都有保護(hù)作用。Western blot結(jié)果顯示，加蘭他敏加藥組Nrf2、HO-1和NQO1的表達(dá)均明顯上調(diào)，表明加蘭他敏增強(qiáng)模型大鼠的抗氧化能力。

在生物環(huán)境中，ROS是正常的氧氣代謝的副產(chǎn)品，在細(xì)胞信號和體內(nèi)平衡中扮演著重要的角色[28,29]。當(dāng)機(jī)體受到壓力刺激時(shí)，活性氧的含量急劇升高，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重?fù)p害[30]。目前公認(rèn)腦缺血再灌注產(chǎn)生大量的ROS是引起再灌注損傷的主要原因[31]。試劑盒檢測總ROS，發(fā)現(xiàn)加蘭他敏能降低大鼠腦缺血再灌注后ROS的含量。

綜上所述，加蘭他敏通過激活Nfr2/ROS通路，緩解大鼠腦缺血再灌注后的免疫紊亂，誘導(dǎo)神經(jīng)再生相關(guān)蛋白的表達(dá)。下一步研究加蘭他敏對神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y氧化應(yīng)激的影響及相關(guān)分子機(jī)制。