呂前輝，王小華，沈愛國，胡繼明

(生物與醫(yī)學(xué)分析化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢大學(xué) 化學(xué)與分子科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430072)

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的蓬勃發(fā)展，民眾對生活質(zhì)量的要求也越來越高，在食品安全、醫(yī)藥管理、刑事偵查和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域內(nèi)，亟需快速、方便的現(xiàn)場檢測技術(shù)。拉曼光譜技術(shù)以其操作簡單、快速、無損、需樣量少、適于含水體系等優(yōu)勢在上述領(lǐng)域內(nèi)得到了迅速推廣。由于拉曼散射是基于光與物質(zhì)作用后產(chǎn)生的對稱分布在瑞利散射光兩側(cè)的非彈性光散射效應(yīng)，其散射光與入射光頻率的位移對應(yīng)于被散射分子的組成和結(jié)構(gòu)，故可對被散射分子的組成與結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效的“指紋”識(shí)別。此外，根據(jù)物質(zhì)的特征峰強(qiáng)度信息，還可實(shí)現(xiàn)定量分析[1]。

絕大多數(shù)目標(biāo)分析物的本征拉曼信號(hào)極其微弱，通常采用的策略為“目標(biāo)分析物的放大”或“檢測信號(hào)的放大”。前者通常針對的目標(biāo)分析物為DNA，通過多次復(fù)制DNA鏈來確保檢測結(jié)果的靈敏度，最具代表性的技術(shù)為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)[2]；后者則是通過物理或化學(xué)手段使原有信號(hào)顯著增強(qiáng)，最具代表性的技術(shù)為表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface enhanced Raman spectroscopy,SERS)技術(shù)。SERS信號(hào)的放大主要源于散射光與金屬基底的電磁交互作用，即通過等離子體共振的方式使得拉曼光信號(hào)增強(qiáng)[3]。SERS以其高靈敏特性進(jìn)一步拓寬了拉曼光譜技術(shù)在現(xiàn)場快檢領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。當(dāng)前已開發(fā)的SERS分析方法具有速度快、靈敏度高、成本低、儀器輕便、設(shè)備操作和前處理簡單等優(yōu)點(diǎn)，因而此技術(shù)非常適用于微痕量物質(zhì)的現(xiàn)場快速檢測。

根據(jù)檢測方式的不同進(jìn)行劃分，拉曼光譜技術(shù)既能對目標(biāo)物進(jìn)行直接檢測，又可通過衍生或傳感等方式實(shí)現(xiàn)間接檢測。本文按照上述分類方法，系統(tǒng)地綜述了拉曼光譜技術(shù)在食品安全、醫(yī)藥管理、刑事偵查和環(huán)境監(jiān)測等現(xiàn)場快檢分析領(lǐng)域中的應(yīng)用現(xiàn)狀；同時(shí)對拉曼光譜技術(shù)在現(xiàn)場快檢領(lǐng)域中的發(fā)展前景進(jìn)行了分析和展望。

1 拉曼光譜現(xiàn)場快檢技術(shù)的研究現(xiàn)狀

對于具有拉曼活性的目標(biāo)分析物，且在體系中干擾物質(zhì)較少的情況下，直接檢測是最為簡單有效的方法；若樣品的含量極少或本征拉曼信號(hào)極弱時(shí)，可通過引入合適的SERS基底，經(jīng)過較短的作用時(shí)間便可采集到高質(zhì)量的SERS光譜。但此方法用于定量分析時(shí)具有一定的局限性，易受到SERS基底制備水平與測試條件控制精度等多方面的影響，導(dǎo)致重現(xiàn)性不佳。當(dāng)目標(biāo)分析物不具有拉曼活性或體系中存在其它組分干擾的情況下，通過采取適當(dāng)?shù)姆蛛x富集方式或化學(xué)衍生手段(即間接檢測法)，最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的特異性識(shí)別則顯得尤為重要?，F(xiàn)場快檢技術(shù)要求樣品前處理方法簡單、省時(shí)，最理想的情況是無需樣品處理便可直接檢測，故對分離富集技術(shù)提出了較高的要求。另外，以偶氮化衍生法為例，通過對目標(biāo)物進(jìn)行重氮化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為SERS響應(yīng)較強(qiáng)的物質(zhì)可實(shí)現(xiàn)高靈敏檢測，此法雖拓展了拉曼光譜技術(shù)的應(yīng)用范圍，但需考慮由于殘余衍生試劑競爭吸附所帶來的定量準(zhǔn)確性下降等因素，增加了測試難度[4]。

為克服上述難題，SERS傳感技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。SERS傳感檢測所用的試劑是一種復(fù)合材料，通常由修飾了特定信標(biāo)分子的SERS增強(qiáng)基底和最外層包裹的保護(hù)層構(gòu)成。貴金屬納米粒子作為SERS增強(qiáng)基底，其使得處于“熱點(diǎn)”區(qū)域的分子信號(hào)大幅增強(qiáng)。信標(biāo)分子則用作標(biāo)記物，當(dāng)受到高強(qiáng)度激光照射時(shí)，會(huì)向空間中發(fā)射拉曼散射光，這部分光信號(hào)的光譜分布、強(qiáng)度以及產(chǎn)生的精確位置成為樣品分析時(shí)的有用信息。外層保護(hù)層則由物理化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定的材料(通常是高聚合物)制成，將其包覆在信標(biāo)分子的外層，以確保SERS傳感器的穩(wěn)定性、兼容性與可控性等，從而為開發(fā)相應(yīng)的分析方法或檢測裝置奠定了基礎(chǔ)[5]。

目前，這種依靠信標(biāo)分子的特征譜帶進(jìn)行精確分析的檢測模式，正越來越多地被應(yīng)用于快檢分析領(lǐng)域的各類檢測對象，包括重金屬離子、有機(jī)小分子、無機(jī)陰離子和生物大分子等。該模式靈活多變，大致可分為3類。第一類，分析物引起拉曼信標(biāo)分子修飾的貴金屬納米粒子在溶液中發(fā)生聚集/分散，由于粒子間的等離激元耦合帶來的熱點(diǎn)效應(yīng)發(fā)生相應(yīng)改變，信標(biāo)分子的拉曼信號(hào)亦會(huì)呈現(xiàn)“turn on”或“turn off”模式的改變，以此建立分析物濃度與信標(biāo)分子特征峰強(qiáng)度的數(shù)量關(guān)系，實(shí)現(xiàn)定量檢測(見圖1A)。這種檢測模式脫胎于“貴金屬納米粒子分散狀態(tài)改變引起溶膠體系的等離激元共振吸收改變”而建立的可視化檢測方法，不同之處在于SERS的靈敏度更高，定量結(jié)果更準(zhǔn)確。第二類則以納米基底表面信標(biāo)分子與目標(biāo)物的化學(xué)/物理作用為前提，當(dāng)信標(biāo)分子的某個(gè)拉曼特征峰強(qiáng)度或位移發(fā)生改變時(shí)，其變量與目標(biāo)物濃度可建立定量關(guān)系從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的定量檢測(見圖1B)。與第一類檢測模式相比，第二類模式是從特征峰的強(qiáng)度比值或位移來尋求目標(biāo)物的定量依據(jù)；而第一類模式則根據(jù)特征峰的強(qiáng)度來建立定量關(guān)系。第三類，與傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記相似，借助SERS納米探針標(biāo)記，依托拉曼信標(biāo)分子的高分辨特性實(shí)現(xiàn)多個(gè)目標(biāo)物的同時(shí)檢測。這種檢測模式與第二類模式的適用體系十分相似，常見于固相基底表/界面的標(biāo)記檢測，或細(xì)胞、生物組織等的標(biāo)記成像研究(見圖1C)[6-7]。

圖1 基于SERS的3類主要檢測策略Fig.1 Three main strategies based on SERS detection

2 拉曼光譜技術(shù)在現(xiàn)場快檢領(lǐng)域中的應(yīng)用

拉曼光譜可提供待測物質(zhì)的“指紋”圖譜信息，通過對目標(biāo)物與標(biāo)準(zhǔn)品的譜圖進(jìn)行比對，即可準(zhǔn)確識(shí)別出對應(yīng)物質(zhì)是否存在。目前，諸多儀器公司均可提供相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的自動(dòng)分析與判定，且能在較短時(shí)間內(nèi)給出測試結(jié)果。同時(shí)，拉曼光譜特征峰的強(qiáng)度大小則包含了目標(biāo)物的濃度信息，可通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線、采用外標(biāo)或內(nèi)標(biāo)等方法對目標(biāo)物進(jìn)行定量分析。

2.1 食品安全

目前，我國的食品安全事件主要包括違禁添加劑的使用或限用添加劑的濫用，農(nóng)獸藥殘留以及微生物的污染等。以檢測食品中的違禁添加劑蘇丹染料為例，不法商家為增強(qiáng)產(chǎn)品的色澤，可能在各類食品和藥品中違法添加蘇丹染料。然而，蘇丹染料作為一種脂溶性化合物，分子中含有偶氮苯結(jié)構(gòu)，其重氮鍵可分解為芳香胺，會(huì)增加人類患癌的風(fēng)險(xiǎn)。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(International agency for research on cancer,IARC)將蘇丹染料列為第三類致癌物質(zhì)，并禁止使用蘇丹染料作為食用色素，因此準(zhǔn)確檢測食品中的蘇丹染料顯得尤為重要。Lu等[8]利用環(huán)糊精的主客體效應(yīng)“捕獲”蘇丹染料分子，并借助紙基底上負(fù)載的貴金屬納米粒子提供“熱點(diǎn)”，從而實(shí)現(xiàn)草藥中蘇丹染料的高效定性、定量分析，檢出限可達(dá)10-7mol/L。值得一提的是，以蘇丹染料為代表的大多數(shù)食品著色劑的SERS響應(yīng)較強(qiáng)，均可進(jìn)行類似的直接檢測。此外，拉曼光譜技術(shù)也廣泛應(yīng)用于水稻中敵瘟磷[9]、果蔬皮中倍硫磷[10]、原料奶中噬菌體和抗生素污染物[11]等食品安全現(xiàn)場快檢領(lǐng)域。但上述直接檢測法的定量結(jié)果因易受SERS基底與測試條件的影響，其可靠性欠佳。因此，許多研究者致力于高性能SERS基底的制備與新型測試方法的開發(fā)等工作[12-19]。Fang等[20]首次設(shè)計(jì)出便攜式SERS微滴管，采用內(nèi)標(biāo)法實(shí)現(xiàn)了果蔬表面有機(jī)殘留物的微區(qū)采樣與多組分的精確定量檢測，可檢測到辣椒和黃瓜皮中的8 nmol/L福美雙、8 nmol/L孔雀石綠和1.5 μmol/L(400 ppb)甲基對硫磷。表1列出了目前在食品安全領(lǐng)域中應(yīng)用拉曼光譜技術(shù)實(shí)現(xiàn)檢測的近百種分析物。

表1 拉曼光譜技術(shù)在食品安全領(lǐng)域中的應(yīng)用Table 1 The application of Raman spectroscopy technology in food safety field

圖2 一種對痕量危險(xiǎn)品進(jìn)行快速定性定量分析的專用化SERS基底[66]Fig.2 A miniaturized SERS substrate for qualitative and quantitative detection of trace trinitrotoluene explosive[66]

2.2 刑事偵查

刑偵領(lǐng)域內(nèi)常規(guī)的分析物為顏料、生物殘留、爆炸物、藥物毒品等，其最受關(guān)注的問題往往是以上目標(biāo)物的定性分析，且要求測試方法無損、快速、靈敏。拉曼光譜技術(shù)以其獨(dú)特的優(yōu)勢與上述要求完美契合?；诖?，Dmitry等[61]利用SERS快速、非損傷、熒光干擾小等特點(diǎn)，可識(shí)別出頭發(fā)是否被人工染色，并能確定頭發(fā)是否使用了永久性或半永久性著色劑，以及給出相應(yīng)染發(fā)劑的商業(yè)信息，從而提供了頭發(fā)證據(jù)的法醫(yī)調(diào)查新視角。Kyle等[62]將拉曼光譜與化學(xué)計(jì)量學(xué)相結(jié)合，可通過分析血液樣品來區(qū)分供血者的年齡。Aron等[63]以SERS直接檢測法，使用手持式拉曼光譜儀實(shí)現(xiàn)了環(huán)孢素、環(huán)三亞甲基三硝胺(RDX)、安非他明和苦味酸的超痕量檢測(可低至fg)。Xu等[64]通過改善SERS基底(Ag納米顆粒)的制備方法，成功檢測了痕量的二硝基茴香醚(DNAN)爆炸物。Roberto等[65]則從專用化儀器開發(fā)角度著手，成功研制了一款新型的拉曼光譜裝置，用于檢測人體隨身攜帶的爆炸物，可應(yīng)用于目標(biāo)物表面硝酸銨(AN)、2-甲基-1,3,5-三硝基苯(TNT)、季戊四醇四硝酸酯(PETN)和硝酸脲(UN)的精確分析，檢出限可達(dá)289 μg/cm2。但對于痕量爆炸物的檢測等特殊情況，僅靠上述示例中簡單的“混合式”SERS直接檢測法很難獲得準(zhǔn)確的分析結(jié)果，這主要是由于其濃度低、干擾嚴(yán)重。此前，He等[66]利用對氨基苯硫醇(PABT)與TNT的復(fù)合物具有電子共振活性這一特點(diǎn)，通過在硅片上設(shè)計(jì)一種專用化的SERS基底(如圖2)，實(shí)現(xiàn)了TNT的超高靈敏度檢測，檢出限低至～1 pmol/L(～45.4 fg/cm2)。Wang等[67]則結(jié)合高效的預(yù)處理步驟，在便攜式拉曼光譜儀上實(shí)現(xiàn)了血漿或尿液中微量去極化神經(jīng)肌肉阻滯劑琥珀膽堿的檢測，在血漿中檢出限達(dá)到1 μg/L，在尿液中達(dá)到10 μg/L。然而，目前拉曼光譜技術(shù)在刑偵快檢領(lǐng)域內(nèi)仍有很大的應(yīng)用空間。如文印筆跡等證物的分析往往需要較高的空間分辨率，現(xiàn)階段只有顯微共聚焦拉曼光譜儀才能勝任。諸如此類應(yīng)用領(lǐng)域，亟需開發(fā)相應(yīng)的小型分析裝置和高效分析方法來實(shí)現(xiàn)特殊樣品的快速分析。

2.3 醫(yī)藥管理

在藥品中，大多數(shù)藥物活性成分(APIs)以固體顆粒形式存在。APIs的含量、分布以及構(gòu)象的差異將導(dǎo)致藥物具有不同的理化性質(zhì)，這給制藥行業(yè)原材料表征、配方、工序和終端產(chǎn)品質(zhì)量控制等方面帶來了巨大挑戰(zhàn)。故而在研發(fā)、生產(chǎn)和儲(chǔ)運(yùn)過程中，提供一種用于APIs和輔料的定量分析和固體藥物構(gòu)象的高效評(píng)估方法至關(guān)重要。拉曼光譜技術(shù)無需制樣，可實(shí)現(xiàn)快速、非侵入式檢測，能夠透過塑料包裝、容器壁等透明介質(zhì)靈活測定樣品。上述特點(diǎn)使得拉曼光譜技術(shù)非常適合于各種藥物的實(shí)時(shí)過程監(jiān)控，拉曼光譜法現(xiàn)已被中國藥典、美國藥典和歐洲藥典列為法定的藥物分析方法，適用于制藥行業(yè)藥物原輔料、中間體、包裝材料入廠進(jìn)行100%鑒別確認(rèn)、生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的質(zhì)量控制，以及藥品防偽檢測等場合。Kathryn等[68]引入主成分分析法(PCA)，使用手持式拉曼光譜儀在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)了混合藥物中苯佐卡因、利多卡因、異丙腎上腺素和去甲麻黃堿4種APIs的準(zhǔn)確識(shí)別。此外，Syed等[69]采用SERS技術(shù)檢測了合成藥物中痕量大麻素和α-吡咯烷基戊酰苯，檢出限分別達(dá)1 pmol/L與10 nmol/L。Lu等[70]結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法，開發(fā)了一種用于鑒定藥物真?zhèn)蔚男滦妥R(shí)別系統(tǒng)，已通過7種(40批次)降血糖藥片和12種常規(guī)藥物輔料進(jìn)行了基準(zhǔn)測試，靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性指標(biāo)分別為96.77%、97.48%、96.35%。結(jié)果表明，該鑒定系統(tǒng)適用于可疑假藥的現(xiàn)場初步篩查。

2.4 環(huán)境監(jiān)測

環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域中的快檢分析對象主要為無機(jī)陰離子、有機(jī)小分子、重金屬離子和微生物等。由于實(shí)際環(huán)境的特殊性與復(fù)雜性，對測試方法的選擇性要求較高，因此極大地限制了直接檢測法的應(yīng)用范圍，其通常需要借助繁瑣的分離富集技術(shù)來純化目標(biāo)物。以水體中常見污染物As(Ⅲ)的SERS檢測為例，不同形貌的SERS基底以及其表面不同的化學(xué)環(huán)境、Au/Ag納米顆粒的聚集程度、干擾物質(zhì)的去除效果等均會(huì)對定量分析結(jié)果的準(zhǔn)確性造成影響。為解決這些難題，Qi等[71]借助微流控芯片技術(shù)，通過在流體通道內(nèi)修飾經(jīng)谷胱甘肽/4-巰基吡啶改性的Ag納米顆粒，成功實(shí)現(xiàn)As(Ⅲ)的精確定量分析，方法具有較高的重現(xiàn)性與選擇性。Liu等[72]利用SERS與固相微萃取聯(lián)用技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了紡織品中三甲基氯化錫、三丁基氯化錫和三苯基錫的現(xiàn)場快速篩查，檢出限分別可達(dá)6.9 ppb、1.1 ppb和0.2 ppb。Rafael等[73]將SERS與Sammon's mapping(一種信息可視化技術(shù))結(jié)合，可從具有較高背景干擾的水樣中提取出高毒性除草劑阿特拉津的光譜信號(hào)，其檢出限約為5×10-12mol/L。

此外，還可通過優(yōu)化SERS探針的特異性來提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。常見的物質(zhì)在1 800～2 800 cm-1的拉曼光譜區(qū)域(“靜默區(qū)”)內(nèi)一般不會(huì)出現(xiàn)特征譜帶，特別是對于生物體系，更是鮮有發(fā)生。因此，含—C≡C或—C≡N三鍵的一類信標(biāo)分子以其特征拉曼譜帶位于光譜“靜默區(qū)”而具有無背景干擾、特異性較高的特點(diǎn)，非常適用于復(fù)雜體系的分析?；诖?，文獻(xiàn)[74]制備了一種新型的三鍵分子編碼的SERS傳感器，并成功用于富含有機(jī)污染物的污水中重金屬離子含量的快速檢測，檢出限低至0.77 nmol/L(Hg2+)和0.86 nmol/L(Ag+)。

3 展 望

隨著近年來各行業(yè)檢測需求的大幅增長，“快檢”、“快篩”和“實(shí)驗(yàn)室前置”的概念已深入到很多行業(yè)，制藥行業(yè)已有普及拉曼光譜之勢，食品安全、公共安全、材料檢測領(lǐng)域的拉曼光譜應(yīng)用也在急速增長。與此同時(shí)，政府部門對與環(huán)境相關(guān)的法律條文做出了修訂，新增近百項(xiàng)污染物的測試項(xiàng)目。這表明市場內(nèi)仍亟需提供大量高效的快檢技術(shù)，故而拉曼光譜技術(shù)在這一熱潮中大有可為。此外，目前商品化的便攜式或手持式拉曼光譜儀高度集成化，相比現(xiàn)有的快速檢測設(shè)備價(jià)格偏高，且應(yīng)用范圍有限。如：在文物鑒別與保護(hù)等特殊的現(xiàn)場快檢領(lǐng)域內(nèi)，為保護(hù)珍貴樣品的原貌，測試過程中所允許使用的激光功率往往比較小，導(dǎo)致當(dāng)前的小型拉曼光譜儀的靈敏度不能滿足要求?？梢灶A(yù)見，隨著新型測試方法的開發(fā)與儀器性能的完善，拉曼光譜技術(shù)將在現(xiàn)場快檢領(lǐng)域內(nèi)發(fā)揮日益重要的作用。