黃曉峰 侯春梅 余海韻 杜盈瑩 孫 茗 張紀巖 林 周

(軍事科學院軍事醫(yī)學研究院軍事認知與腦科學研究所,北京100850)

γδT細胞同αβT細胞一樣在胸腺中發(fā)育，屬于非經典T細胞的一個小亞群，通過模式識別受體識別多種微生物產物后擴增并釋放細胞因子，從而起到人體第一道免疫防線的作用[1,2]。我國正處于快速發(fā)展的轉型期，社會心理問題日益突出。慢性心理應激會導致下丘腦-垂體-腎上腺軸持續(xù)活化，應激激素糖皮質激素和兒茶酚胺水平持續(xù)升高[3-9]，進而導致經典T淋巴細胞凋亡性減少，這可能是長期的精神壓力和情緒低落導致機體對于細菌和病毒感染的抵抗力下降的原因[4]。慢性心理應激如何影響γδT細胞還不清楚。我們對此進行了探討。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物 6～8周齡雌性C57BL/6小鼠購自中國軍事醫(yī)學研究院實驗動物研究所，所有小鼠均在無特定病原體條件下飼養(yǎng)，所有手術均在戊巴比妥鈉麻醉下進行，并盡一切可能減少實驗動物的痛苦。該方案得到了軍事認知與腦科學研究所的批準。本研究中對小鼠的飼養(yǎng)、使用和治療均符合軍事認知與腦科學研究所制定的實驗動物使用指南。

1.1.2儀器和試劑 FACS Calibur型流式細胞儀,美國BD公司;普萘洛爾(Propranolol)、米非司酮(RU486)、多聚甲醛和疊氮鈉購自西格瑪化學公司；糖皮質激素地塞米松(Dexamethasone)購自MP Biomedicals公司；抗小鼠CD3和 抗小鼠γδTCR的熒光結合抗體購自eBioscience公司；凋亡試劑盒購自BioLegend公司。

1.2方法

1.2.1限制性束縛應激 按照隨機方法將小鼠分為束縛組和對照組。束縛組每只小鼠束縛在規(guī)格相同的通風良好的50 ml錐形管中，連續(xù)束縛5個晚上，時間為下午17:00到次日早上09:00。在每個約束循環(huán)之間清潔和消毒束縛管。小鼠可以在管子里來回移動，但不能轉身。對照組小鼠雖然不受束縛，但在相同時間段內禁食禁水。為了探討糖皮質激素的作用，每次束縛應激期前1 h給實驗組小鼠腹腔注射25 mg/kg RU486(溶于丙二醇/乙醇 7/3 v/v)。對照組注射相同體積的丙二醇/乙醇(7/3 v/v)。為了探討兒茶酚胺的作用，在每個束縛應激期前1 h給實驗組小鼠腹腔注射溶于0.9%生理鹽水的10 mg/kg普萘洛爾或相同體積的0.9%生理鹽水。

1.2.2流式細胞術 單細胞懸浮液在含有0.1%疊氮化鈉和2%FBS的PBS中在冰上與熒光結合抗體避光孵育30 min。同型抗體作為陰性對照。樣品細胞在染色緩沖液中清洗一次，然后在含有1%(w/v) 多聚甲醛的PBS中固定細胞并在4°C下避光保存。在Becton-Dickinson FACS Calibur machine 流式儀(BD Biosciences)上進行流式細胞術分析。

1.2.3細胞凋亡分析 為了研究慢性心理應激對小鼠體內γδT細胞凋亡的影響，將脾的單細胞懸浮液在含鈣離子的300 μl結合緩沖液中重新懸浮，用抗CD3-PE、抗γδTCR-APC和Annexin V-FITC對其進行染色。通過流式細胞術分析Annexin-V染色的CD3+γδTCR+細胞凋亡情況。為了分析糖皮質激素是否直接誘導γδT細胞凋亡，流式分選γδT細胞。在用或不使用0.1 mg/ml糖皮質激素孵育24 h后，將兩組細胞懸浮于300 μl含有鈣離子的結合緩沖液中，用抗CD3-PERCP、抗γδTCR-FITC、PI和Annexin V-APC對γδT細胞進行染色。通過流式細胞術分析Annexin V/PI染色的CD3+γδTCR+細胞凋亡情況。

2 結果

2.1限制性束縛導致小鼠胸腺和脾臟的器官重量和細胞數(shù)量減少 限制性束縛引發(fā)持續(xù)的生理和心理壓力反應，但對免疫器官的影響尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)5次16 h/次束縛對體重沒有顯著影響(圖1A)，但導致胸腺和脾臟萎縮(圖1B)。統(tǒng)計顯示胸腺和脾臟的重量顯著下降(圖1C)、胸腺細胞和脾細胞的數(shù)量顯著減少(圖1D)。因此，采用該束縛方法導致小鼠免疫器官受到嚴重影響。

2.2限制性束縛導致γδT細胞數(shù)量減少 本研究分析了胸腺、脾臟和腸系膜淋巴結中 CD3+γδTCR+的γδT細胞的百分比和數(shù)量。流式細胞術顯示，在應激小鼠的胸腺中，較為成熟的CD3+γδTCR-傳統(tǒng)T細胞和CD3+γδTCR+γδT細胞的百分比都有所增加，后者增加的幅度較小(圖2A)。因為應激小鼠胸腺中的總細胞數(shù)顯著減少，CD3+γδTCR-和CD3+γδTCR+細胞的絕對數(shù)都下降，γδT細胞絕對數(shù)的減少更為顯著(圖2B)。在脾臟和腸系膜淋巴結中，γδT細胞的百分比和數(shù)量的減少程度與CD3+γδTCR-傳統(tǒng)T細胞相似(圖2C～F)。

2.3糖皮質激素的外周作用導致應激小鼠γδT細胞數(shù)量減少 慢性心理應激與糖皮質激素和腎上腺激素的升高有關，但糖皮質激素和腎上腺素對于γδT 細胞是否有直接影響尚不清楚。為此，本研究首先對束縛組小鼠進行糖皮質激素拮抗劑RU486的全身給藥。實驗結果表明，束縛前對小鼠進行RU486處理能顯著逆轉胸腺、脾臟和腸系膜淋巴結中γδT細胞數(shù)量的減少(圖3)。

圖1 限制性束縛對小鼠胸腺和脾臟的器官重量和細胞數(shù)量的影響Fig.1 Effects of five 16 h restraint sessions on the organ weight and cell numbers of mouse thymus and spleenNote:The body weight was measured (A) and the thymus and spleen were isolated (B).Then the weight (C) and cell numbers of thymus and spleen (D) were measured.Results are expressed as

圖2 限制性束縛對γδT細胞數(shù)量的影響Fig.2 Effects of five 16 h restraint sessions on number of γδT cellsNote：Mononuclear cells from the thymus,spleen and mesenteric lymph nodes were subjected to flow cytometry for CD3 and γδTCR staining.A,C,E.Representative data；B,D,F.Absolute numbers.Results are expressed as

圖3 糖皮質激素受體抑制劑對γδT細胞數(shù)量下降的影響Fig.3 Effects of glucocorticoid receptor inhibitor on reduction of γδT cell numbers after five 16 h restraint sessionsNote：Percentages and cell numbers of γδT cells in immune organs.A.Represent date;B-D.Absolute numbers.Mononuclear cells from the thymus,spleen and mesenteric lymph nodes were subjected to flow cytometry for CD3 and γδTCR staining.Results are expressed as

2.4兒茶酚胺在應激小鼠γδT細胞數(shù)量減少中的作用不明顯 為了分析兒茶酚胺在慢性心理應激條件下γδT細胞減少中的作用，每次束縛前對小鼠進行普萘洛爾全身給藥，試驗結果表明，在5次束縛后，普萘洛爾對γδT細胞的減少幾乎沒有影響(圖4)。

圖4 β腎上腺素能受體抑制劑對γδT細胞數(shù)量下降的影響Fig.4 Effects of beta-adrenergic receptor inhibitor on reduction of γδT cell numbers after five 16 h restraint sessionsNote：Mononuclear cells from the spleen and mesenteric lymph nodes were subjected to flowcytometry for CD3 and γδTCR staining.A.Representative data；B and C.Absolute numbers.Results are expressed as

圖5 糖皮質激素對γδT細胞凋亡的影響Fig.5 Effects of glucocorticoid on apoptosis of γδT cellsNote：A-C.γδT cells were isolated from single-cell suspensions of the spleen.The purity of γδT cells was about 70% as confirmed by flow cytometry (A).After incubation with or without 0.1 mg/ml glucocorticoid for 24 h,apoptosis of γδT cells was assessed by flow-cytometric analysis of Annexin-V/PI staining in CD3+γδTCR+ cells；D-F.C57BL/6 mice were subjected to five 16 h restraint sessions or left untreated,n=3.Mononuclear cells from the spleen were subjected to apoptosis analysis for Annexin-V staining in CD3+γδTCR+ cells.B，D and E.Representative data；C and F.Statistical data expressed as

2.5糖皮質激素直接誘導γδT細胞凋亡 為了探索糖皮質激素是否像在傳統(tǒng)T細胞中那樣誘導γδT細胞凋亡，我們從脾臟中純化了γδT 細胞。如流式細胞術所證實，γδT細胞的純度約為70%(圖5A)。在用或不使用0.1 mg/ml糖皮質激素孵育24 h后，通過流式細胞術分析Annexin-V/PI染色的CD3+γδTCR+來評估γδT 細胞的凋亡情況。如圖5B和5C所示，糖皮質激素可以在體外直接誘導γδT細胞凋亡。與對照組小鼠相比，應激組小鼠脾臟中的γδT細胞凋亡率始終高于對照組小鼠(圖5E和5F)。

3 討論

有文獻報道提示腸黏膜中γδT細胞在應激壓力下數(shù)量減少[10]。在這項工作中，我們發(fā)現(xiàn)在慢性心理應激狀態(tài)，胸腺、脾臟和腸系膜淋巴結中γδT細胞減少。因此，γδT細胞非常容易受到心理壓力的影響，類似于傳統(tǒng)的T細胞。 慢性心理應激與持續(xù)升高的應激激素(如糖皮質激素和兒茶酚胺)水平有關[3,6]。我們發(fā)現(xiàn)全身給予糖皮質激素受體抑制劑RU486逆轉γδT細胞數(shù)的降低，而β腎上腺素能受體抑制劑普萘洛爾對γδT細胞的減少幾乎沒有影響。因此，在慢性心理應激過程中，糖皮質激素的作用應該比兒茶酚胺更重要。此外，糖皮質激素在體外直接誘導純化的γδT細胞凋亡，這與應激小鼠脾臟中γδT細胞的凋亡增強一致。因此，慢性心理應激通過糖皮質激素導致γδT細胞凋亡。γδT細胞是人體抗感染免疫第一道防線的關鍵組成成分[2]。慢性心理應激導致生物宿主對細菌和病毒感染的防御能力下降。因此，上述的研究結果表明，慢性心理壓力下γδT 細胞的減少降低了生物宿主抵抗各種感染的能力。