劉小明 周葳 楊補(bǔ)

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院骨科一區(qū)（廣州510799）；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院骨科一區(qū)（廣州510150）；3中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院脊柱外科（廣州510630）

前列腺癌是歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家最常見(jiàn)的男性惡性腫瘤。近年來(lái)，隨著我國(guó)人民生活水平的提高，前列腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且往往發(fā)現(xiàn)時(shí)已為進(jìn)展期［1］。萊菔硫烷（sulforaphane，SFN）是一種富含于十字花科植物內(nèi)的天然化合物，人類(lèi)日常飲食中的白菜、花菜、芥菜等十字花科植物中都含有SFN。SFN 也是十字花科植物中苦味的主要來(lái)源，研究發(fā)現(xiàn)SFN 對(duì)多種昆蟲(chóng)有致死毒性，在植物體內(nèi)，可能是作為一種防止動(dòng)物啃咬的保護(hù)性的物質(zhì)［2］。進(jìn)年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)SFN 有多種生物活性作用，例如保護(hù)心?。?-4］、抑制腫瘤發(fā)生等［5］。早年的流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)食用十字花科植物可以降低多種腫瘤的發(fā)生率，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SFN 為十字花科植物中主要的抗腫瘤因子［7］。目前國(guó)外研究證實(shí)SFN 可能通過(guò)誘導(dǎo)凋亡等途徑抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)［6-9］并對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用［10-11］。但目前其對(duì)前列腺癌的作用及其作用機(jī)制尚不明確。本研究擬進(jìn)一步探尋SFN 對(duì)前列腺癌細(xì)胞的作用。

1 材料及方法

1.1 材料人前列腺癌細(xì)胞株均購(gòu)自美國(guó)ATCC公司：BPH（良性前列腺增生上皮細(xì)胞株），22-RV1（前列腺癌原位腫瘤），PC3（骨轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞株），DU145（腦轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞株）LNCap（盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶）。SFN 購(gòu)自美國(guó)西格瑪奧德里奇公司。細(xì)胞培養(yǎng)所用胎牛血清及PRMI medium 1640 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司。CCK8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)凱基生物公司。PI 染色試劑及Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)BD 公司，primary rabbit anti-Bax 單克隆抗體及primary rabbit anti-Bcl-2 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司，Rabbit anti-GAPDH 多克隆抗體購(gòu)自中國(guó)博奧森公司。HRP-goat anti-rabbit IgG 購(gòu)自中國(guó)杰特偉公司。ECL 發(fā)光試劑盒及NC 膜購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為4 ～5 周BALB/C雄性裸鼠，購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。免疫組化試劑盒購(gòu)自中杉金橋公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)前列腺癌細(xì)胞株陪養(yǎng)均采用10%FBS 及90% PRMI medium 1640 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2環(huán)境陪養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)SFN 根據(jù)實(shí)驗(yàn)中相應(yīng)濃度培養(yǎng)基稀釋。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BPH，22RV1，PC-3，DU145 及LNCap 細(xì)胞懸液，接種于96 孔板，每孔接種2 000 個(gè)細(xì)胞，200 μL 培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)設(shè)每孔分別含有0、5、10、20 μmol/L SFN。加藥后48 h CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖率。Graphpad Prism 5.0 軟件繪制生長(zhǎng)圖。實(shí)驗(yàn)過(guò)程重復(fù)3 次。

1.4 細(xì)胞周期試驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC-3、DU-145及LNCap 細(xì)胞懸液，接種于6 孔板，每孔接種數(shù)為2×105個(gè)細(xì)胞，各細(xì)胞孔分別加入0、10、20 μmol/L SFN。加藥后48 h 胰酶消化細(xì)胞，PBS 洗2 遍后70%冰乙醇重懸，-30 ℃固定24 h。離心后PBS 清洗2 遍，行PI 染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，F(xiàn)lowjo7.6 軟件分析結(jié)果，ModFit LT 5.0 軟件分析細(xì)胞周期。實(shí)驗(yàn)過(guò)程重復(fù)3 次。

1.5 遷移試驗(yàn)采用孔徑0.8 μmol/L transwell 小室及24 孔板鋪板，LNcap 及DU145 細(xì)胞各105鋪小室內(nèi)，各孔分別加入0、10、20 μmol/L SFN，鋪板后48 h 后PBS 清洗小室1 遍，4 ℃甲醇固定20 min 后行結(jié)晶紫染色，去除上室細(xì)胞，倒置顯微鏡觀查，每孔隨機(jī)選取3 個(gè)視野細(xì)胞計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.6 Western blotSFN 各0、10、20 μmol/L 處理48 h 后 的PC3、DU145 及LNCap 細(xì) 胞 提 取 總 蛋 白行Western blot 檢測(cè)。采用SDS-PAGE 蛋白電泳，NC 膜轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉TBS-T 封閉1 h 后一抗及二抗孵育。ECL 發(fā)光試劑盒檢測(cè)目的蛋白表達(dá)，GAPDH 為內(nèi)參校準(zhǔn)。Western 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Imagine J 軟件量化，Graphpad Prism 5.0 軟件繪制量化圖。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)裸鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組各7 只，建模方法采用左側(cè)背部皮下接種5 × 105個(gè)PC-3 細(xì)胞（懸液50 μL，含25 μL PBS，25 μL matrigel）。建模后2 周開(kāi)始予以藥物干預(yù)：實(shí)驗(yàn)組每隔2 天給予50 μg SFN（10 μL）瘤體內(nèi)注射，對(duì)照組予以10 μL PBS 瘤體內(nèi)注射。接種后每周測(cè)量腫瘤最長(zhǎng)徑（a）及橫徑（b），腫瘤體積按V=1/2ab2計(jì)算。接種后6 周處死動(dòng)物，完整取下瘤體10%中性甲醛溶液固定。

1.8 組織實(shí)驗(yàn)皮下瘤組織常規(guī)行HE染色。免疫組化采用胃蛋白酶修復(fù)法，操步驟按試劑盒說(shuō)明操作，染色后常規(guī)樹(shù)脂封片后倒置顯微鏡拍片，免疫組化結(jié)果由3 名高年資病理科醫(yī)生盲法評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0-無(wú)信號(hào)，1-輕度表達(dá)，2-中度表達(dá)，3-高度表達(dá)。評(píng)分為隨機(jī)選取3 個(gè)鏡下觀察視野，計(jì)算每組的平均得分。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法克隆形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)及遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用方差分析，免疫組化評(píng)分采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)。P ＜0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SFN對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖的影響SFN對(duì)5種前列腺癌細(xì)胞株增殖均表現(xiàn)出了明顯的抑制作用（P＜0.05），對(duì)轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞株LNcap（盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移），PC3（骨轉(zhuǎn)移）及DU145（腦轉(zhuǎn)移）的抑制作用明顯高于增殖率較低的BPH（原位增生）及22RV1（原位癌）細(xì)胞株（圖1）。

2.2 SFN 對(duì)前列腺癌細(xì)胞周期及遷移能力的影響3種轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞株SFN處理后均誘導(dǎo)出明顯的G0期停滯，G2/M明顯縮短（圖2）。SFN對(duì)DU145 及LNcap 細(xì)胞株遷移能力表現(xiàn)出明顯抑制（P＜0.05，圖3）。

2.3 SFN 對(duì)Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響Western blot 結(jié) 果 示PC3、DU145 及LNCap 均 表 達(dá)Bax 及Bcl-2，SFN 顯 著 降 低DU145 及LNCap 的Bcl-2 表達(dá)，促進(jìn)Bax 表達(dá)（圖4）。

2.4 SFN 對(duì)小鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響兩組動(dòng)物操作中均無(wú)死亡及感染，術(shù)后6 周兩組動(dòng)物均存活良好。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3 周開(kāi)始腫瘤體積明顯小于對(duì)照組（P＜0.05，圖5），組織學(xué)HE 染色示兩組腫瘤細(xì)胞均呈現(xiàn)染色較淺的大核細(xì)胞，部分細(xì)胞呈現(xiàn)多核形態(tài)。實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織部分可見(jiàn)空泡及凋亡，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)極性紊亂，瘤內(nèi)血管生成明顯。免疫組化結(jié)果示Bax/Bcl-2均為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組Bax 表達(dá)較對(duì)照組增高（P＜0.05），Bcl-2 表達(dá)較對(duì)照組降低（P＜0.05，圖6）。

圖1 SFN 對(duì)不同侵襲力前列腺癌細(xì)胞株增殖的影響Fig.1 The effects of SFN on PCa cells proliferation（CCK8 test）

圖2 SFN 對(duì)前列腺癌細(xì)胞株增殖周期的影響Fig.2 The effects of SFN on PCa cells proliferating cycle

圖3 SFN 對(duì)LNCap、DU145 細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 The effects of SFN on LNcap and DU145cells migration

圖4 不同濃度SFN 對(duì)各細(xì)胞株Bax/Bcl-2 蛋白表達(dá)的影響Fig.4 The effects of different concentrations of SFN on PCa cells Bax/Bcl-2 expression

圖5 SFN 對(duì)荷瘤小鼠腫瘤大小的影響Fig.5 The effects of SFN on tumorigenesis of tumor mouse model

3 討論

本研究從細(xì)胞及動(dòng)物水平驗(yàn)證SFN 對(duì)前列腺癌的影響，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SFN 能抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖及侵襲，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。SFN明顯抑制腫瘤細(xì)胞Bcl-2 蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bax 表達(dá)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果示SFN 抑制前列腺癌皮下瘤的生長(zhǎng)，SFN 瘤內(nèi)注射可引起腫瘤組織凋亡，Bcl-2 表達(dá)降低。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，SFN 對(duì)低侵襲性細(xì)胞株增殖無(wú)明顯影響，對(duì)轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞株的增殖及侵襲均表現(xiàn)出明顯的抑制作用，細(xì)胞凋亡明顯增加。這種表觀現(xiàn)象似乎也與各細(xì)胞株間的Bax/Bcl 表達(dá)量有關(guān)，既往研究也提示Bax/Bcl-2 在正常及良性前列腺增生組織中低表達(dá)，而B(niǎo)cl-2 在惡性前列腺癌組織中高表達(dá)［7］。提示SFN 對(duì)前列腺癌細(xì)胞的抑制增長(zhǎng)作用與細(xì)胞的侵襲性相關(guān)，并可能通過(guò)Bax/Bcl 途徑發(fā)揮其生物學(xué)作用。

圖6 組織學(xué)結(jié)果Fig.6 Histology result

SFN 對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用可能與誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制環(huán)氧化酶2，抑制腫瘤血管生成及組蛋白修飾有關(guān)［11-14］，而誘導(dǎo)凋亡可能是SFN 腫瘤抑制作用的主要因素［11］。Bcl-2 是腫瘤抗凋亡的重要的因子，研究發(fā)現(xiàn)多種天然抗腫瘤成分均影響腫瘤細(xì)胞Bcl-2 的活性［8］。然而，SFN 也可能通過(guò)其他途徑發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡的作用，例如，MI 等［15］發(fā)現(xiàn)SFN 能夠通過(guò)抑制SAPK 的活性而引起人非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞的凋亡等，提示SFN 可能在不同的細(xì)胞內(nèi)通過(guò)不同的蛋白通路發(fā)揮作用。因此，SFN 對(duì)前列腺癌細(xì)胞的生物學(xué)作用，如相關(guān)細(xì)胞受體、下游相關(guān)的蛋白信號(hào)通路等尚需進(jìn)一步研究。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)SFN 對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖及侵襲的抑制作用，SFN 對(duì)低侵襲性的腫瘤細(xì)胞無(wú)明顯的毒性作用，也提示SFN 可能作為一種新的腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制因子，該研究為臨床前列腺癌的治療提供一個(gè)潛在的藥物治療靶點(diǎn)。