葛風(fēng) 蔣云召 王泳

無錫市第三人民醫(yī)院神經(jīng)外科（江蘇無錫214000）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是目前臨床上最常見腦腫瘤，約占所有顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的一半，每年新增約14 萬病例，65 歲以上人群發(fā)病率明顯增高［1］。由于晚期腫瘤浸潤性生長，與腦組織間無明顯邊界，難以做到全部切除，一般都主張綜合治療，患者5年生存期不足20%［2］。針對神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高和病死率高的特點(diǎn)，有必要探索新的治療手段，以延長其生存期和改善患者生存質(zhì)量。細(xì)胞凋亡與神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展密切相關(guān)，如何誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡已成為近年來研究熱點(diǎn)。caspase-3 蛋白是促細(xì)胞凋亡關(guān)鍵酶，通過調(diào)節(jié)凋亡信號通路傳導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡［3］。本研究構(gòu)建caspase-3 基因過表達(dá)慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染LN-18 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，觀察caspase-3 蛋白過表達(dá)對LN-18 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞移植瘤生長作用的影響，為caspase-3 蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人LN-18 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞購自上海榕柏生物技術(shù)有限公司；胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素、細(xì)胞培養(yǎng)耗材和胰蛋白酶均購自美國賽默飛生命科技公司；FITC 標(biāo)記的TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自上海生物工程有限公司；鼠抗人單克隆caspase-3 抗體、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗鼠IgG 均購自美國Abcom 公司；兔抗鼠β-actin 單克隆抗體購自美國sigma 公司。蛋白電泳儀為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品。上海吉瑪基因公司提供caspase-3 基因相關(guān)產(chǎn)品和慢病毒載體。

1.2 構(gòu)建caspase-3 轉(zhuǎn)染慢病毒在線搜索caspase-3 基因信息，設(shè)計模板序列基因，上游引物序列：5′-CCCGAATAAGAGAGAACCAAC-3′，下游序列：5′-CATTCCTTATATGTCTCCGTAC-3′，PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性（94 ℃）2 min；變性（94 ℃）45 s，退火（55 ℃）25 s，延伸（72 ℃）35 s，共35 次循環(huán)，延伸（72 ℃）6 min，抽提GV128 質(zhì)粒，利用自失活型慢病毒包裝系統(tǒng)，將包裝質(zhì)粒pHelper1.0、pHelper2.0和caspase-3 基因載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染239T 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h 后，1 000 r/min 高速離心，收集含caspase-3 基因慢病毒顆粒細(xì)胞上清液，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 體外轉(zhuǎn)染LN-18人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞待細(xì)胞融合至90%，0.25%胰蛋白酶消化，1 000 r/min 離心收集細(xì)胞，細(xì)胞重懸后以1 × 105個/mL 接種48 孔板。LN-18 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)為150，設(shè)置3 組，其中添加5 μg/mL Polybrene 和50 μL caspase-3 基因重組病毒上清液為轉(zhuǎn)染組，添加5 μg/mL Polybrene + 50 μL 陰性對照病毒上清液為對照組和不添加病毒上清液為空白組，37 ℃孵育10 h，更換細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育。

1.4 免疫印跡法檢測caspase-3 蛋白表達(dá)蛋白裂解液收集蛋白，檢測樣品總蛋白濃度（BCA 法），高溫致蛋白變性，80 V SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)膜2 h，5%牛血清蛋白封閉1 h，切割薄膜，加入1∶300 鼠抗人單克隆caspase-3 抗體，4 ℃孵育過夜，加入1∶1 000 HRP 標(biāo)記羊抗鼠二抗室溫孵育30 min，1∶1 000稀釋β-Actin 作為內(nèi)參，顯色定影，軟件分析雜交條帶。

1.5 構(gòu)建LN-18 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤移植瘤裸鼠模型待LN-18 細(xì)胞生長至對數(shù)期，胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，1640 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞（密度1×108個/mL），將上述細(xì)胞懸液注射至裸鼠背部皮下，200 μL/只，細(xì)胞數(shù)量約2 × 107個，共設(shè)轉(zhuǎn)染組、對照組和空白組，每組5 只裸鼠，每3 天記錄腫瘤大小情況，比較各分組瘤塊體積，瘤塊測量用長徑（a）×短徑（b）表示，單位cm，腫瘤體積=0.5×a×b2，接種21 d 后處死實驗動物，取出瘤塊，測量對比各組腫瘤體積。

1.6 腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞凋亡測定取出各分組腫瘤組織，甲醛固定，石蠟包埋，切片機(jī)制備5 μm 蠟塊切片，梯度酒精法脫蠟入水，置于0.2%曲拉通溶液破膜10 min，PBS 緩沖液清洗3 遍，加入25 μL TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測液，25 ℃避光孵育60 min，PBS 緩沖液清洗3 遍，熒光顯微鏡下觀察并拍照，利用IPP 軟件測定各組熒光積分光密度（integral optical density，IOD），以空白組為對照計算相對IOD 值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法以（± s）表示實驗結(jié)果，采用單因素多樣本方差分析比較多組間均值，采用t 檢驗比較兩組間均值差異，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率測定慢病毒載體可攜帶多種熒光標(biāo)記，體外轉(zhuǎn)染LN-18 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞72 h，流式細(xì)胞儀上樣檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)到83.7%（圖1 A），倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染LN-18 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（圖1B），熒光顯微鏡下觀察到滿視野綠色熒光分布（圖1C），證實其具備后續(xù)實驗應(yīng)用的可行性。

2.2 caspase-3蛋白表達(dá)轉(zhuǎn)染組、對照組和空白組caspase-3 蛋白相對表達(dá)量分別為（1.259 ± 0.238）、（0.181±0.079）和（0.147±0.069），轉(zhuǎn)染組caspase-3蛋白水平顯著增加（P ＜0.001），對照組與空白組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05，圖2）。

圖1 體外慢病毒轉(zhuǎn)染LN-18 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞Fig.1 LN-18 human glioma cells were transfected by lentivirus in vitro

圖2 各組Caspase-3 蛋白表達(dá)Fig.2 The expression of Caspase-3 protein in each group

2.3 腫瘤生長曲線測定每隔3 d 測量各組腫瘤生長體積，對比各分組腫瘤體積隨時間變化情況，至皮下移植21 d，轉(zhuǎn)染組、對照組和空白組瘤塊體積分別為（0.52 ± 0.17）、（2.61 ± 0.22）和（2.38 ±0.19）cm3，（F=104.241，P=0.021 89），表明腫瘤生長受到明顯抑制（圖3）。

2.4 細(xì)胞凋亡分析本研究采用FITC 標(biāo)記凋亡信號，當(dāng)綠色信號越高時，表明細(xì)胞凋亡越明顯。移植皮下成瘤21 d 后，轉(zhuǎn)染組、對照組和空白組熒光強(qiáng)度分別為（6 572±1 319）、（908±199）和（875 ± 262），轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡數(shù)目顯著高于空白組和對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（圖4，P ＜0.001）。

圖3 腫瘤生長體積測定Fig.3 Tumor growth volume determination

圖4 細(xì)胞凋亡率測定（×100）Fig.4 The measurement of cell apoptosis

3 討論

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自主程序性死亡，其中涉及多種基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用［4］。細(xì)胞凋亡與腫瘤細(xì)胞分化程度、腫瘤組織學(xué)分級、淋巴轉(zhuǎn)移程度和腫瘤臨床分期均存在顯著相關(guān)性［5］。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是治療癌癥的創(chuàng)新思路。細(xì)胞凋亡均伴隨著caspase 基因激活和異常表達(dá)，caspase-3 蛋白是細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，活性caspase-3 可降解相應(yīng)的胞漿胞核底物，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，當(dāng)caspase-3 活性受到抑制，則出現(xiàn)細(xì)胞凋亡異常，從而誘發(fā)腫瘤［6］。caspase-3 蛋白在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，陽性率達(dá)到78.85%（41/52），而正常組織caspase-3 蛋白陽性率僅15.38%（2/13）［7］。同時，藥物誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡常常伴隨著caspase-3基因激活和caspase-3 蛋白高表達(dá)，暗示其為誘導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞死亡過程中的一項重要環(huán)節(jié)［8］。另外，神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤分期越高，caspase-3 蛋白陽性表達(dá)率越低，這提示caspase-3 蛋白表達(dá)水平與神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度及患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)［9］?；谝陨鲜聦?，擬利用基因工程技術(shù)促caspase-3 蛋白過表達(dá)，則有望治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤。

慢病毒屬是反轉(zhuǎn)錄病毒科下的一種分支，可產(chǎn)生更加穩(wěn)定的體外轉(zhuǎn)染效果，通過細(xì)胞表面受體和慢病毒膜糖蛋白相互作用進(jìn)入宿主細(xì)胞，可使其持續(xù)表達(dá)目的蛋白［10］。脂質(zhì)體和質(zhì)粒是目前實驗室常用轉(zhuǎn)染劑，其操作方法簡單，但兩者細(xì)胞轉(zhuǎn)染率均較低，生物安全性不高，且存在較明顯細(xì)胞毒性［11-12］。與之相比，慢病毒轉(zhuǎn)染效率明顯升高，且與轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞類型密切相關(guān)，通常可達(dá)50%～80%［13］。筆者利用慢病毒轉(zhuǎn)染LN-18 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，體外轉(zhuǎn)染實驗中，利用流式細(xì)胞儀檢測GV128 慢病毒載體轉(zhuǎn)染效率高達(dá)83.7%，筆者推測這種高轉(zhuǎn)染效率與本研究選用的LN-18 細(xì)胞類型密切相關(guān)，LN-18 膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性強(qiáng)，其慢病毒轉(zhuǎn)染率隨之升高。觀察caspase-3 基因過表達(dá)對于移植瘤生長的影響是本研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。既往有學(xué)者采用慢病毒瘤體注射方式，但這種方式存在試劑浪費(fèi)，注射不均勻，體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率低且無法準(zhǔn)確檢測等諸多缺陷［14-15］。本研究在體外預(yù)先利用caspase-3 基因過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染LN-18 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，隨后再皮下注射移植成瘤，則可避免慢病毒瘤體注射缺陷，使實驗過程變得更為清晰和可控。體內(nèi)結(jié)果證實，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率明顯增加，腫瘤生長體積明顯受到抑制。

綜上，通過基因重組技術(shù)構(gòu)建caspase-3 基因過表達(dá)慢病毒載體，體外轉(zhuǎn)染人LN-18 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，可顯著促進(jìn)LN-18 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，明顯抑制腫瘤生長，具有良好的神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療應(yīng)用潛力。