馮煥然，賴家平*，孫 慧，吳偉珍，黃夢(mèng)霞

(1.華南師范大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣州大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006)

鐵不僅在工業(yè)上具有重要用途，還是人體內(nèi)豐度最高的微量元素，在許多生理過程中起著重要作用。鐵是血紅蛋白的重要組成部分，還可幫助細(xì)胞色素進(jìn)行氧化還原轉(zhuǎn)移電子。此外，鐵也是固氮酶的重要組成部分。但體內(nèi)鐵的含量過高將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題，如引發(fā)癌癥和某些器官如心臟、胰腺和肝臟的老化、神經(jīng)性疾病如帕金森綜合癥和老年癡呆癥[1]。生物體內(nèi)的鐵主要是二價(jià)的，極少量為三價(jià)，大量的三價(jià)鐵通常對(duì)生物體有害，而自然水體中的鐵基本為三價(jià)鐵。因此，尋求一種能對(duì)鐵進(jìn)行快速檢測(cè)并作出價(jià)態(tài)分析的方法仍然值得重視。

目前檢測(cè)鐵(或亞鐵)離子的方法包括火焰原子吸收法(FAAS)[2]、石墨爐火焰原子吸收法(GFAAS)[3]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-AES)[4]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[5]、電化學(xué)方法、比色法等[6]。這些檢測(cè)方法雖然靈敏度高、檢出限低、線性范圍寬，但FAAS、GFAAS、ICP-AES只能測(cè)總鐵含量，不能進(jìn)行價(jià)態(tài)分析；ICP-MS可進(jìn)行價(jià)態(tài)分析，但儀器昂貴；而電化學(xué)和比色方法只能對(duì)鐵離子的其中一種價(jià)態(tài)進(jìn)行分析。

目前已有大量文獻(xiàn)采用熒光探針進(jìn)行Fe3+檢測(cè)，包括基于羅丹明B系列的熒光探針[7-11]、其他一些含氧氮的雜環(huán)化合物[12-17]以及量子點(diǎn)和比率熒光等分析方法[18-25]等。但由于熒光探針合成過程復(fù)雜[7-17]，且多數(shù)探針僅可測(cè)定三價(jià)鐵離子，無法實(shí)現(xiàn)價(jià)態(tài)分析，一探兩測(cè)的探針少見報(bào)道[26]，導(dǎo)致鐵或亞鐵離子熒光探針較難用于實(shí)際檢測(cè)。本研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸(EA)可在甲醇-水體系中準(zhǔn)確地對(duì)Fe2+和Fe3+進(jìn)行檢測(cè)，據(jù)此構(gòu)建了測(cè)定Fe2+和Fe3+的熒光探針，并用于自來水與珠江水中Fe2+和Fe3+的檢測(cè)，取得了滿意的回收率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

分析天平(FA2004B，上海天美天平儀器有限公司)，熒光分光光度計(jì)(FL-2700，日本Hitachi公司)，pH計(jì)(PHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司雷磁儀器廠)，漩渦混合器(XW-80A，上海精科實(shí)業(yè)有限公司)，50 μL、100 μL、1 mL、5 mL 移液槍(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)，津騰微孔濾膜(水系，直徑50 mm，孔徑0.2 μm)。

鞣花酸(上海麥克林試劑有限公司)，氨基叔丁三醇(99.9%，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，甲醇(成都市科龍化工試劑廠)，酒石酸二銨(廣州化學(xué)試劑有限公司)，鹽酸(成都市科龍化工試劑廠)；各種金屬離子水溶液(包括Al3+、Be2+、Ba2+、Li+、Mg2+、Cu2+、Cd2+、Co2+、Pb2+、Ag+、Cr3+、Ni2+、Zn2+、Mn2+、Hg2+、Fe2+、Fe3+)均由其相應(yīng)的硝酸鹽或鹽酸鹽制得(上海阿拉丁試劑)。各pH值的Tris-HCl緩沖溶液均由氨基叔丁三醇與鹽酸制得，濃度為0.01 mol/L。除特殊說明外，所用試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 熒光光譜的測(cè)定

將0.024 2 g(0.08 mmol)EA溶解在100 mL去離子水中作為儲(chǔ)備溶液(適當(dāng)加入NaOH至其完全溶解)，金屬離子鹽溶解于去離子水中配制成0.8 mmol/L的儲(chǔ)備溶液。EA溶液中加入金屬離子后充分振蕩混勻，置于1 cm石英比色皿中，以357 nm為激發(fā)波長，記錄377～650 nm波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射強(qiáng)度變化(激發(fā)狹縫為10 nm，發(fā)射狹縫為5 nm，電壓為700 V)。

在甲醇-水溶液體系的條件探索中，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm，由于使用700 V電壓時(shí)，信號(hào)有沖頂現(xiàn)象，故電壓設(shè)為400 V；而在定量檢測(cè)時(shí)，為了測(cè)定低濃度的樣品，電壓仍采用700 V，同時(shí)為防止高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液有信號(hào)沖頂現(xiàn)象，將激發(fā)和發(fā)射狹縫均設(shè)為5 nm，并于pH 7.0條件下進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 自來水和珠江水中Fe2+及Fe3+回收率的測(cè)定

自來水用微孔濾膜過濾；珠江水先用濾紙過濾，再用微孔濾膜過濾，配成pH 6.5的Tris-HCl緩沖溶液。

在一系列10 mL離心管中分別添加9.85 mL該自來水/珠江水緩沖液，0.1 mL 0.8 mmol/L的EA和0、20、50、100 μL的0.1 mmol/L Fe2+/ Fe3+標(biāo)準(zhǔn)液，使水樣中的Fe2+/Fe3+濃度分別為0、0.2、0.5、1.0 μmol/L，EA濃度為8 μmol/L。以357 nm為激發(fā)波長，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫設(shè)為5 nm，于700 V光電倍增管電壓下檢測(cè)熒光發(fā)射強(qiáng)度，平行測(cè)定3次。Fe2+和Fe3+共存條件下定量測(cè)定Fe2+時(shí)，在上述溶液的基礎(chǔ)上再加入10 mmol/L 酒石酸二銨和1.1 μmol/L Fe3+，其他條件不變。

2 結(jié)果與討論

2.1 EA對(duì)金屬離子的選擇性研究

圖1 EA對(duì)Fe2+、Fe3+的選擇性研究Fig.1 Investigation of the selectivity of EA towards Fe2+and Fe3+ A.fluorescence response of EA(8 μmol/L) to different metal ions(8 μmol/L) in pH 7.0 aqueous solution；B.elimination of the interference from Cr3+；C.effects of methanol volume fraction on fluorescence intensity

在pH 7.0，0.01 mol/L 的Tris-HCl緩沖溶液中，加入探針EA和常見的金屬離子(Al3+、Be2+、Ba2+、Li+、Mg2+、Cu2+、Cd2+、Co2+、Pb2+、Ag+、Ni2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、Mn2+、Cr3+、Hg2+)，使其最終濃度均為8 μmol/L，并以未添加金屬離子的相同濃度的EA為空白待測(cè)溶液，測(cè)定熒光發(fā)射強(qiáng)度的變化，結(jié)果如圖1A所示。Fe2+與Fe3+對(duì)EA溶液均有明顯的熒光猝滅作用， 說明EA溶液對(duì)Fe2+及Fe3+均有良好的選擇性。推測(cè)是由于EA上的羰基氧和酚羥基與Fe2+和Fe3+發(fā)生了絡(luò)合效應(yīng)，導(dǎo)致其熒光猝滅。與此同時(shí)，Cr3+對(duì)EA也有一定的猝滅作用，這是因?yàn)镃r3+的結(jié)構(gòu)及化學(xué)性質(zhì)與Fe3+相似，故可在一定程度上猝滅EA的熒光。

熒光探針與金屬離子間的相互作用受溶劑極性的影響很大[27]，初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)在水溶液中加入一定的甲醇時(shí)，基本可消除Cr3+的干擾(圖1B)。這是因?yàn)榧状嫉臉O性比水小，適量的甲醇可以降低溶劑的極性進(jìn)而消除Cr3+的干擾。由圖1A中的熒光猝滅程度可以看出，金屬離子與鞣花酸形成配合物的穩(wěn)定性為Fe2+≈Fe3+?Cr3+，而甲醇的加入改變了溶劑的極性，可在一定程度上削弱鞣花酸與金屬離子之間的相互作用，從而消除Cr3+的干擾。

配制了只含EA、含有EA和Fe2+、含有EA和Fe3+的各溶質(zhì)濃度均為8 μmol/L的甲醇-水溶液，考察了不同的甲醇體積分?jǐn)?shù)(甲醇分別占溶劑總體積的50%、60%、70%、80%、90%、95%)下各體系的熒光強(qiáng)度(圖1C)。由圖1C可以看出，甲醇的體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，只含有EA的溶液與同時(shí)含有Fe2+、Fe3+的溶液的熒光強(qiáng)度的差值達(dá)到最大，因此，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過程中，以80%甲醇-水溶液作為最佳測(cè)定條件。

2.2 其他金屬離子抗干擾性探究

在pH 7.0，0.01 mol/L Tris-HCl緩沖溶液中，甲醇體積分?jǐn)?shù)為80%的最佳條件下，考察了其他金屬離子對(duì)Fe2+與Fe3+測(cè)定的干擾情況。當(dāng)Fe2+與Fe3+為8 μmol/L時(shí)，1.5倍的Al3+、Be2+、Ba2+、Li+、Mg2+、Cu2+、Cd2+、Co2+、Pb2+、Ag+、Cr3+、 Ni2+、Zn2+、Mn2+、Hg2+均不干擾測(cè)定；而且上述離子共存于同一溶液時(shí)也對(duì)測(cè)定無干擾。

圖2 不同pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of pH value on the fluorescence intensity

2.3 pH值對(duì)EA檢測(cè)Fe2+及Fe3+的影響

由于pH值對(duì)Fe2+和Fe3+及EA的存在形式有明顯影響，進(jìn)而影響EA的熒光發(fā)射強(qiáng)度以及EA與Fe2+、Fe3+之間的絡(luò)合作用，故就pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響做了進(jìn)一步的考察。在0.01 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液中，當(dāng)EA和Fe2+、Fe3+的濃度均為8 μmol/L時(shí)，測(cè)定了不同pH值(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)下溶液的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明，pH 2.5～5.0時(shí)，體系熒光隨pH值的增加開始猝滅；當(dāng)pH 5.0～7.0時(shí)，熒光明顯猝滅且穩(wěn)定(圖2)。結(jié)合相應(yīng)pH值下空白溶液的熒光強(qiáng)度綜合分析，選擇pH 6.5作為后續(xù)檢測(cè)體系的pH值。

2.4 Fe2+及Fe3+的定量檢測(cè)

2.4.1 Fe2+及Fe3+的單獨(dú)定量檢測(cè)考察了向8 μmol/L EA溶液中加入不同濃度(0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 μmol/L)Fe2+、Fe3+時(shí)熒光強(qiáng)度的變化。結(jié)果表明，探針EA的熒光隨著Fe2+與Fe3+濃度的升高而猝滅，且在Fe2+與Fe3+濃度為0.08～1.1 μmol/L時(shí)，其熒光發(fā)射強(qiáng)度(IF)與Fe2+與Fe3+濃度(c，μmol/L)呈線性關(guān)系，其線性回歸方程分別為IFFe2+=-1 099.47c+4 241.78(r2=0.998 5)和IFFe3+=-1 080c+4 108.52(r2=0.998 7)。根據(jù)公式3σ/k得Fe2+、Fe3+的檢出限分別為72 nmol/L和63 nmol/L。

2.4.2 掩蔽Fe3+時(shí)對(duì)Fe2+的定量檢測(cè)考察了 8 μmol/L EA、10 mmol/L 酒石酸二銨、1.1 μmol/L Fe3+共存時(shí)，對(duì)不同濃度Fe2+(0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 μmol/L)的測(cè)定情況。結(jié)果表明，探針EA的熒光隨著Fe2+濃度的增加而發(fā)生猝滅，且其熒光強(qiáng)度(IF)與Fe2+濃度(c，μmol/L)在0.08～1.1 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其線性方程為IFFe2+=-1 078.43c+4 297.06(r2=0.996 2)。根據(jù)公式3σ/k得Fe2+的檢出限為76 nmol/L。同時(shí)也證明了酒石酸二銨對(duì)Fe3+的掩蔽效果良好。

2.5 EA與Fe2+及Fe3+的配比研究

采用Job's plot方法考察了EA與 Fe2+和Fe3+的配比。在EA與Fe2+、EA與Fe3+的總濃度為10 μmol/L的條件下，配制EA與Fe2+、EA與Fe3+的濃度比分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的溶液。以熒光增強(qiáng)值(IF-IF0)為縱坐標(biāo)，F(xiàn)e2+、Fe3+占總濃度的比重為橫坐標(biāo)作圖，結(jié)果如圖3A(Fe2+)、3B(Fe3+)所示。由圖可知,Fe2+、Fe3+的IF-IF0分別在比值0.75和0.66左右時(shí)達(dá)到最大值，而當(dāng)IF-IF0達(dá)最大值時(shí)，配位最大，根據(jù)Job's plot方法的結(jié)果可知，EA與Fe2+的配位比為1∶3，與Fe3+的配位比為1∶2。

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本文所建立的方法對(duì)自來水和珠江水進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出Fe2+和Fe3+。對(duì)Fe2+、Fe3+進(jìn)行濃度分別為0.2、0.5、1.0 μmol/L的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，其回收率為81.0%～116%;掩蔽Fe3+測(cè)Fe2+時(shí)，回收率為87.0%～116%。說明熒光探針鞣花酸可用于自來水和珠江水中一定濃度范圍的Fe2+、Fe3+的測(cè)定。

3 結(jié) 論

構(gòu)建了一種廉價(jià)易得、高選擇性的鞣花酸(EA)熒光探針用于Fe2+、Fe3+的測(cè)定，研究發(fā)現(xiàn)EA可與兩者形成配合物，其配位比分別為1∶3、1∶2。EA對(duì)Fe2+、Fe3+檢測(cè)的線性范圍均為0.08～1.1 μmol/L，檢出限分別為72、63 nmol/L。將該方法用于自來水和珠江水中Fe2+、Fe3+的檢測(cè)，回收率為81.0%～116%，結(jié)果滿意。

表1 自來水和珠江水中Fe2+和Fe3+的加標(biāo)回收率Table 1 Spiked recovery of Fe2+ and Fe3+ in tap water and Zhujiang River water