秦明明 馮 鋼 劉小岑 章 健 鄭 瑞 浦 春

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院檢驗科，蕪湖241001)

乳腺癌(Breast cancer,BC)是世界范圍內(nèi)嚴重威脅女性健康和生命的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率[1]。幸運的是，乳腺癌如果能早期診斷并及時治療，多數(shù)患者能夠取得滿意的效果，但仍有30%左右早期乳腺癌治療后會發(fā)生復發(fā)和轉(zhuǎn)移[2，3]。因此，發(fā)現(xiàn)和研究新的乳腺癌治療分子靶點成為當前研究的重點和熱點。微小RNA(miRNA)是一種內(nèi)源性的、非編碼小分子RNA。主要通過結(jié)合下游靶基因的3′UTR影響RNA的沉默及基因表達轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控[4]。miRNAs的異常表達與多種人類腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移、腫瘤患者的預后等密切相關(guān)[5-7]。let-7家族是最早被發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制RNA，在調(diào)控腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要的作用。然而，關(guān)于let-7i在乳腺癌中的作用及其機制的研究相對較少。本研究中，我們通過體外細胞的CCK-8、平板克隆、劃痕及侵襲試驗評估let-7i對乳腺癌細胞的生長、遷移等功能的作用；并通過RT-PCR和Western blot檢測let-7i對乳腺癌細胞中HMGA1水平的影響以及乳腺癌組織中l(wèi)et-7i和HMGA1的表達，以研究let-7i對乳腺癌細胞的作用及其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1乳腺癌組織和癌旁組織 收集2016年5月～2017年5月在皖南醫(yī)學院第一附屬弋磯山醫(yī)院確診為乳腺癌組織標本34例(癌組織和癌旁組織)。所有乳腺癌患者均經(jīng)過術(shù)后組織的病理診斷。收集的組織標本立即冷凍保存于液氮中，所有患者在采集樣本前均未接受任何放療、化療或免疫治療。所有患者均提供書面同意。研究方案已獲皖南醫(yī)學院機構(gòu)倫理審查委員會批準。

1.1.2乳腺癌細胞株 人乳腺癌細胞株MCF-7由皖南醫(yī)學院附屬弋磯山醫(yī)院中心實驗室提供。Hyclone DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；胎牛血清購自Gibco公司；RNA轉(zhuǎn)染試劑Entranster-R4000購自北京英格恩生物科技有限公司。

1.1.3其他相關(guān)試劑和儀器 mRNA的逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR分別采用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit[Thermo,上海賽默飛世爾科技(中國)有限公司]和SYBR?Premix Ex TaqTMkit[TaKaRa, 寶日醫(yī)生物科技(北京)有限公司]；microRNA的逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR分別采用 miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒(天根，北京天根生化科技有限公司)。let-7i mimic、let-7i陰性對照和let-7i、HMGA1引物均購自廣州銳博生物科技有限公司；兔抗人單克隆抗體(一抗)和羊抗兔IgG(二抗)均購自Abcam；CCK-8試劑盒是江蘇碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品。逆轉(zhuǎn)錄儀器為美國Labnet PCR儀；定量測定的儀器為ABI 7500序列檢測系統(tǒng) (Life Technology，美國)；Western blot測定儀器購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.2方法

1.2.1組織中總RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 用Trizol Universal (天根,北京天根生化科技有限公司)提取50 mg冷凍組織總RNA，用凝膠電泳可視化rRNA條帶分析提取RNA的完整性。用分光光度法確定提取總RNA的純度，并根據(jù)生產(chǎn)廠家的指示，進行l(wèi)et-7i和HMGA1的逆轉(zhuǎn)錄和定量測定。miRNA let-7i 和U6 的RT-PCR引物(每組一對RT引物和PCR引物)由銳博生物科技有限公司合成；HMGA1上游引物序列：5′-TCCATTCTTCGACATCCGTCA-3′,下游引物序列：5′-GATCGTGGGCAGAACAGGAG-3′，擴增產(chǎn)物大小為80 bp；GAPDH的上游引物序列：5′-CATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′,下游引物序列：5′-GTGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3′，擴增產(chǎn)物大小為99 bp。將U6和GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算micro let-7i和HMGA1 mRNA的相對表達。

1.2.2蛋白質(zhì)提取及Western blot MCF-7細胞被轉(zhuǎn)染let-7i mimic和陰性對照24 h后，采用改良的放射免疫沉淀法(RIPA,Vazyme Biotech,碧云天)裂解緩沖液和苯甲磺酰氟(PMSF，碧云天)提取細胞總蛋白，使用BCA試劑盒測定各蛋白樣本的濃度。取50 μg蛋白經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE，碧云天)電泳，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶在4℃下阻斷2 h，分別用1∶10 000的兔抗人單克隆抗體HMGA1(Abcam)和1∶1 000的兔抗人單克隆抗體β-actin(Cell Signaling Technology)在4℃搖床過夜；隔天用1∶1 000的HRP連接羊抗兔IgG室溫輕搖1 h，常規(guī)顯影和定影，觀察結(jié)果。

1.2.3細胞增殖實驗 取生長良好的MCF-7細胞接種于96孔板，6 000個/孔，各組細胞轉(zhuǎn)染let-7i mimic和陰性對照24、48、72 h后，每孔加入10 μl 的CCK8，37℃孵育4 h，酶標儀檢測450 nm處的吸光度(OD值)。抑制率=(1-實驗組OD值/空白組OD值)，計算各組的抑制率。

1.2.4克隆形成實驗 取生長良好的MCF-7細胞接種于6孔板，400/孔，24 h后，分別轉(zhuǎn)染let-7i mimic和陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)14 d，期間每3 d更換一次新鮮培養(yǎng)基。14 d后，4%的多聚甲醛固定，并用1%的結(jié)晶紫染色，PBS沖洗干凈后拍照。

1.2.5細胞劃痕實驗 取生長良好的MCF-7細胞接種于6孔板，24 h后，分別轉(zhuǎn)染let-7i mimic和陰性對照，待細胞長到100%匯合度時，用無菌塑料針尖劃破細胞的中軸，用PBS沖洗疏松細胞，觀察傷口愈合情況。并在0、24和48 h 3個時間點，使用倒置顯微鏡拍攝傷口愈合情況。

1.2.6細胞侵襲實驗 腫瘤細胞的侵襲能力的評估采用Transwell 小室(8 μm,Corning)。細胞經(jīng)let-7i mimic和陰性對照轉(zhuǎn)染24 h后，將1×104細胞與0.2 ml無血清的H-DMEM混勻后加入Transwell小室上方，并同時在Transwell小室下方加入500 μl含20%FBS H-DMEM。24孔板下室加入500 μl含20%FBS的H-DMEM中，培養(yǎng)24 h后，結(jié)晶紫染色，隨機選取3個低倍區(qū)域(×100)，計數(shù)細胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1let-7i在乳腺癌組織中低表達 我們采用RT-PCR檢測了乳腺癌和癌旁組織中l(wèi)et-7i的表達水平，結(jié)果表明，相比于癌旁組織let-7i水平(1.53±0.71)，乳腺癌組織let-7i水平(0.16±0.17)明顯下調(diào)(t=10.90,P<0.001)。為了進一步明確let-7i在乳腺癌細胞中的作用，我們在乳腺癌MCF-7細胞中轉(zhuǎn)染了let-7i mimic和陰性對照，24 h后，采用RT-PCR的方法驗證轉(zhuǎn)染效率。相比于陰性對照let-7i的表達水平(1.094±0.097)，轉(zhuǎn)染了let-7i mimic的乳腺癌細胞中l(wèi)et-7i水平(19.60±8.25)明顯升高(t=3.886，P=0.018)。如圖1所示。

圖1 let-7i在乳腺癌組織及細胞中的表達Fig.1 Expression of let-7i in breast cancer tissues and cellsNote：A.The relative expression of let-7i in breast and para-cancerous tissues;B.The relative expression of let-7i in breast cancer cells transfected with let-7i mimic and negative control.*.P<0.05,***.P<0.001.

圖2 MCF-7細胞轉(zhuǎn)染let-7i mimic和陰性對照后各組細胞的增殖率Fig.2 Proliferation rate of each group after MCF-7 cells transfected with let-7i mimic and negative controlNote: **.P<0.01；***.P<0.001.

2.2let-7i抑制乳腺癌細胞的增殖 轉(zhuǎn)染let-7i mimic及陰性對照后24、48、72 h后，450 nm測得各組細胞的吸收度。結(jié)果顯示，與陰性對照相比，過表達let-7i后細胞的增殖率降低 (圖2)。

2.3let-7i抑制乳腺癌細胞的克隆形成 如圖3所示，let-7i mimic組形成的集落數(shù)量低于陰性對照組(t=10.53,P<0.001)。

2.4let-7i抑制乳腺癌細胞的遷移 如圖4所示，相比于陰性對照組，let-7i mimic組的細胞在24 h和48 h的劃痕愈合率明顯降低。

2.5let-7i抑制乳腺癌細胞的侵襲 Transwell侵襲試驗表明，let-7i mimic處理后，從腔內(nèi)侵入的腫瘤細胞數(shù)量少于陰性對照組的腫瘤細胞數(shù)(P<0.05) (圖5)。

2.6HMGA1可能是let-7i的下游靶基因 生物信息學軟件(www.targetscan.org)預測HMGA1與let-7靶結(jié)合位點。預測結(jié)果提示let-7家族與HMGA1 960-966有結(jié)合點， 而評分最高的為let-7i。提示

圖3 MCF-7細胞轉(zhuǎn)染let-7i mimic和陰性對照后各組細胞的集落形成Fig.3 Colony formation of cells in MCF-7 cells transfected with let-7i mimic and negative controlsNote: ***.P<0.001.

圖4 轉(zhuǎn)染let-7i mimic和陰性對照后各組細胞的劃痕愈合率Fig.4 Scratch healing rate of cells after transfection of let-7i mimic and negative controlNote: *.P<0.05，**.P<0.01.

圖5 MCF-7細胞轉(zhuǎn)染let-7i mimic和陰性對照后各組侵襲的細胞數(shù)量Fig.5 Number of cells invaded by MCF-7 cells transfected with let-7i mimic and negative controlNote: **.P<0.01.

圖6 let-7i與HMGA1結(jié)合靶點評分及其對HMGA1表達的影響Fig.6 Comments of let-7i and HMGA1 binding targets and its effect on HMGA1 expressionNote: *.P<0.05.

HMGA1可能是let-7i的下游靶基因(如圖6)?；谶@些結(jié)果，我們采用RT-PCR和Western blot評估let-7i對HMGA1表達的影響。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染let-7i mimic的乳腺癌細胞HMGA1 mRNA和蛋白表達均降低(P<0.05)。

2.7HMGA1在乳腺癌組織中高表達且與let-7i的表達呈負相關(guān) 為了進一步確認乳腺癌組織中HMGA1表達與let-7i的相關(guān)性，我們采用RT-PCR檢測了乳腺癌組織中HMGA1的表達。結(jié)果顯示，HMGA1在乳腺癌組織中表達水平(1.63±1.41)高于癌旁組織(0.12±0.12)，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.237,P<0.001)；Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中HMGA1的表達與let-7i的表達呈負相關(guān)(r=-0.461,P=0.006)。見圖7。

圖7 HMGA1在乳腺組織中的表達及其與let-7i的相關(guān)性Fig.7 Expression of HMGA1 in breast tissue and its correlation with let-7iNote: ***.P<0.001.

3 討論

最新的研究表明，由乳腺腫瘤導致的死亡率僅次于肺和支氣管的呼吸系統(tǒng)腫瘤[1]。目前，手術(shù)和化療是臨床治療乳腺癌的主要方式，然而，多數(shù)手術(shù)切除腫瘤且接受術(shù)后化療的患者仍會發(fā)生腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。乳腺癌的轉(zhuǎn)移是一個涉及多種因素的復雜過程[8]。近年來，人們發(fā)現(xiàn)多種miRNAs異常表達于乳腺癌且是乳腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要調(diào)控因子[9]。let-7家族是最早被發(fā)現(xiàn)、也是含量最豐富的miRNAs。let-7家族的多個成員異常表達于多種人類腫瘤，如肺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等[10-12]，關(guān)于其在腫瘤中的作用和機制尚不十分明確，因此仍是目前關(guān)注的重點。研究表明，let-7i是let-7家族的成員之一，在多種人類腫瘤中表達異常[13]。然而，let-7i對乳腺癌細胞的作用和分子機制尚不明確。

本研究中，我們檢測了let-7i在乳腺癌及癌旁組織中的表達水平，結(jié)果顯示，相比于癌旁組織，乳腺癌組織中的let-7i水平明顯降低，提示let-7i水平的降低與乳腺癌的發(fā)展具有相關(guān)性。因此，我們推斷l(xiāng)et-7i可能是乳腺癌的腫瘤抑制因子。為了進一步研究let-7i在乳腺癌細胞中的作用，我們通過轉(zhuǎn)染let-7i mimic方式在乳腺癌細胞中過表達let-7i。CCK-8和平板克隆實驗表明，高水平let-7i能抑制乳腺癌細胞的生長。其次，劃痕和Transwell實驗表明，在乳腺癌細胞內(nèi)過表達let-7i后，細胞的遷移和侵襲也受到明顯的抑制。最近的研究表明，let-7在腫瘤中表達下調(diào)且可以在轉(zhuǎn)錄水平上抑制RAS和C-MYC的基因表達而發(fā)揮抑癌miRNA的作用[14，15]。另外，研究也表明，let-7i在結(jié)腸癌[13]、胃癌[16]等人類腫瘤的進展中具有重要的調(diào)控作用。這些研究和我們的結(jié)果相一致，提示let-7i可能在乳腺癌的進展中起抑制作用。

為了進一步探討let-7i作用于乳腺癌的分子機制，我們通過生物學信息軟件預測發(fā)現(xiàn)高遷移率族蛋白A1(HMGA1)可能是let-7i的下游靶基因。HMGA1是一種非組蛋白的DNA結(jié)合蛋白，胚胎時期高表達而在成人組織細胞中不表達或極低表達，在多種惡性腫瘤中高表達[17],可通過影響一些基因的表達而影響乳腺癌細胞的浸潤轉(zhuǎn)移[18]，且可以通過多種途徑影響乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移[19]。進一步，我們通過RT-PCR和Western blot檢測HMGA1是否受到let-7i的調(diào)控，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞內(nèi)過表達let-7i的表達后，HMGA1的mRNA和蛋白表達顯著降低；而乳腺癌組織中HMGA1表達上調(diào)，且與let-7i的表達呈負相關(guān)。這些結(jié)果也確定了生物信息學的預測。

綜上所述，let-7i在乳腺癌中表達下調(diào)，可能通過靶向HMGA1在乳腺癌中發(fā)揮抑癌作用,有望為乳腺癌分子治療提供了新的靶點。