湯 陽，孔文韜，張小龍，李翠仙，張煒彬，王文平

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院超聲科，上海 200032；

2. 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院超聲科，江蘇 南京 210008；

3. 上海市影像醫(yī)學(xué)研究所，上海 200032

抗血管生成藥物是腫瘤治療中除手術(shù)、放化療以外的極具潛力的輔助治療手段[1］，應(yīng)用越來越廣。其中，貝伐單抗（Bevacizumab）通過直接阻斷血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）引起腫瘤血管減少而切斷腫瘤營養(yǎng)和氧氣的來源，血管內(nèi)皮生長因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）在腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高度表達(dá)，而在正常組織表達(dá)保守[2］。本研究用磷脂質(zhì)包覆的USphereTM造影劑，內(nèi)含全氟化碳?xì)怏w，通過“生物素-親和素”橋接法與VEGFR2單克隆抗體相接，構(gòu)成靶向腫瘤新生血管的分子探針，探討其監(jiān)測貝伐單抗抑制腫瘤血管生成過程中腫瘤血流灌注變化的潛力及應(yīng)用價值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗細(xì)胞與動物

人肝癌細(xì)胞系HCCLM3購自復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所。

無特定病原體級BALB/c-nu/nu雄性裸小鼠12只，6周齡，購自復(fù)旦大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 主要實驗試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司，磷酸鹽緩沖生理鹽水購自賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司，青-鏈霉素溶液購自吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，USphereTMLabeler全氟化碳微泡購自中國臺灣博信生物科技股份有限公司，生物素化大鼠抗小鼠CD309單克隆抗體購自美國BioLegend公司，兔抗鼠CD31單克隆抗體購自英國Abcam公司，a.max AM-1高速振蕩器購自中國臺灣茂杰產(chǎn)業(yè)股份公司，PHILIPS iU22彩色多普勒超聲成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 HCCLM3皮下移植瘤模型的建立

人肝癌HCCLM3細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（含青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL）中生長，培養(yǎng)條件為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、完全飽和濕度，用0.25%胰蛋白酶溶液和0.02%乙二胺四乙酸溶液消化傳代。收集對數(shù)生長期的HCCLM3細(xì)胞，用0.9% NaCl溶液清洗3次，制成單細(xì)胞懸液，每只裸小鼠右肩背部皮下接種5×106個HCCLM3細(xì)胞（0.2 mL），待腫瘤長徑增至7 mm左右（接種后約3周）開始實驗。

1.2.2 靶向VEGFR2超聲微泡的制備

將USphere? Labeler微泡于室溫下置入專用高速振蕩器內(nèi)，設(shè)置振蕩時間為30 s，活化后產(chǎn)生微氣泡。從瓶內(nèi)抽取適量微泡與生物素化VEGFR2單克隆抗體于室溫下混合，放置15 min，不時輕輕混勻。將修飾成功的微泡用0.9% NaCl溶液稀釋至0.5 mL，1 000 r/min離心洗滌3 min，棄去下清液以去除未修飾成功的靶標(biāo)分子，重復(fù)洗滌3次，完成制備。

1.2.3 超聲造影檢查

將12只荷瘤鼠隨機分成對照組和治療組，每組6只。治療組每只裸小鼠給予貝伐單抗0.2 mg（25 mg/mL），用0.9% NaCl溶液稀釋至0.1 mL行瘤內(nèi)注射，對照組瘤內(nèi)注射等體積的0.9% NaCl溶液，每3 d給藥1次，共給藥2次。治療前（第0天）、治療第2和7天分別行超聲造影檢查。采用PHILIPS iU22彩色多普勒超聲診斷系統(tǒng)L12-5線陣探頭，機械指數(shù)諧波造影技術(shù)，設(shè)定動態(tài)范圍83 dB，機械指數(shù)0.07，幀頻12 Hz，深度25 mm，焦點位于腫瘤下方，盡量避開腫瘤，減少超聲波照射對微泡的破壞，以獲得最佳超聲造影效果。裸小鼠麻醉后取俯臥位固定，用二維超聲測量腫瘤大小，根據(jù)公式長×寬×厚/2計算腫瘤體積，清晰顯示腫瘤最大切面圖像后探頭保持不動，切換到造影模式，尾靜脈一次性團注靶向微泡1.0×108bubbles/只（50 μL），錄像3 min后立即采用高聲壓爆破技術(shù)破壞腫瘤內(nèi)殘余微泡，再次錄像30 s。計算微泡破壞前后穩(wěn)定的平均灰階強度值，兩者之差用于估計血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合的微泡量。

1.2.4 病理學(xué)檢查

末次造影結(jié)束后，過度麻醉處死荷瘤鼠，沿腫瘤包膜完整剝離腫瘤，用10%中性甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，行H-E染色及CD31免疫組織化學(xué)染色。

1.2.5 造影結(jié)果及圖像分析

應(yīng)用Interface Design定量分析軟件繪制時間-強度曲線（time-intensity curve，TIC），選取有增強的腫瘤實質(zhì)為感興趣區(qū)，排除始終未見增強的壞死區(qū)域及周圍高增強的包膜，得到以下灌注參數(shù)：達(dá)峰時間（time to peak，TTP）、峰值強度（peak intensity，PI）、平均渡越時間（mean transit time，MTT）、曲線下面積（area under curve，AUC）及流入相曲線下面積（area under wash-in curve，WiAUC）、曲線上升及下降斜率等，對比分析2組間定量參數(shù)的差異并縱向比較組內(nèi)各參數(shù)的變化。

1.2.6 微血管密度（microvessel density，MVD）的計算

通過計算MVD判斷腫瘤血管生成。首先在低倍鏡（×40和×100）下觀察，每張切片確定4個血管最密集區(qū)，然后在每個密集區(qū)選取1個高倍視野（×200）計數(shù)微血管數(shù)，4個區(qū)域的微血管平均值即為測定的MVD（個/HP）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 動物模型

12只BALB/c裸小鼠均成瘤，3周后肩背部隆起皮下種植瘤長徑約7 mm，皮膚表面光滑無破潰。至觀察終點，對照組2只裸小鼠因麻醉反應(yīng)死亡，余10只荷瘤鼠均存活。

2.2 腫瘤生長曲線

對照組與治療組第0天體積分別為（0.119±0.057）cm3（0.038～0.143 cm3）與（0.157±0.076）cm3（0.063～0.245 cm3），兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.383），治療第2天和第7天兩組間腫瘤體積及體積增長率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?？v向觀察兩組內(nèi)腫瘤體積及體積增長率，均顯著增長（P＜0.05，圖1）。

2.3 造影圖像分析及TIC定量結(jié)果

經(jīng)荷瘤鼠尾靜脈一次性團注入造影劑后，腫瘤包膜和周圍肌肉組織快速增強并持續(xù)高增強，腫瘤實質(zhì)隨后明顯增強，迅速達(dá)到峰值后緩慢下降，表現(xiàn)為整體均勻及不均勻增強，少見未增強的無灌注區(qū)域（圖2）。

與治療前相比，治療第2天兩組各參數(shù)的組內(nèi)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療第7天，治療組TTP、MTT明顯縮短，AUC減低，下降斜率明顯增加，PI反而少許增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。對照組除PI顯著增強外[（20.4±3.5）dB和（26.0±3.3）dB，P=0.002］，其余參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

比較兩組間相關(guān)定量參數(shù)，治療第7天治療組WiAUC明顯低于對照組[（36.4±11.6）dB·s和（61.9±12.4） dB·s，P= 0.010］，腫瘤內(nèi)微泡爆破后灰階強度下降值也明顯低于對照組[（3.7±1.7）dB和（6.2±1.4）dB，P=0.029］。

2.4 病理學(xué)檢查結(jié)果

鏡下觀察，對照組及治療組內(nèi)均可見小片壞死灶散在分布，為小灶性無結(jié)構(gòu)、嗜酸性物質(zhì)，其中可見少量略呈嗜堿性的細(xì)胞核碎屑，活性腫瘤細(xì)胞可沿血管豐富的間質(zhì)分布或位于包膜下。至觀察終點時，對照組與治療組MVD值分別為18.4±7.6和8.3±2.1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.039，圖3）。

圖1 腫瘤生長曲線

圖2 對照組與治療組各時間點造影圖像

表1 TIC相關(guān)定量參數(shù)的比較

圖3 對照組與治療組H-E染色（×40）及CD31免疫組織化學(xué)染色（×200）結(jié)果

3 討 論

VEGF在調(diào)節(jié)肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）血管生成中起關(guān)鍵作用，與HCC侵襲性和預(yù)后密切相關(guān)。貝伐單抗是重組人源VEGF單克隆抗體，通過阻斷VEGF促血管生成的生物學(xué)作用而抑制腫瘤內(nèi)血管新生。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，低實體腫瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST）反應(yīng)的部分患者總生存率卻顯著提高，提示預(yù)后與腫瘤內(nèi)血管生成及壞死密切相關(guān)[3］。

本研究利用“生物素-親和素”橋接法制備VEGFR2為靶點的超聲微泡，用于腫瘤血管的特異性顯像。使用的USphereTMLabeler微泡直徑約1 μm，與其他較大粒徑的微泡相比，其能通過高通透性和滯留效應(yīng)在腫瘤組織中形成選擇性分布[4］以提高顯像效果，旨在早期敏感地顯示抗血管生成治療后腫瘤微循環(huán)灌注的變化。HCCLM3起源于MHCC97細(xì)胞株，具有高侵襲性及轉(zhuǎn)移潛能，35 d的裸小鼠皮下移植瘤模型100%發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移，其中HCCLM3細(xì)胞本身高表達(dá)VEGF參與新生血管生成[5-6］。

Lassau等[7-8］發(fā)現(xiàn)，HCC患者采用貝伐單抗治療3 d后，AUC、TTP的變化與2個月后的治療反應(yīng)及生存率明顯相關(guān)；對接受抗血管生成藥物治療的不同類型實體腫瘤患者行超聲造影檢查，發(fā)現(xiàn)貝伐單抗治療7 d后的MTT與無進(jìn)展生存期顯著相關(guān)，尤其在乳腺癌及結(jié)腸癌患者中相關(guān)性較顯著，以此作為血管正?；纳飳W(xué)指標(biāo)用于轉(zhuǎn)移性腫瘤患者的結(jié)局預(yù)測。本研究發(fā)現(xiàn)，治療第7天治療組TTP、MTT較治療前明顯縮短，AUC明顯減低，與上述臨床研究結(jié)果一致。

Klotz等[9］對小鼠LLC-1皮下移植瘤模型予以抗血管生成藥物治療14 d后，PI和AUC出現(xiàn)明顯下降。另外1項針對腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的研究顯示，接受貝伐單抗治療的一部分患者腫瘤縮小與超聲造影灌注參數(shù)PI的早期變化之間存在相關(guān)性[10］。然而，本研究發(fā)現(xiàn)治療第7天治療組PI反而稍有增強，腫瘤體積及體積增長率也有明顯增長，與以往研究結(jié)果不完全一致，可能與HCCLM3細(xì)胞株的生物學(xué)特性及其對貝伐單抗的敏感性有關(guān)，腫瘤血管分布的空間異質(zhì)性及樣本量偏小也是重要影響因素。

Sugimoto等[11］對肝癌患者中索拉非尼的療效進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)治療14 d時WiAUC與治療反應(yīng)顯著相關(guān)，治療7 d時WiAUC與無進(jìn)展生存期及總生存期最相關(guān)。另1項研究通過構(gòu)建大鼠人結(jié)直腸腺癌皮下移植瘤模型行靶向VEGFR2超聲造影，發(fā)現(xiàn)給藥第7天治療組WiAUC顯著下降，對照組則無明顯變化，且治療組造影晚期微泡結(jié)合量明顯低于對照組，還伴有治療組VEGFR2、CD31和Ki-67陽性細(xì)胞明顯減少[12］。本研究發(fā)現(xiàn)，貝伐單抗治療7 d后，治療組WiAUC明顯低于對照組，腫瘤內(nèi)微泡爆破后平均灰階強度下降值和MVD值也明顯低于對照組，提示治療引起腫瘤血管生成減少，腫瘤血管內(nèi)皮捕獲的靶向微泡數(shù)量相應(yīng)減少，與既往文獻(xiàn)一致。

本研究的局限性在于二維超聲造影無法顯示腫瘤灌注的空間異質(zhì)性，單獨分析中心切面評價抗血管生成治療效果易造成對療效的高估[13］，而近年來三維超聲造影的發(fā)展彌補了這一缺陷。Zhou等[14］對人結(jié)腸癌皮下移植瘤模型采用貝伐單抗治療24 h，利用三維超聲造影即觀察到PI和AUC顯著降低，這種灌注參數(shù)的早期改變與治療10 d的抗血管生成治療反應(yīng)明顯相關(guān)。另1項類似研究利用靶向VEGFR2的超聲微泡行三維超聲分子成像，與對照組相比，單次抗血管生成治療后PI和相對血容量顯著降低，與VEGFR2表達(dá)和微血管比例降低相一致，而與其他灌注參數(shù)無明顯相關(guān)[15］。此外，各時間點造影圖像少見未增強的無灌注區(qū)域，鏡下觀察對照組和治療組均可見活性腫瘤組織間小片壞死灶散在分布，未形成大片的中央性及偏心性壞死區(qū)域，可能與觀察周期較短、腫瘤體積較小相關(guān)，因此較難對壞死情況進(jìn)行準(zhǔn)確的定量評價。而對轉(zhuǎn)移部位的觀察與評價還需借助其他影像學(xué)手段及病理學(xué)檢查，尤其是發(fā)現(xiàn)肺部病灶。

綜上所述，貝伐單抗阻斷VEGF/VEGFR2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路干擾肝癌組織新生血管形成，靶向VEGFR2的超聲造影能早期敏感地顯示該過程中腫瘤微循環(huán)灌注的變化，包括TTP、MTT及AUC在內(nèi)的多項與灌注相關(guān)的定量參數(shù)，對抗血管生成藥物療效的早期評價具有重要價值。