成鳳花，胡進(jìn)玲，史敏,黨淑鐘,李彥忠,*

(1.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特010010)

紫花苜蓿(Medicagosativa)為豆科苜蓿屬多年生草本植物，根系發(fā)達(dá)，具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、適應(yīng)性廣、抗逆性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)效益高、生態(tài)性能好等優(yōu)點(diǎn)，素有“牧草之王”和“飼料皇后”的美譽(yù)[1-2]，在我國(guó)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整和草地生態(tài)建設(shè)中發(fā)揮著極其重要的作用。目前對(duì)紫花苜蓿栽培的研究主要為田間高產(chǎn)栽培苜蓿，集中于水分、施肥[3]、灌溉[4]、刈割[5]和種植密度[6]等，關(guān)于室內(nèi)栽培苜蓿的研究主要集中于鹽脅迫[7]等機(jī)理方面，雖然也有關(guān)于室內(nèi)栽培苜蓿的營(yíng)養(yǎng)方面的研究，如薛崢等[8]研究了不同營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)紫花苜蓿苗期根系生長(zhǎng)的影響，王茜等[9]采用盆栽半控制試驗(yàn)研究土壤水分和施氮水平對(duì)紫花苜蓿苗期生長(zhǎng)的互作效應(yīng)，但有關(guān)室內(nèi)培養(yǎng)出生長(zhǎng)健康、整齊的苜蓿植株所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類比較的研究較為缺乏。

致病性測(cè)定是牧草病害研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，據(jù)科赫式法則[10]，通常需將病株上分離到的多種微生物接種至生長(zhǎng)健康且長(zhǎng)勢(shì)一致的苜蓿植株上，若接種苗發(fā)病而對(duì)照苗仍然生長(zhǎng)健康，則可確定測(cè)試的接種體為致病菌。然而，本研究團(tuán)隊(duì)在溫室內(nèi)栽培苜蓿準(zhǔn)備用于接種時(shí)，通常將土壤滅菌，澆灌自來水，結(jié)果苜蓿植株出現(xiàn)葉片黃化、干枯和脫落的狀況，部分植株甚至死亡，無法滿足接種之用。光溫脅迫[11-12]、水分不足[13]、養(yǎng)分缺乏[14]以及土壤/種子中的病原雜菌[15]等均可導(dǎo)致出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。溫室中栽培苜蓿時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)生長(zhǎng)不良的狀況，是否是光照不足、土壤養(yǎng)分缺乏抑或是自來水中某些物質(zhì)影響了苜蓿生長(zhǎng)，至今尚未澄清。

本研究的目的為試驗(yàn)溫室培養(yǎng)苜蓿時(shí)是否由于提供給苜蓿的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的種類及其含量影響了苜蓿的生長(zhǎng)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試苜蓿品種為隴東苜蓿，于2016年購(gòu)自克勞沃種子公司，保存于蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種質(zhì)資源庫(kù)。供試土壤采自花市，為黑壤土，經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧研究所輻照中心鈷60輻照滅菌，確定土壤無菌。

供試營(yíng)養(yǎng)液有2種，其中施可得植物生長(zhǎng)液(compound fertilizer)購(gòu)自美國(guó)Scotts有限責(zé)任公司子公司施可得園藝肥料武漢有限公司，包裝說明上注明的成分為：除大量元素氮(30 g·L-1)、磷酐(15 g·L-1)、氧化鉀(17.5 g·L-1)，中量元素氧化鎂(1.3 g·L-1)、硫(1.7 g·L-1)外，還含有植物茁壯成長(zhǎng)所必須的螯合態(tài)微量元素(總含量≥0.2 g·L-1)，使用時(shí)4 L蒸餾水中加入30 mL施可得植物生長(zhǎng)液，故稀釋后氮磷鉀濃度分別為N (225 mg·L-1)、P (49 mg·L-1)、K (109 mg·L-1)。另一種營(yíng)養(yǎng)液為霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液[8]，主要成分為四水硝酸鈣、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、碘化鉀、四水氯化錳、硫酸鋅、硫酸銅、鉬酸鈉、氯化鈷和五水檸檬酸鐵(均購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠)，經(jīng)計(jì)算其氮磷鉀濃度為N (210 mg·L-1)、P (31 mg·L-1)、K (234 mg·L-1)，使用時(shí)用1 mol·L-1的NaOH將霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液pH調(diào)至6.8[16]。供試自來水和蒸餾水與實(shí)驗(yàn)室常用的一致，其中自來水pH為8.08。

1.2 方法

1.2.1試驗(yàn)方法 試驗(yàn)于2017年，在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院實(shí)驗(yàn)室病原菌接種苗培養(yǎng)溫室內(nèi)進(jìn)行，溫室中每天光照16 h(光照強(qiáng)度6680 LUX)，溫度為(22±1) ℃；黑暗8 h，溫度(18±1) ℃，溫度由雙空調(diào)控制；溫室平均濕度為65%～80%。試驗(yàn)采用盆栽法，盆的上口徑7.3 cm，下口徑6.2 cm，高9 cm，裝入160 g過2 mm篩的滅菌鮮土。在體視顯微鏡下選取大小均等、籽粒飽滿的苜蓿種子，常規(guī)消毒并催芽48 h后(胚長(zhǎng)約2～3 cm)移栽至裝有滅菌鮮土的花盆中，每盆5株，共移栽20盆，隨機(jī)擺放于溫室的架子上定期轉(zhuǎn)盆。

本試驗(yàn)設(shè)施可得植物生長(zhǎng)液、霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液、自來水和蒸餾水4個(gè)處理，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，出苗后分別澆灌上述液體。初次澆水時(shí)按土壤最大持水量的75%澆灌，以后按植株大小和土壤濕潤(rùn)程度澆灌，即第1、2周，隔2 d澆1次；第3周，隔1.5 d澆1次；第4周，隔1 d澆1次，每次均為40 mL。移栽第4周后取樣，保存于-20 ℃冰箱待測(cè)。

1.2.2測(cè)定指標(biāo) 移栽后每周測(cè)量一次株高，觀察植株生長(zhǎng)狀況，對(duì)出現(xiàn)的異常表現(xiàn)拍照。第4周后統(tǒng)計(jì)分枝數(shù)、分枝部位、節(jié)間數(shù)和葉片數(shù)，取樣后每個(gè)處理測(cè)定15株的地上、地下的鮮重和干重，以干重?cái)?shù)據(jù)計(jì)算根冠比；每處理取10株根系，用濃度為1 g·L-1的甲基藍(lán)溶液染色5～10 min，蒸餾水沖洗根部殘留的染液數(shù)次至無殘留，分散后放入盛有適量蒸餾水的透明有機(jī)玻璃盤中，用鑷子將重疊的根系充分展開，用Epson V700彩色圖像掃描儀掃描苜蓿根系，Scoots掃描分析軟件讀取根表面積和根直徑數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 22.0軟件進(jìn)行ANOVA方差分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 植株生長(zhǎng)狀況

子葉褪綠、變黃、干枯的時(shí)間不同(圖1A)：澆灌自來水和蒸餾水的植株出現(xiàn)在第13天，澆灌霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液的植株出現(xiàn)在第20天，而澆灌施可得植物生長(zhǎng)液的植株在收獲時(shí)子葉保持綠色。

圖1 收獲時(shí)4種處理下苜蓿植株的子葉、單葉、復(fù)葉和莖干(A)以及生長(zhǎng)狀況(B)Fig.1 The cotyledon leaves, single leaves, compound leaves and stems (A) of the plants under four treatments at the harvest and growth status of the plants (B) 圖中小寫字母a、b、c和d分別表示施可得植物生長(zhǎng)液、霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液、蒸餾水和自來水處理。The lowercase letters a, b, c and d in the Figure represent compound fertilizer, Hoagland’s nutrient solution, distilled water and tap water treatment, respectively.

真葉褪綠、莖干粗壯(圖1A)、植株長(zhǎng)勢(shì)不同：澆灌自來水和蒸餾水的植株基部真葉自下而上逐漸變黃、干枯，自葉邊緣向內(nèi)褪綠，葉片出現(xiàn)褪綠黃斑，且葉小，葉柄及葉脈呈紅褐色，莖干纖細(xì)，節(jié)間短。在澆灌蒸餾水的植株上此癥狀更明顯，澆灌霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液的植株也出現(xiàn)類似現(xiàn)象，整株矮化、生長(zhǎng)細(xì)弱，莖干呈紅褐色，而澆灌施可得植物生長(zhǎng)液的植株未出現(xiàn)葉片褪綠等以上現(xiàn)象，且植株高大、葉片嫩綠、莖稈粗壯(圖1B)。

2.2 株高

第1周各處理間的株高差異不顯著(P>0.05)；第2周時(shí)，澆灌施可得植物生長(zhǎng)液的苜蓿株高顯著(P<0.05)高于自來水，霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液、蒸餾水與自來水處理間株高差異不顯著(P>0.05)；第3周，澆灌施可得植物生長(zhǎng)液和霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液的株高顯著(P<0.05)高于自來水180%和34%，蒸餾水與自來水處理間株高差異不顯著；第4周，施可得植物生長(zhǎng)液和霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液處理的苜蓿株高亦顯著(P<0.05)高于自來水256%和88%，蒸餾水與自來水處理間株高差異仍不顯著(圖2)。同時(shí)，自來水、蒸餾水、施可得植物生長(zhǎng)液和霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液處理的苜蓿幼苗的株高生長(zhǎng)量在4周內(nèi)分別為4.6、4.5、16.5和8.7 cm，且施可得植物生長(zhǎng)液處理下第3周時(shí)苜蓿生長(zhǎng)量最大，生長(zhǎng)速率達(dá)1.15 cm·d-1，而自來水的僅為0.28 cm·d-1(圖2)。

圖2 移栽后4周中4種處理下苜蓿的株高和生長(zhǎng)速率Fig.2 The plant height and the growth rate of alfalfa under four treatments at four weeks after transplanting 不同大寫字母代表同一時(shí)間不同處理下的差異顯著性(P<0.05)，小寫字母代表同一處理下不同時(shí)間的差異顯著性(P<0.05)。Different capital letters for the significant differences (P<0.05) in different treatments at the same time, and lowercase letters for the significant differences (P<0.05) in different time under the same treatment.

測(cè)定指標(biāo)Index自來水Tap water蒸餾水Distilled water施可得植物生長(zhǎng)液Compound fertilizer 霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液Hoagland’s nutrient solution地上鮮重Shoot fresh weight (g·plant-1)0.05±0.025c0.04±0.012c0.45±0.029a0.12±0.012b地上干重Shoot dry weight (g·plant-1) 0.01±0.002c0.01±0.003c0.08±0.006a0.03±0.009b根鮮重Root fresh weight (g·plant-1)0.03±0.006c0.03±0.003c0.15±0.006a0.06±0.004b根干重Root dry weight (g·plant-1)0.01±0.001c0.01±0.001c0.08±0.006a0.03±0.002b根冠比Root to crown ratio0.93±0.295a0.87±0.137a0.34±0.034b0.56±0.058ab 根表面積Root area (mm2) 221.30±4.145c203.18±5.138c444.88±13.106a309.94±10.723b根直徑Root diameter (mm)0.42±0.003c0.40±0.007c0.53±0.009a0.45±0.007b葉片數(shù)Numbers of leaves (a)4.00±0.110c3.96±0.108c7.36±0.181a5.20±0.141b節(jié)間數(shù)Numbers of internodes (a)3.00±0.100c2.96±0.108c6.36±0.181a4.20±0.141b分枝數(shù)Numbers of branches (a)——4.28±0.339a—

注：同行不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

Note: In same line, data marked with different lowercase letters indicate the significant differences (P<0.05).

2.3 生物量及其他指標(biāo)

施可得植物生長(zhǎng)液處理下苜蓿植株的地上鮮重、地上干重、根鮮重、根干重、根表面積、根直徑、葉片數(shù)和節(jié)間數(shù)顯著(P<0.05)高于自來水處理731%、655%、384%、445%、101%、27%、84%和112%；霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液處理比自來水處理顯著(P<0.05)高117%、188%、105%、117%、40%、7%、30%和40%；但蒸餾水處理與自來水處理各項(xiàng)指標(biāo)間無顯著差異(P>0.05)。同時(shí)，僅施可得植物生長(zhǎng)液處理下苜蓿植株有分枝數(shù)且平均每株分枝4.28個(gè)，霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液、自來水和蒸餾水處理的植株均無分枝。自來水和蒸餾水處理的苜蓿植株其根冠比比施可得植物生長(zhǎng)液處理顯著(P<0.05)高172%和153%，而其余處理間根冠比無明顯差異(表1)。

3 討論

健康的盆栽苜蓿植株是病原物致病性測(cè)定的基礎(chǔ)，光照不足、溫度過高、種帶病菌、土壤中的雜菌以及盆土營(yíng)養(yǎng)不足等均會(huì)導(dǎo)致其出現(xiàn)生長(zhǎng)不良的現(xiàn)象，無法滿足接種之用。研究表明，植物生長(zhǎng)的形態(tài)特征是光照、溫度等因素綜合作用的直觀反應(yīng)，苜蓿是喜光、長(zhǎng)日照植物，生長(zhǎng)適宜的溫度為15～25 ℃，40 ℃高溫下苜蓿幼苗生長(zhǎng)緩慢、枯萎甚至死亡[17]。本研究中，移栽后的前2周內(nèi)未出現(xiàn)生長(zhǎng)弱小植株，未見植株死亡，可見土壤滅菌徹底、種子上無種帶病菌或種帶病菌已消毒處理掉，故種子消毒催芽和土壤滅菌處理是獲得生長(zhǎng)健康、整齊植株的前提。然而在2周后部分處理的植株出現(xiàn)從子葉至真葉的變黃、干枯癥狀，而澆灌施可得植物生長(zhǎng)液的植株至收獲時(shí)子葉仍保持綠色，真葉未出現(xiàn)變黃、干枯的癥狀，因此本研究所使用的溫室其溫度和光照適宜。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只有澆灌施可得植物生長(zhǎng)液的植株才可旺盛生長(zhǎng)，其分枝能力強(qiáng)、生物量積累多，而不澆灌營(yíng)養(yǎng)液時(shí)，無論澆灌自來水還是蒸餾水，植株均會(huì)出現(xiàn)葉片枯黃的現(xiàn)象，說明本試驗(yàn)所使用的土壤的營(yíng)養(yǎng)成分含量不足。至于苜蓿生長(zhǎng)需要的最佳養(yǎng)分成分及其含量是多少根據(jù)本研究無法確定，因施可得植物生長(zhǎng)液為商業(yè)產(chǎn)品，其實(shí)際的配方尚不得而知?？梢钥隙ㄊ┛傻弥参锷L(zhǎng)液含有較高的氮磷肥(N為225 mg·L-1、P為49 mg·L-1)，而霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液的氮磷濃度則相對(duì)較低(N為210 mg·L-1、P為31 mg·L-1)，因此影響苜蓿生長(zhǎng)最主要的因素可能為氮磷肥，也不排除其他元素，因?yàn)楦鞣N礦質(zhì)元素執(zhí)行特定的生理功能，具有復(fù)雜的互作效應(yīng)，氮、磷互作可顯著促進(jìn)苜蓿生長(zhǎng)和提高產(chǎn)量[18]，氮和磷配施明顯增加苜蓿的生長(zhǎng)速度、生物量積累、分枝數(shù)和根系直徑等[19]。Versteeg等[20]也指出，氮、磷、鉀按比例協(xié)調(diào)施入，為作物提供均衡的營(yíng)養(yǎng)，有利于植物的生長(zhǎng)發(fā)育。在本試驗(yàn)中，澆灌霍格蘭氏營(yíng)養(yǎng)液的苜蓿植株比澆灌自來水和蒸餾水的植株推遲約一周表現(xiàn)出缺素癥狀，表明苜蓿隨著生長(zhǎng)發(fā)育的推進(jìn)，此營(yíng)養(yǎng)液所提供的養(yǎng)分不能滿足植物日漸增多的營(yíng)養(yǎng)需求，從而生長(zhǎng)不良。有研究表明[8]，霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液顯著促進(jìn)紫花苜蓿小苗地上部的生長(zhǎng)并增加根系干物質(zhì)的積累，本研究結(jié)果與此不一致，可能是由于所用試劑的有效性和配制及保存方法不同。

自來水和蒸餾水處理相比，苜蓿植株前期(移栽后13 d左右)生長(zhǎng)健康，之后子葉及基部老葉發(fā)黃，幼葉淡綠，莖干及葉柄呈紅褐色，至收獲時(shí)整株矮小，莖干細(xì)弱，子葉脫落，節(jié)間短，葉片小，但根冠比明顯高于兩種營(yíng)養(yǎng)液處理，表明自來水和蒸餾水的礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)極度缺乏，苜蓿表現(xiàn)出典型的缺素癥狀，增加根冠比以促進(jìn)根系吸收礦質(zhì)元素，但根生物量仍遠(yuǎn)低于兩種營(yíng)養(yǎng)液處理，其原因可能是土壤養(yǎng)分不足產(chǎn)生的一系列生長(zhǎng)抑制效應(yīng)所致，說明礦質(zhì)養(yǎng)分對(duì)室內(nèi)紫花苜蓿的生長(zhǎng)十分關(guān)鍵，僅憑盆土中有限的營(yíng)養(yǎng)遠(yuǎn)不能滿足苜蓿正常生長(zhǎng)的養(yǎng)分需求，因此室內(nèi)栽培紫花苜蓿應(yīng)選用土壤肥力較好的土壤或澆灌營(yíng)養(yǎng)液或施用化肥。本研究發(fā)現(xiàn)，自來水與蒸餾水處理相比，所有指標(biāo)差異均不顯著，但蒸餾水處理下苜蓿生長(zhǎng)不良的癥狀更為突出，表明苜蓿葉片對(duì)礦質(zhì)元素非常敏感，自來水中極微量的礦物元素發(fā)揮了作用，且次氯酸并未對(duì)苜蓿生長(zhǎng)造成危害。水的pH越高，次氯酸離解為氯酸根離子就越多，當(dāng)pH大于8時(shí)，次氯酸濃度極低[21]，對(duì)植物生長(zhǎng)不具危害，本研究中自來水pH 8.08對(duì)苜蓿生長(zhǎng)未造成危害結(jié)果與此一致。

4 結(jié)論

根據(jù)本試驗(yàn)可以確定本研究團(tuán)隊(duì)溫室栽培苜蓿出現(xiàn)的問題為營(yíng)養(yǎng)成分供給不足，而不是溫度、光照等其他因素。本研究發(fā)現(xiàn)，氮磷濃度較高的施可得植物生長(zhǎng)液可培養(yǎng)出生長(zhǎng)健康的苜蓿植株，而其余處理營(yíng)養(yǎng)不足，澆灌后均逐漸表現(xiàn)出不同程度的生長(zhǎng)不良癥狀，表明盆栽苜蓿的健康生長(zhǎng)需要較多的礦質(zhì)養(yǎng)分含量。此外，自來水與蒸餾水處理相比，所有指標(biāo)差異均不顯著，但蒸餾水處理下苜蓿生長(zhǎng)不良的癥狀更為突出，表明自來水中極微量的次氯酸并未對(duì)苜蓿生長(zhǎng)造成危害，同時(shí)自來水中的微量礦物元素發(fā)揮了作用，故只有土壤養(yǎng)分足夠高，在光溫適宜、種子消毒、土壤滅菌徹底的條件下澆灌自來水也可獲得健康的盆栽苜蓿植株。