芮 雯 游思遠 吳小清 陳鴻策 陳宏遠

(廣東藥科大學基礎(chǔ)學院病原生物學與免疫學系，廣州510006)

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，每年全球約有136萬例患者被確診為結(jié)直腸癌，而約有70萬例患者直接或間接死于結(jié)直腸癌[1]。在中國，結(jié)直腸癌發(fā)病率、死亡率在惡性腫瘤中均位居前5，已成為嚴重危害我國人民健康的疾病。目前，對于結(jié)直腸癌主要采取根治性手術(shù)切除和化療為主。近年來，抗 PD-1 免疫治療的研究結(jié)果NCT01876511迎來結(jié)直腸癌免疫治療的突破性進展[2]，腫瘤免疫治療的興起為結(jié)直腸癌患者帶來新的希望。

腫瘤細胞的免疫原性細胞死亡(Immunogenic cell death，ICD)，是腫瘤細胞經(jīng)過特定的放化療或者免疫原性誘導劑處理后，在發(fā)生細胞凋亡的同時腫瘤細胞由非免疫原性轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂忻庖咴訹3]，激活免疫系統(tǒng)攻擊腫瘤細胞的一種抗腫瘤免疫效應(yīng)[4]。ICD的發(fā)生涉及多種信號分子參與，包括CRT、HSP70、HSP90等，其表達量的變化直接影響腫瘤細胞免疫的過程[5]。

而今植物多糖研究日益受到關(guān)注，實驗研究顯示，許多植物多糖具有調(diào)節(jié)免疫功能及抑制腫瘤等生物活性[6]?，F(xiàn)代醫(yī)藥學研究成果表明,香菇Lentinus edodes(Berk)sing具有增強免疫力、抗腫瘤等功能，香菇多糖是香菇主要生物活性分子之一。香菇多糖現(xiàn)已應(yīng)用于臨床，可用于增強細胞免疫功能，但未見其與結(jié)腸癌細胞ICD相關(guān)的報道。本文主要采用人結(jié)直腸癌上皮細胞SW837為模型，考察香菇多糖體外對SW837細胞存活率及ICD相關(guān)分子和共刺激分子等表達量的影響。

1 材料與方法

1.1材料 香菇多糖由本校范華鈞教授課題提供，純度>95 %；人結(jié)直腸癌上皮細胞SW837購自美國 ATCC 公司；PBS、DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶、RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素、鏈霉素等購自美國 Gibco公司；米托蒽醌(Mitoxantrone，MTX)購自美國Selleck生物科技有限公司；BV650標記的鼠抗人CD80單克隆抗體(BV650-CD80)購自美國BD公司；Percp/Cy5.5標記的鼠抗人Galectin9單克隆抗體(Percp/Cy5.5-Galectin9)、PE-TexasRed標記的鼠抗人CD155單克隆抗體(PE-TexasRed-CD155)、BV510標記的鼠抗人CD39單克隆抗體(BV510-CD39)、BV711標記的鼠抗人PDL-1單克隆抗體(BV711-PDL-1)等抗體購自美國Biolegend公司；BV605標記的鼠抗人CD47單克隆抗體(BV605-CD47)購自美國BD公司；APC標記的鼠抗人HSP70單克隆抗體(APC-HSP70)購自英國Biorbyt公司；PE標記的鼠抗人HSP90單克隆抗體(PE-HSP90)購自瑞士Enzo Life Science公司；FITC標記的山羊抗兔IgG二抗和FITC標記的鼠抗人CRT(FITC-CRT)抗體購自英國Abcam公司；CCK8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) SW837細胞采用含10% FBS及青、鏈霉素雙抗的1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中按常規(guī)方法培養(yǎng)。

1.2.2細胞存活率檢測與分析 按照CCK8說明書操作。取對數(shù)生長期的SW837細胞按1×105個/ml接種于96孔板中，每孔接種100 μl。細胞貼壁24 h后分別加入0.4～4 mg/ml的香菇多糖，每孔重復3次，并設(shè)置不加多糖的空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μl的CCK8工作液，避光孵育2 h，然后用酶標儀檢測各組待檢樣品在450 nm處的吸光度。

1.2.3腫瘤細胞免疫原性死亡相關(guān)分子及共刺激分子的檢測 取對數(shù)生長期的SW837細胞接種于24孔板中，細胞密度為2.0×105個/ml，每孔接種0.5 ml。細胞貼壁24 h后加入0.2～1 mg/ml的香菇多糖，并設(shè)置不加多糖的空白對照組和20 ng/μl MTX的處理組作為陽性對照，每孔重復3次。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，0.25%的胰酶消化收集細胞，過濾、重懸細胞使其終濃度為1×105個/ml。取100 μl細胞懸液于5 ml離心管中，加入1 μl 50 μg/ml BV650標記的CD80抗體在4℃避光孵育30 min。含1% FBS的PBS洗滌一次后，采用流式細胞儀檢測與定量分析各樣品中的BV650熒光強度。Galectin9、CD39、CD47、PDL-1、CD155、HSP70、HSP90、CRT等分子的表達檢測與分析類似前述方法進行。HSP90、HSP70、CRT分子表達量的檢測在多糖處理結(jié)束后需要用70%冷乙醇固定30 min后加PBS清洗2次，用1%BSA封閉20 min后，抗體標記檢測與分析采用上述類似方法進行。

2 結(jié)果

2.1香菇多糖對SW837細胞存活率的影響 0.04～4 mg/ml的香菇多糖處理SW837細胞48 h后，CCK8法檢測各實驗組細胞存活率的結(jié)果表明：香菇多糖對細胞的增殖具有明顯抑制作用且具有濃度依賴性，IC50為1.14 g/ml。

圖1 不同濃度的香菇多糖對SW837細胞存活率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of Letinous edodes polysaccharides on survival rate of SW837 cells

2.2香菇多糖對SW837細胞ICD相關(guān)分子表達的影響 以0.2～1 mg/ml的香菇多糖處理細胞48 h后，流式細胞術(shù)檢測細胞表面ICD相關(guān)分子CRT、HSP70、HSP90的表達。結(jié)果顯示：不同濃度的香菇多糖都能明顯誘導SW837細胞CRT、HSP70、HSP90表達量升高(圖2～4)。

圖2 不同濃度的香菇多糖對SW837細胞表達CRT的影響Fig.2 Effect of Letinous edodes polysaccharides on expression of CRT in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05，****.P<0.000 1.

圖3 不同濃度的香菇多糖對SW837細胞表達HSP90的影響Fig.3 Effect of Letinous edodes polysaccharides on expression of HSP90 in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05，****.P<0.000 1.

圖4 不同濃度的香菇多糖對SW837細胞表達HSP70的影響Fig.4 Effect of Letinous edodes polysaccharides on expression of HSP70 in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05，****.P<0.000 1.

2.3香菇多糖對免疫檢查點相關(guān)分子表達的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明：0.2～1 mg/ml 的香菇多糖都能明顯誘導SW837細胞免疫系統(tǒng)功能抑制性蛋白PDL-1、Galectin9、CD155、CD47、CD39表達量升高，且呈現(xiàn)濃度梯度依賴性(圖5～9)。

圖5 不同濃度的香菇多糖對SW837細胞表達PDL-1的影響Fig.5 Effect of Letinous edodes polysaccharides on PDL-1 expression in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05，****.P<0.000 1.

圖6 不同濃度的香菇多糖對SW837細胞表達Galectin9的影響Fig.6 Effect of Letinous edodes polysaccharides on Galectin9 expression in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05,****.P<0.000 1.

圖7 不同濃度的香菇多糖對SW837細胞表達CD155的影響Fig.7 Effect of Letinous edodes polysaccharides on CD155 expression in SW837 cellsNote：Compared with control group，**.P<0.01，****.P<0.000 1.

圖8 不同濃度的香菇多糖對SW837細胞表達CD47的影響Fig.8 Effect of Letinous edodes polysaccharides on CD47 expression in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

圖9 不同濃度的香菇多糖對SW837細胞表達CD39的影響Fig.9 Effect of Letinous edodes polysaccharides on CD39 expression in SW837 cellsNote：Compared with control group，**.P<0.01，***.P<0.001.

圖10 香菇多糖對SW837細胞表達CD80的影響Fig.10 Effect of Letinous edodes polysaccharides on CD80 expression in SW837 cellsNote：Compared with control group，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001.

2.4香菇多糖對共刺激分子表達的影響 流式細胞儀檢測CD80的結(jié)果顯示：0.2～1 mg/ml的香菇多糖處理后，實驗組的平均熒光強度與對照組相比顯著提高，表明香菇多糖能明顯誘導SW837細胞共刺激分子CD80表達量升高，且呈現(xiàn)濃度梯度依賴性(圖10)。

3 討論

香菇多糖是從香菇子實體中通過提取、分離和純化而得到有效活性成分。1970年由日本味之素公司首次開放，并于1988年批準進口我國，作為輔助治療惡性腫瘤的藥物。目前針對香菇多糖已有較多研究，涉及治療自身免疫功能低下而引起的各種疾病、慢性病毒性肝炎、保肝治療、作為腫瘤化療輔助藥物等[7]。

ICD的發(fā)生是經(jīng)過某些特定的藥物和放射線治療腫瘤過程中，可增強處于凋亡階段的腫瘤細胞從非免疫原性細胞轉(zhuǎn)化為免疫原性細胞，進而激活免疫系統(tǒng)，加強機體的抗腫瘤免疫效應(yīng)[8]。腫瘤細胞ICD的是一種有多種信號分子和細胞因子參與的復雜過程，包括細胞膜表面信號分子表達水平的改變，這些分子的細胞定位和表達水平的改變直接影響腫瘤細胞與免疫細胞，由此決定了腫瘤細胞的免疫原性[9]。

我們曾經(jīng)考察過香菇多糖對多種腫瘤細胞系，包括HT1299、PC-9、H1975、HLF、SW837、HepG2等不同來源的腫瘤細胞系的ICD相關(guān)分子的影響，此次篩選出多糖對SW837細胞的凋亡及免疫調(diào)節(jié)作用尤為明顯。本實驗進而采用SW837結(jié)腸癌細胞株為模型分別考察了香菇多糖對腫瘤細胞增殖的影響以及其對腫瘤細胞ICD相關(guān)分子CRT、HSP70、HSP90的作用。CRT是腫瘤細胞發(fā)生免疫原性死亡的重要的標志分子之一[10]。CRT的缺失抑制DC識別經(jīng)蒽醌類藥物處理的腫瘤細胞，重組CRT可以恢復DC對于腫瘤細胞的識別[11-13]。CRT在腫瘤細胞的表達對于DC對腫瘤細胞的識別、激活T細胞具有至關(guān)重要的作用[14]。HSPS是細胞在應(yīng)激原特別是環(huán)境高溫誘導下所生成的一組蛋白質(zhì)，腫瘤細胞在經(jīng)過藥物處理發(fā)生凋亡的時候，高度保守的HSPS跨膜轉(zhuǎn)位到細胞膜表面，細胞膜表面的HSP70、HSP90可以促進DC對腫瘤細胞的識別和吞噬，促進抗原呈遞，激活CD8+T細胞[15]。HSP70、HSP90、CRT表達量升高能誘導腫瘤細胞ICD的發(fā)生。

實驗還考察了香菇多糖對免疫檢查點分子PDL-1、Galectin9、CD155、CD47、CD39表達量的影響，免疫檢查點分子通過抑制免疫系統(tǒng)的抗腫瘤效應(yīng)和促進腫瘤生長。CTLA-4 和 PD-1/PD-L1等封鎖免疫檢查點分子的治療方法具有潛在的應(yīng)用前景[16,17]，而免疫檢查點分子的表達成為封鎖免疫檢查點分子治療的依據(jù)。程序性死亡受體-1(PD-1)可以與程序性死亡受體-配體1(PD-L1)結(jié)合，抑制T細胞的激活分化[18，19]。Galectin9與T細胞表面的配體Tim3結(jié)合，促進T細胞損耗，抑制T細胞的活性[20]。CD155 是脊髓灰質(zhì)炎病毒受體，與配體CD226 結(jié)合抑制免疫系統(tǒng)的抗腫瘤效應(yīng)[21,22]。CD47能使腫瘤細胞逃逸巨噬細胞的吞噬，逃逸免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的攻擊。CD39參與的外腺苷三磷酸-雙磷酸酶信號通路降解維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的ATP分子[20]，抑制免疫系統(tǒng)對腫瘤細胞的殺傷。本實驗結(jié)果顯示經(jīng)過香菇多糖處理的SW837細胞表面PDL-1、Galectin9、CD155、CD47、CD39分子表達量升高，針對免疫檢查點分子設(shè)計的特定蛋白質(zhì)抗體，阻止了PDL-1、Galectin9、CD155、CD47、CD39及其配體的識別過程，恢復部分T細胞功能，從而使T細胞可以殺死腫瘤細胞，我們的實驗結(jié)果為香菇多糖輔助封鎖免疫檢測點療法提供了實驗數(shù)據(jù)。最后我們考察香菇多糖對協(xié)同刺激分子CD80表達的影響，CD80作為CTLA-4的配體，其表達量與B細胞活化及T細胞刺激相關(guān)[23，24]。

上述實驗結(jié)果為香菇多糖抗結(jié)直腸癌免疫提供了體外實驗的依據(jù)，后續(xù)將體內(nèi)動物模型方面做出詳盡的實驗探討，豐富多糖通過免疫調(diào)節(jié)抗癌的實驗研究。