余靈芝, 戴丹平, 項秀瑤

余靈芝, 戴丹平, 項秀瑤, 臺州恩澤醫(yī)療中心(集團)臺州醫(yī)院藥劑科浙江省臺州市 317000

核心提要： 結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移及化療耐藥直接影響結(jié)直腸癌患者壽命, 越來越多的研究提示miRNA參與了結(jié)腸癌的耐藥過程.在本研究中, 我們對miR-20b在結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥中的作用進行了探討.相比于普通結(jié)腸癌細(xì)胞, 耐藥細(xì)胞系細(xì)胞中miR-20b表達水平明顯下調(diào).我們的結(jié)果表明耐藥細(xì)胞系細(xì)胞對5-氟尿嘧啶的耐藥性可由miR-20b介導(dǎo), 其機制與Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子信號通路表達下調(diào)相關(guān).

0 引言

結(jié)腸癌是一種常見的腫瘤, 在世界范圍內(nèi)均造成極大的公共健康問題負(fù)擔(dān).近幾十年來, 我國結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢[1].5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)是廣泛用于結(jié)腸癌治療的主流化療藥物[2,3].5-FU的藥理作用是通過阻斷胸腺嘧啶的合成來阻斷DNA復(fù)制的[4,5],5-FU可以影響細(xì)胞周期從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6].然而許多結(jié)腸癌患者在使用5-FU化療后表現(xiàn)出耐藥性和高復(fù)發(fā)率.因此, 耐藥性被認(rèn)為是結(jié)腸癌化療治療中最大的障礙之一, 目前迫切需要提高結(jié)腸癌化療治療的敏感性和預(yù)防化療耐藥性的新策略.

miRNA是一類高度保守的小型非編碼RNA, 通過抑制mRNA的翻譯和降解來調(diào)節(jié)基因表達[7].越來越多的證據(jù)表明, miRNA在細(xì)胞功能中起重要作用, 在結(jié)腸癌細(xì)胞中, 許多miRNAs的表達失調(diào)與結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU的耐藥性有關(guān)[8-10], 但具體機制并不清楚.先前的研究已經(jīng)表明, 特異性靶向miRNA可以通過降低癌細(xì)胞耐藥性從而改善化療效果, 從而為癌癥治療開辟新的途徑[11].近年來研究發(fā)現(xiàn), miR-20b在許多類型的癌組織中表達下調(diào).此外, miR-20b通過介導(dǎo)細(xì)胞周期調(diào)控和SP-1介導(dǎo)的MMP-2表達抑制膀胱癌EJ細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[12].研究發(fā)現(xiàn)miR-20b在結(jié)腸癌中的表達比正常結(jié)腸組織低, 表明miR-20b在結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)展中起重要作用[13].然而, miR-20b在結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥中的作用及機制尚不清楚.

鑒于對耐藥機制的更好理解可以為結(jié)腸癌的治療提供新的見解, 我們使用對5-FU敏感或耐藥的兩個同源細(xì)胞系SW480進行了研究, 探討了miR-20b在結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU化療耐藥中的作用.我們的研究結(jié)果提示,miR-20b通過調(diào)節(jié)Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions, JAK/STAT)信號通路從而調(diào)節(jié)了SW480對5-FU的耐藥性.

1 材料和方法

1.1 材料 結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480, 購自美國類型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC; Manassas, VA, 美國), 細(xì)胞培養(yǎng)用5-FU、無血清培養(yǎng)基、胰島素、表皮生長因子以及轉(zhuǎn)鐵蛋白均購自于美國Sigma-Aldrich.細(xì)胞活力測定中MTT、McCoy5A無血清培養(yǎng)基和二甲基亞砜購自于美國Sigma-Aldrich, 細(xì)胞活力測定試劑盒CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay購自于美國Promega.RNA干擾實驗中miR-20b模擬物及其陰性對照購自中國RiboBio, RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000購自于美國Invitrogen, Opti-MEM?培養(yǎng)基購自于美國Gibco.逆轉(zhuǎn)錄實驗中, TRIzol?試劑購自于美國Invitrogen, 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及SYBR?Premix Ex Taq? II購自于日本TaKaRa Bio, 寡聚體(dT)12-18和miRNA特異性引物由中國RiboBio合成.免疫印跡實驗中用到的RIPA裂解液購自于中國Solarbio, BCA試劑盒購自于美國Thermo, 其余相關(guān)試劑以及細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)試劑均購自于美國Sigma-Aldrich.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)： 結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480對5-FU敏感,SW480/5-FU細(xì)胞系對5-FU具有抗性, 通過將SW480細(xì)胞與水平不斷增加的5-FU共同孵育而產(chǎn)生.在37 ℃和5%CO2濃度下, McCoy5A無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)兩種細(xì)胞,培養(yǎng)基中加入20 μg/mL胰島素、10 ng/mL表皮生長因子和4 g/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白.持續(xù)藥物處理耐藥細(xì)胞系.

1.2.2 細(xì)胞活力測定： 將細(xì)胞以2×104細(xì)胞/100 mL的濃度在96孔板中培養(yǎng), 并用5-FU(分別為5、10、15和20 μg/mL)處理指定的時間以評估增殖.培養(yǎng)72 h后存活的細(xì)胞用MTT染色2 h.用分光光度計測定二甲基亞砜溶解在570 nm處的吸光度.細(xì)胞活力測定使用CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay試劑盒, 根據(jù)說明將OD的比率計算出細(xì)胞存活率.

1.2.3 miRNA和RNA干擾： miR-20b模擬物及其陰性對照通過RiboBio公司合成.RNA寡核苷酸轉(zhuǎn)染在Opti-MEM?培養(yǎng)基中利用Lipofectamine?2000進行轉(zhuǎn)染, 根據(jù)說明操作.miR-20b最終濃度為100 nmol/L, 48 h后測定其表達水平.

1.2.4 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄PCR： 根據(jù)說明, 用TRIzol?試劑從細(xì)胞培養(yǎng)物中提取總RNA.使用PrimeScript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄.加入寡聚體(dT)12-18或miRNA特異性引物啟動cDNA合成.PCR在實時PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems, 美國)中進行, PCR體系中添加SYBR?Premix Ex Taq? II.

1.2.5 免疫印跡試驗： 檢測蛋白表達.首先用RIPA裂解液裂解細(xì)胞, 取全蛋白.利用BCA法將蛋白樣品定量至統(tǒng)一濃度后, 取20 μg蛋白樣品通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離總蛋白.電泳結(jié)束后, 將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至甲醇預(yù)活化的PVDF膜, 轉(zhuǎn)膜條件為100 V/2 h.轉(zhuǎn)模結(jié)束后利用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h并以1：1000的稀釋比例孵育一抗并4 ℃過夜.第二天, 以TBST洗滌后室溫孵育相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗1 h, 以TBST洗滌后利用化學(xué)發(fā)光成像儀顯影.

1.2.6 細(xì)胞遷移和侵襲能力實驗： 將Matrigel 1：8稀釋包被在Transwell小室底部膜的上室面, 置于37 ℃ 30 min使Matrigel聚合成凝膠, 使用前將基底膜水化.消化后的細(xì)胞離心棄去培養(yǎng)液并重懸, 調(diào)整細(xì)胞密度至5×105/mL.取懸液100 μL加入Transwell小室, 常規(guī)培養(yǎng)24 h.取出Transwell小室, 棄去孔中培養(yǎng)液, PBS洗2遍后甲醇固定30 min.0.1%結(jié)晶紫染色20 min, 400倍顯微鏡下記數(shù).

統(tǒng)計學(xué)處理使用Graphpad Prism 7.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析.方差分析后進行單因素方差分析或非配對t檢驗.數(shù)據(jù)表示為mean±SD.P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 SW480/5-FU細(xì)胞對5-FU具有耐藥性 為了解結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU耐藥的機制, 我們測定了5-FU對SW480與SW480/5-FU細(xì)胞生長的影響, 發(fā)現(xiàn)5-FU以劑量依賴的方式降低了結(jié)腸癌細(xì)胞的活性, 5-FU對SW480細(xì)胞的抑制作用比SW480/5-FU細(xì)胞更為明顯(圖1).兩組細(xì)胞分別用5、10、15或20 μg/ml 5-FU處理SW480和SW480/5-FU細(xì)胞72 h后進行觀察, 隨著5-FU濃度的增加, SW480相比于SW480/5-FU細(xì)胞存活率下降明顯.當(dāng)5-FU濃度為15 μg/mL和20 μg/mL時, SW480細(xì)胞存活率分別為SW480/5-FU細(xì)胞的31.56%和16.27%, 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001).

圖1 5-FU以劑量依賴的方式降低了結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的活性.bP＜0.001, 與NC組相比.

圖2 miR-20表達量在SW480與SW480/5-FU細(xì)胞中的差異.bP＜0.01, 與SW480組相比.

圖3 轉(zhuǎn)染外源性miR-20b類似物后細(xì)胞活性及形態(tài)的影響.A： 細(xì)胞活性比值, 轉(zhuǎn)染miR-20b后, SW480/5-FU細(xì)胞存活率明顯下降;B： 細(xì)胞形態(tài)示意圖.n = 3.bP＜0.001, 與NC組相比.

2.2 SW480/5-FU細(xì)胞中miR-20b表達量下降 隨后我們檢測了SW480與SW480/5-FU細(xì)胞中miR-20b表達量的差異, 結(jié)果顯示, 相比于SW480細(xì)胞, SW480/5-FU細(xì)胞中miR-20b表達量明顯下降, 具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01,圖2), 提示著miR-20b可能在SW480/5-FU細(xì)胞對5-FU的耐藥性中發(fā)揮作用.

2.3 轉(zhuǎn)染外源性miR-20b后可使SW480/5-FU存活率下降 為了進一步驗證miR-20b在SW480/5-FU細(xì)胞耐藥性中的作用, 我們將外源性miR-20b類似物轉(zhuǎn)染進入SW480/5-FU細(xì)胞中, 相比于對照組, 轉(zhuǎn)染miR-20b后的細(xì)胞活性明顯降低(圖3A).觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)染miR-20b后的SW480/5-FU細(xì)胞表現(xiàn)出輪廓皺縮, 突起減少等增殖能力減弱特征(圖3B), 這些證據(jù)表明miR-20b的過表達可減弱細(xì)胞的增殖狀態(tài)和活性.

2.4 轉(zhuǎn)染外源性miR-20b后可使細(xì)胞遷移和侵襲能力下降 隨后, 我們進一步觀察了轉(zhuǎn)染miR-20b后SW480/5-FU細(xì)胞遷移和侵襲能力的改變.將外源性miR-20b轉(zhuǎn)染入SW480/5-FU細(xì)胞, 用Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲.結(jié)果顯示miR-20b抑制了SW480/5-FU細(xì)胞的遷移和侵襲, 相比于對照組, 細(xì)胞計數(shù)明顯降低, 在細(xì)胞遷移實驗中, 轉(zhuǎn)染miR-20b組相比于對照組細(xì)胞計數(shù)下降了63.5%, 在細(xì)胞侵襲實驗中, 轉(zhuǎn)染miR-20b組下降了60.2%, 結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異(圖4).

2.5 miR-20b對SW480/5-FU細(xì)胞JAK/STAT3信號通路的影響 JAK/STAT3在細(xì)胞的增殖及癌癥耐藥中發(fā)揮重要作用[14], 為了探索miR-20b對調(diào)節(jié)SW480/5-FU細(xì)胞耐藥性及影響增殖作用的機制, 我們對SW480/5-FU細(xì)胞中JAK/STAT3信號通路進行了檢測.通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)染了miR-20b后的SW480/5-FU細(xì)胞中,JAK/STAT3信號通路中的關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平顯著下降.我們發(fā)現(xiàn)相對于對照組, miR-20b過表達組JAK、STAT3含量基本無變化而p-JAK、p-STAT3表達均下調(diào)(圖5A), 差異有統(tǒng)計學(xué)意義, 提示miR-20b抑制SW480/5-FU細(xì)胞的增殖和遷移可能是通過抑制JAK/STAT3信號通路激活而介導(dǎo)的.

3 討論

結(jié)腸癌是常見的、病發(fā)于結(jié)腸部位的惡性腫瘤.5-FU被廣泛認(rèn)為是結(jié)腸癌治療的標(biāo)準(zhǔn)療法, 臨床上通常與葉酸鈣聯(lián)合使用.雖然5-FU能使結(jié)腸癌患者的中位生存期提高近兩年[15], 但5-FU的耐藥性是結(jié)腸癌治療過程中的一個嚴(yán)重問題.為了探討結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU的耐藥機制,我們從結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480建立了對5-FU耐藥細(xì)胞系SW480/5-FU, 我們的實驗發(fā)現(xiàn)此細(xì)胞系對5-FU不敏感.隨后, 我們通過逆轉(zhuǎn)錄實驗發(fā)現(xiàn), SW480/5-FU細(xì)胞中miR-20b表達量明顯下降.

圖4 細(xì)胞遷移侵襲實驗及細(xì)胞計數(shù).A： 細(xì)胞遷移實驗; B： 細(xì)胞遷移實驗統(tǒng)計結(jié)果; C： 細(xì)胞入侵實驗; D： 入侵實驗統(tǒng)計結(jié)果.n＝3, bP＜0.01,cP＜0.001, 與NC組相比.

圖5 miR-20b對SW480/5-FU細(xì)胞JAK/STAT3信號通路的影響.A： 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測JAK/STAT3信號通路中關(guān)鍵蛋白含量變化; B：p-JAK/ JAK蛋白表達統(tǒng)計圖; C： p-STAT3/ STAT3蛋白表達統(tǒng)計圖.n = 3.bP＜0.01, 與NC組相比.

miRNA是一組含量豐富的內(nèi)源性小分子非編碼RNA, 通過翻譯抑制或降解其靶mRNA來發(fā)揮蛋白編碼基因的調(diào)節(jié)作用[16].近年來, 越來越多的證據(jù)表明,miRNA在癌癥發(fā)生中起著重要作用, 這其中有許多在結(jié)腸癌細(xì)胞中異常表達[17-19].有報道認(rèn)為, miRNA可以作為篩選結(jié)腸癌的標(biāo)志物[20,21].關(guān)于miRNA在結(jié)腸癌耐藥性方面的研究, 有人曾報道了microRNA-425-5p通過調(diào)節(jié)細(xì)胞程序性死亡來降低結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU耐藥性[22],然而miR-20b在結(jié)腸癌中的耐藥性研究卻罕見報道.為了探究miR-20b在SW480/5-FU細(xì)胞耐藥性的作用, 我們將外源性miR-20b轉(zhuǎn)染入SW480/5-FU細(xì)胞, 觀察其細(xì)胞活性以及其對SW480/5-FU細(xì)胞遷移和侵襲的影響.將外源性miR-20b轉(zhuǎn)入SW480/5-FU細(xì)胞后我們發(fā)現(xiàn), 相比于對照組其耐藥性降低, 細(xì)胞遷移和侵襲能力下降.

細(xì)胞內(nèi)信號分子的異常激活是癌細(xì)胞的特性之一,這其中就包括JAK/STAT信號通路.JAK/STAT信號通路主要調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育, 參與干細(xì)胞維持、造血和炎癥反應(yīng)等過程.活化后JAK激活STAT, STAT隨后形成二聚體并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核.STAT二聚體與特定的啟動子序列結(jié)合并調(diào)節(jié)控制細(xì)胞增殖、分化和凋亡等細(xì)胞過程的基因轉(zhuǎn)錄[23].近些年, 有許多報道證明了JAK/STAT信號通路的異常激活與多種癌癥發(fā)病具有相關(guān)性, 這其中就包括結(jié)腸癌[24,25].然而, JAK/STAT信號通路在結(jié)腸癌耐藥性的作用并不明晰.為了證明miR-20b是否通過JAK/STAT信號通路調(diào)控了SW480/5-FU細(xì)胞的耐藥性, 我們檢測了SW480/5-FU細(xì)胞中JAK/STAT3信號通路中相關(guān)蛋白表達情況.我們發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)染了外源性miR-20b的SW480/5-FU細(xì)胞中, p-JAK、p-STAT3的表達均下調(diào), 而JAK、STAT3變化不大, 因此p-JAK/JAK、p-STAT3/STAT3比值顯著下降, 說明此信號通路被抑制.

總之, 本研究發(fā)現(xiàn)SW480/5-FU細(xì)胞相比于SW480細(xì)胞miR-20b表達量明顯下降, 轉(zhuǎn)染外源性的miR-20b后, SW480/5-FU細(xì)胞耐藥性明顯下降, 細(xì)胞遷移和增殖能力相比于對照組明顯降低.因此, 我們有理由認(rèn)為miR-20b可降低結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU的耐藥性.蛋白免疫印跡實驗結(jié)果提示miR-20b可能通過抑制JAK/STAT3信號通路提高了SW480/5-FU細(xì)胞對5-FU的敏感性.我們的研究結(jié)果提示了一種結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU耐藥的新機制, 為結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性的分子病理機制提供了新的解釋, 并為其治療提供了潛在靶點.

文章亮點

實驗背景

結(jié)腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一, 雖然結(jié)腸癌的診療取得了較大的進展, 但化療的耐藥性仍是臨床治療的難點, 嚴(yán)重影響著患者預(yù)后.

實驗動機

MiRNA可通過抑制相關(guān)蛋白mRNA的翻譯和降解來調(diào)節(jié)基因表達.越來越多的研究表明, miRNA在結(jié)腸癌細(xì)胞中發(fā)揮重要作用.以往的研究發(fā)現(xiàn), 通過調(diào)節(jié)miRNA可以改變癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性從而改善化療效果, 這為癌癥的治療提供了新思路.研究發(fā)現(xiàn)miR-20b在多種腫瘤組織中表達下調(diào).在結(jié)腸癌中miR-20b的表達比正常結(jié)腸組織低, 提示miR-20b的抑癌作用.miRNA與結(jié)腸癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-FU)的耐藥性的具體作用及機制并不清楚.

實驗?zāi)繕?biāo)

對耐藥機制的新探索可以為結(jié)腸癌的治療提供新的思路, 我們使用對5-FU敏感或耐藥的兩個同源細(xì)胞系SW480進行了研究, 探討了miR-20b在結(jié)腸癌細(xì)胞對5-FU化療耐藥中的作用及機制.

實驗方法

通過藥物篩選分選出普通結(jié)腸癌細(xì)胞(SW480)與耐藥細(xì)胞(SW480/5-FU).對兩種細(xì)胞的miRNA水平進行檢測, 尋找有差異的miRNA并進行干預(yù).在表對SW480/5-FU細(xì)胞轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)入外源性目標(biāo)miRNA后, 觀察對其耐藥性及其他腫瘤生物特性的影響并尋找其中的機制.

實驗結(jié)果

耐藥細(xì)胞系對5-FU表現(xiàn)出明顯的耐藥性.逆轉(zhuǎn)錄實驗結(jié)果表明耐藥細(xì)胞系miR-20b表達明顯下調(diào), 將miR-20b轉(zhuǎn)染入耐藥細(xì)胞后, 顯著降低了其耐藥性, 并且降低了其轉(zhuǎn)移和侵襲能力明.WB實驗顯示, 轉(zhuǎn)染miR-20b后的耐藥細(xì)胞絡(luò)氨酸激酶(janus kinase, JAK)與轉(zhuǎn)錄因子(signal transduction and activator of transcription, STAT)磷酸化比例下調(diào), JAK/STAT3信號通路被抑制.

實驗結(jié)論

SW480/5-FU對5-FU的耐藥性可由miR-20b介導(dǎo), 其機制與JAK-STAT信號通路表達下調(diào)相關(guān).

展望前景

結(jié)腸癌是美國癌癥死亡的第三大原因.早期結(jié)腸癌可以手術(shù)切除, 但晚期疾病則需要更多的靶向療法.研究結(jié)腸癌的研究人員長期以來被結(jié)腸癌的耐藥性困擾, 傳統(tǒng)化療藥物對阻斷促進結(jié)腸癌進展的效果有限, 通過對miRNA調(diào)控這一新策略, 我們對結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性的分子病理機制提供了新的解釋, 并為其治療提供了潛在靶點.