毛一博，陳天睿，裴 璐，李浩正

(蘭州市第五十八中學(xué)，甘肅 蘭州 730060)

1 引言

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展依靠大量化肥與農(nóng)藥的施用，然而近年來農(nóng)藥的施用量有增無減，實(shí)際利用率卻十分低下，且許多農(nóng)藥結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難以降解，這對(duì)湖泊、河流以及地下水等水體都造成了污染。農(nóng)藥進(jìn)入生態(tài)環(huán)境造成水污染大體上可通過以下3種方式：一是未被利用的農(nóng)藥隨雨水進(jìn)入水體；二是降水、灌溉等造成的水土流失使部分尚未被利用的農(nóng)藥流入河流；三是農(nóng)藥廠或?qū)嶒?yàn)室將未經(jīng)處理的農(nóng)藥直接排入河流[1,2]。

藻類具有個(gè)體小、易獲得、繁殖快、對(duì)水體中的有毒物質(zhì)十分敏感的特點(diǎn)，是農(nóng)藥污染的理想指示物種。藻類可用于反映水體的污染狀況，一些抗逆性較好的藻類還可用于凈化水體，結(jié)果更具有現(xiàn)實(shí)意義。在此背景下，本實(shí)驗(yàn)試圖通過比較黑藻和金魚藻對(duì)農(nóng)藥多菌靈的抗逆性以及其對(duì)于多菌靈污染水體的凈化作用，初步探尋適宜大量種植的水體凈化藻類，提高“保護(hù)生態(tài)資源就是造福人類”的環(huán)保意識(shí)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 葉綠素的測(cè)定

2.1.1 儀器與試劑

所用儀器為UV-3200型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)責(zé)任有限公司)、研缽、比色皿(2 mL)、比色管(25 mL)、水浴鍋、燒杯(250 mL)、膠頭滴管、分析天平；所用試劑為90%乙醇、1 mol/L HCl。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法

使用乙醇提取葉綠素，在紫外分光光度計(jì)下分別測(cè)定未加鹽酸和加鹽酸的吸光度，依據(jù)公式得到含量。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

用分析天平準(zhǔn)確稱量0.500 g藻類樣品，放入研缽加5 mL 90%乙醇研成勻漿，全部移入25 mL比色管，用90% 乙醇定容至刻度線。置于75 ℃水浴鍋中提取5 min。提取樣液進(jìn)行測(cè)定。采取紫外分光光度計(jì)讀取其665 nm和750 nm處的吸光度數(shù)值，90%乙醇溶液為參比。之后再加入2滴1 mol/L HCl，重新測(cè)量一次。依據(jù)公式計(jì)算得到葉綠素含量[3]。

葉綠素含量=27.3(EA-Eb)

(1)

Ea為提取液酸化前波長(zhǎng)665 nm和750 nm處吸光度之差；

Eb為提取液酸化后波長(zhǎng)665 nm和750 nm處吸光度之差；

2.2 蛋白質(zhì)的測(cè)定

2.2.1 儀器與試劑

所用儀器為UV-3200型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)責(zé)任有限公司)、研缽、比色皿(2 mL)、試管、水浴鍋、燒杯(250 mL)、膠頭滴管、分析天平、離心機(jī)、離心管、移液管；所用試劑為pH值=7.0的磷酸緩沖溶液。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

提取蛋白質(zhì)溶液，在紫外分光光度計(jì)中在260 nm、280 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)量吸光度，依據(jù)公式得到含量。蛋白質(zhì)分子中色氨酸、賴氨酸的殘基在280 nm下有最大吸收。核酸在260 nm處也有吸收，可以通過校正加以消除[4]。

2.2.3 實(shí)驗(yàn)步驟

使用分析天平精確稱量0.500 g藻類樣品，放入研缽中，加入pH值=7.0的磷酸緩沖溶液，研成勻漿，移入離心管2000 r/min離心10 min。用移液管取1.00 mL樣液至試管當(dāng)中，加入5 mL pH值=7.0的磷酸緩沖溶液，在紫外分光光度計(jì)中分別在280 nm和260 nm波長(zhǎng)下讀取吸光度，以pH值=7.0的磷酸緩沖溶液作參比[5]。依據(jù)公式計(jì)算得到蛋白質(zhì)含量。

(2)

式(2)中，n為稀釋倍數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中n=6。

2.3 還原糖的測(cè)定

2.3.1 儀器與試劑

所用儀器為UV-3200型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)責(zé)任有限公司)、研缽、比色皿(2 mL)、試管、水浴鍋、燒杯(250 mL)、膠頭滴管、分析天平、移液管、離心機(jī)、離心管；所用試劑為斐林試劑、蒸餾水。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

植物組織中的還原糖含有醛基或羰基，可以還原斐林試劑使其脫色，脫色程度與含糖量成正比，在紫外分光光度計(jì)中590nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線得到含糖量[6]。

2.3.3 實(shí)驗(yàn)步驟

用分析天平精確稱量1.000 g藻類樣品，在研缽中加蒸餾水研成勻漿，移入試管中。將試管置于80 ℃的恒溫水浴中保溫30 min，期間每5 min搖動(dòng)一次，使還原糖充分提取出來[7]。用移液管量取6.00 mL待測(cè)液至試管中，加入4 mL斐林試劑，封口后于沸水浴中加熱15 min，取出后用自來水冷卻，移入離心管，1500 r/min離心15 min。取上清液，用分光光度計(jì)在590 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，以蒸餾水作參比。與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)照得出還原糖含量[8]。

還原糖含量=

(3)

2.4 COD(化學(xué)需氧量)的測(cè)定

2.4.1 儀器與試劑

所用儀器為COD快速測(cè)定儀(北京連華永興科技發(fā)展有限公司)、比色皿、消解管、移液管、玻璃棒、冷卻槽；所用試劑為D液(重鉻酸鉀溶液)、E液。

2.4.2 實(shí)驗(yàn)方法

在強(qiáng)酸性條件下通過重鉻酸鉀的氧化性氧化水中的諸多有機(jī)物，由機(jī)器前后比對(duì)得到COD數(shù)值，代表了水受有機(jī)物污染的程度。

2.4.3 實(shí)驗(yàn)步驟

使用玻璃棒攪動(dòng)水體，然后立即用移液管量取水樣2.5 mL在消解管中，用移液管加入D液0.7 mL，E液4.5 mL。充分振蕩后，放入測(cè)量?jī)x中充分解離，拿出后用自來水冷卻，轉(zhuǎn)移到比色皿中進(jìn)行測(cè)量，記錄數(shù)據(jù)。

2.5 色度、濁度的測(cè)定

2.5.1 儀器與試劑

所用儀器為UV-3200型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)責(zé)任有限公司)、比色皿(2 mL)、膠頭滴管、燒杯、玻璃棒。

2.5.2 實(shí)驗(yàn)方法

色度和濁度直觀反映了水體清澈程度，度數(shù)越高，水體質(zhì)量越差。直接量取培養(yǎng)藻類的水，在紫外分光光度計(jì)中320 nm波長(zhǎng)下測(cè)得色度，580 nm波長(zhǎng)下測(cè)得濁度。對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線得到度數(shù)。

2.5.3 實(shí)驗(yàn)步驟

使用玻璃棒攪動(dòng)水體，以保證色度、濁度測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確，然后立即用膠頭滴管量取水樣在比色皿中，放入紫外分光光度計(jì)中測(cè)量吸光度。對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)曲線得出度數(shù)。

圖1是濁度標(biāo)準(zhǔn)曲線，將實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的吸光度帶入濁度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濁度，單位為度。

圖1 濁度標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2是色度標(biāo)準(zhǔn)曲線，將實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的吸光度帶入色度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出色度，單位為度。

圖2 色度標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)果與討論

圖3、表1為兩種藻類的還原糖含量對(duì)比，黑藻與金魚藻在總趨勢(shì)上都是下降的，但是在一開始，黑藻卻呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，并在第二個(gè)周期后達(dá)到最高點(diǎn)，之后呈波浪式下降，且有趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。金魚藻在一開始就有下降，能夠?qū)τ诙嗑`做出快速反應(yīng)，之后也是呈波浪式下降，但變化幅度較大，不穩(wěn)定。

因?yàn)橹参镏械倪€原糖含量與植物的新陳代謝密切相關(guān)，對(duì)此推測(cè)多菌靈會(huì)導(dǎo)致金魚藻的代謝異常，從而影響其正常生長(zhǎng)，而我們觀察到金魚藻的生長(zhǎng)狀況較黑藻明顯不佳也與此推測(cè)吻合，同時(shí)兩種藻類在后期都出現(xiàn)穩(wěn)定趨勢(shì)，我們推測(cè)這與植物自身的反饋調(diào)節(jié)有關(guān)。

表1 兩種藻類還原糖含量變化

圖4、表2為兩種藻類的葉綠素含量，在一開始兩種藻類的葉綠素含量都有所上升，這說明兩種藻類的光合作用強(qiáng)度在上升，初步推測(cè)在第一個(gè)周內(nèi)，藻類在水體尚能正常生長(zhǎng)，這或許是由于葉綠體的膜結(jié)構(gòu)或是細(xì)胞中存在其他結(jié)構(gòu)可以延緩?fù)饨绮焕h(huán)境對(duì)于葉綠體的損傷；但一周之后，兩種藻類的葉綠素含量都呈現(xiàn)大幅下降的趨勢(shì)，總體圖像呈現(xiàn)倒“V”型，這證明農(nóng)藥對(duì)于葉綠體的傷害較大且相關(guān)保護(hù)結(jié)構(gòu)的作用存在極限。

圖3 兩種藻類的還原糖含量對(duì)比

表2 兩種藻類葉綠素含量變化

圖4 兩種藻類的葉綠素含量

圖5、表3為兩種藻類蛋白質(zhì)的含量變化圖，兩種藻類在這一指標(biāo)上同步變化，在開始的兩個(gè)周期里，藻類的蛋白質(zhì)含量都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但后期金魚藻的蛋白質(zhì)含量回升更快，在實(shí)驗(yàn)的4個(gè)周期里金魚藻蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)上升態(tài)勢(shì)，黑藻則在下降后趨于平穩(wěn)。

在第四周期觀察到金魚藻出現(xiàn)腐爛，水中有菌落生長(zhǎng)，結(jié)合數(shù)據(jù)我們推測(cè)，因?yàn)榻痿~藻中蛋白質(zhì)含量較高，既可以為水中微生物提供優(yōu)良的營(yíng)養(yǎng)，又因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的空間結(jié)構(gòu)易被破環(huán)，因此金魚藻在農(nóng)藥溶液中易腐敗，在不利環(huán)境中的生存能力不及黑藻。

圖6、表4與圖7、表5分別表示濁度與色度。從濁度比較來看，兩種藻類對(duì)于水體都有著明顯的凈化作用，說明養(yǎng)殖水藻能夠有效吸附水中的懸浮物，降低濁度。但從色度來看，金魚藻后期有逐漸上升的趨勢(shì)，黑藻則能夠降低色度，由于金魚藻葉片細(xì)碎，在后期水體顏色加深明顯，有一組甚至發(fā)霉，導(dǎo)致色度攀升。

表3 兩種藻類蛋白質(zhì)含量變化

圖5 兩種藻類蛋白質(zhì)含量

表4 兩種藻類水體濁度變化

表5 兩種藻類水體色度變化

圖6 兩種藻類濁度變化

圖8、表6表示兩種藻類COD(化學(xué)需氧量)的變化圖，黑藻總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，金魚藻則呈上升趨勢(shì)，說明金魚藻對(duì)于水體的凈化能力不如黑藻，水中有機(jī)物污染加劇，在培養(yǎng)過程中我們也直觀地看到了這種表現(xiàn)：在金魚藻的4個(gè)平行樣中，有一個(gè)在最后一個(gè)周期里長(zhǎng)出了黑色霉斑，這是水體腐敗到一定程度的表現(xiàn)。黑藻則能夠降解吸收一部分水中的污染物，而且直觀看來，水體中并沒有金魚藻那么多殘?jiān)?/p>

圖7 兩種藻類色度變化

表6 兩種藻類水體COD變化

圖8 兩種藻類COD的變化

4 總結(jié)與討論

本文初步利用紫外分光光度法探究了在相同濃度的多菌靈溶液(有效成分濃度0.5 mg/L)中黑藻和金魚藻在研究周期(4周)里的葉綠素、蛋白質(zhì)、還原糖三項(xiàng)指標(biāo)的變化，并通過比較這些生物指標(biāo)來反映藻類對(duì)于農(nóng)藥的反應(yīng)。在水體方面，通過色度、濁度、COD(化學(xué)需氧量)3個(gè)指標(biāo)反映出了藻類對(duì)于水體的影響。初步得出以下結(jié)論。

(1)利用紫外分光光度法能夠快速、準(zhǔn)確地得到藻類生物指標(biāo)的具體數(shù)值，這一方法可以廣泛的應(yīng)用于各種植物的各項(xiàng)生物指標(biāo)的準(zhǔn)確檢測(cè)。

(2)黑藻對(duì)于多菌靈溶液的抗逆性更好，在本實(shí)驗(yàn)的3個(gè)指標(biāo)中，黑藻表現(xiàn)更好，指標(biāo)更加穩(wěn)定，部分指標(biāo)在最后還有上升的趨勢(shì)。金魚藻則呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，并且可以明顯觀察到葉片的腐爛、變黃，這說明金魚藻更易腐爛。

(3)黑藻對(duì)于水體凈化效果更好，在濁度和色度兩個(gè)指標(biāo)上黑藻更低一些，而金魚藻則導(dǎo)致水體渾濁。在COD指標(biāo)上，黑藻有明顯的優(yōu)勢(shì)，這說明水體中的有機(jī)農(nóng)藥能夠被黑藻吸收。

(4)同時(shí)，實(shí)驗(yàn)表明在池塘、魚缸等地方養(yǎng)殖金魚藻并不是一個(gè)十分明智的選擇，適當(dāng)種植黑藻或許更加有利于水體凈化，可以延長(zhǎng)抽換水的周期。

綜上所述，多菌靈作為廣譜殺菌劑對(duì)于黑藻和金魚藻確實(shí)有影響，金魚藻由于其較高蛋白質(zhì)含量，對(duì)于農(nóng)藥更加敏感，各項(xiàng)指標(biāo)變化更加明顯、波動(dòng)更大，致使水體明顯渾濁；黑藻則對(duì)多菌靈表現(xiàn)出良好的抗逆性，其生理指標(biāo)較穩(wěn)定，且對(duì)于水體的凈化效果明顯。

本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用化學(xué)方法來分析生物生長(zhǎng)狀況，結(jié)論更為客觀、直觀，實(shí)驗(yàn)過程快捷，且適用面廣泛。但由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間、個(gè)人能力的不足對(duì)多菌靈對(duì)于黑藻和金魚藻的影響探究不足，討論后認(rèn)為應(yīng)當(dāng)在以后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)圍繞以下幾點(diǎn)探究。

(1)設(shè)置濃度梯度來研究各種濃度的農(nóng)藥對(duì)于兩種水藻的影響，尋找水藻降解農(nóng)藥的最有效率濃度。

(2)增加藻類種類，尋找一種最為經(jīng)濟(jì)、高效的降解多菌靈的藻類，這樣可以使得這個(gè)實(shí)驗(yàn)的實(shí)際應(yīng)用更加可能。

(3)為落實(shí)多菌靈對(duì)于藻類影響是直接影響還是通過影響水體間接影響藻類設(shè)計(jì)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。