張璐，閻海濤，任天寶, ，李帥，楊永鋒，彭桂新，于建春，劉國(guó)順,

1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，煙草行業(yè)煙草栽培重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002；

2 河南省生物炭工程技術(shù)研究中心，鄭州 450002；

3 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，鄭州 450000

近年來，煙葉生產(chǎn)中由于過量施用化肥，造成植煙土壤養(yǎng)分供應(yīng)失調(diào)[1]，不利于土壤碳含量的增加[2]，導(dǎo)致微生物群落多樣性降低[3]，嚴(yán)重影響著烤煙質(zhì)量的提高。土壤微生物是土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化、循環(huán)的動(dòng)力[4]，參與有機(jī)質(zhì)分解、腐殖質(zhì)形成，并調(diào)控土壤中能量和養(yǎng)分循環(huán)等過程[5]。保障煙田土壤養(yǎng)分協(xié)調(diào)和微生態(tài)環(huán)境健康，是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)烤煙的基礎(chǔ)。施用有機(jī)物料調(diào)控土壤微生物群落代謝功能和結(jié)構(gòu)，改善土壤質(zhì)量，已成為切實(shí)有效的農(nóng)業(yè)管理措施。

目前，關(guān)于土壤微生物的研究方法已有大量報(bào)道[6]，其中BIOLOG-ECO培養(yǎng)技術(shù)是一種采用微生物對(duì)不同碳源利用情況來表征其群落多樣性的研究方法，能夠快捷簡(jiǎn)便地得到分析結(jié)果。目前研究多集中于其他作物領(lǐng)域[7]，或是有機(jī)肥料對(duì)連作植煙土壤微生物功能多樣性的影響[8-9]。慕平[10]研究表明作物秸稈還田能夠顯著增加土壤微生物碳源供給；顧美英[11]研究發(fā)現(xiàn)棉桿生物炭能夠顯著提高根際土壤微生物多樣性，并改變土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)；張逸飛[12]發(fā)現(xiàn)秸稈還田能夠提高土壤微生物群落物種均一性；喬潔[13]認(rèn)為草炭與氮肥配施顯著提高了土壤微生物量碳、氮，有利于改善土壤結(jié)構(gòu)和自我修復(fù)能力。此外，蒸汽爆破是利用蒸汽瞬間釋放的壓力以破壞物質(zhì)結(jié)構(gòu)的處理措施[14]，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域作為有機(jī)物料改良植煙土壤效應(yīng)的研究仍鮮見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)研究了生物炭、草炭和蒸汽爆破秸稈物料以相同施碳量施入土壤后對(duì)土壤速效養(yǎng)分及微生物功能多樣性的影響，以期探討不同有機(jī)物料對(duì)土壤的改良效應(yīng)，為有機(jī)物料還田改土提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)概況

試驗(yàn)于2017年5—10月在河南省登封市潁陽鎮(zhèn)進(jìn)行，海拔447 m，屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，年平均溫度15 ℃，≥0 ℃積溫5178.8 ℃，年平均降雨量614 mm，無霜期238 d。

供試土壤為壤質(zhì)潮土，其基本理化性質(zhì)為：有機(jī)碳6.67 g/kg，總氮1.35 g/kg，堿解氮51.8 mg/kg，速效磷14.3 mg/kg，速效鉀109.8 mg/kg，pH 7.12。試驗(yàn)用土取自大田耕作層表土，風(fēng)干過篩，除去石子和植物殘?bào)w。將風(fēng)干后的有機(jī)物料和化肥、土壤混勻后裝盆，每盆裝土25 kg，肥料用量為氮素6 g/盆，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）＝1∶1∶3，N、P、K肥分別為分析純硝酸銨（N 質(zhì)量分?jǐn)?shù)35 %）、磷酸二氫鉀（P2O5質(zhì)量分?jǐn)?shù)22.8 %）、硫酸鉀（K2O 質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 %），70 %硝酸銨、全部磷酸二氫鉀和40 %硫酸鉀做基肥，剩余在移栽后20 d做追肥隨水施入?？緹熎贩N為豫煙6號(hào)，5月2日移栽，其他管理按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)栽培方式進(jìn)行。有機(jī)物料成分見表1。

表1 供試有機(jī)物料的主要化學(xué)特性Tab.1 Nutrients content of tested organic fertilizers

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用盆栽試驗(yàn)，共設(shè)5個(gè)處理：?jiǎn)问┗剩–K）；化肥+草炭（T1）；化肥+花生殼生物炭（T2）；化肥+汽爆煙梗（T3）；化肥+汽爆玉米秸稈（T4）。汽爆物料制取工藝：采用鶴壁市正道生物能源公司QBS-200B汽爆工藝試驗(yàn)臺(tái)，將煙?；蛴衩捉斩挿鬯?～7 cm，在蒸汽壓力2.0±0.1 MPa的條件下保持約5 min后進(jìn)行瞬時(shí)爆破，干燥后粉碎。除CK外，按總碳量一致的原則施用各有機(jī)物料，每盆總碳施用量為0.35 kg。各處理具體物料用量如表2所示。每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)，按照行株距130 cm×70 cm放置盆栽，大田整地起壟后將盆埋入土中，避免高溫陽光直射以保水降溫。各處理盆缽按照隨機(jī)區(qū)組排列。盆底放置碎瓷片防止煙株根系伸出盆外。

表2 試驗(yàn)施肥設(shè)計(jì) Tab.2 The experiment design of fertilization treatments

1.3 樣品采集及處理

于烤煙移栽后90 d，每個(gè)處理選代表性烤煙3株，每盆取10 cm以下相同土層的3個(gè)不同部位的鮮土約200 g，去除石礫和植物殘?bào)w，混勻過10目篩后一部分保存于4 ℃冰箱中用于土壤微生物量碳、氮和微生物群落功能多樣性測(cè)定，一部分風(fēng)干過40目篩用于測(cè)定土壤酶活性、有機(jī)碳、堿解氮、速效磷、速效鉀和pH。

1.4 測(cè)定方法

土壤堿解氮、有效磷、速效鉀含量用常規(guī)方法測(cè)定[15]；pH值采用pH計(jì)測(cè)定，土水比1∶2.5；有機(jī)碳（SOC）采用重鉻酸鉀外加熱法測(cè)定[15]；全氮（TN）采用全自動(dòng)CN元素分析儀測(cè)定（型號(hào)：vario MACRO CNS）；可溶性有機(jī)碳（DOC）采用蒸餾水提取，島津TOC-VCPH儀測(cè)定；蔗糖酶活性采用3, 5-二硝基水楊酸比色法[16]測(cè)定；脲酶活性采用比色法[16]測(cè)定；土壤微生物量碳（SMBC）、氮（SMBN）采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法[17-18]測(cè)定；土壤微生物熵（qMB）取SMBC與SOC的比值。

土壤微生物群落功能多樣性采用96孔BIOLOG ECO板進(jìn)行檢測(cè)，每一測(cè)試板內(nèi)有96個(gè)小孔，其中含有3個(gè)重復(fù)的系列，每個(gè)系列中包含1個(gè)空白對(duì)照（水）和31種碳源。根據(jù)微生物利用碳源引起指示劑的變化檢測(cè)和判斷不同的微生物群落結(jié)構(gòu)，接種后28℃下恒溫培養(yǎng)7 d，每隔24 h用BIOLOG自動(dòng)讀板儀在590 nm下讀數(shù)。上述操作均在無菌條件下進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)處理

土壤微生物活性測(cè)定結(jié)果以烘干土重為基礎(chǔ)（105℃，24 h）。微生物對(duì)碳源的利用采用微平板每孔顏色平均變化率（Average well color development，AWCD）描述，其中數(shù)值小于0的按0處理。應(yīng)用Shannon、Simpson和McIntosh這3個(gè)多樣性指數(shù)計(jì)算培養(yǎng)72 h時(shí)的土壤微生物碳源利用的多樣性，其中在計(jì)算Simpson指數(shù)時(shí)，數(shù)據(jù)擴(kuò)大1000倍以防止出現(xiàn)負(fù)數(shù)[19]。采用Excel 2013和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 8.0進(jìn)行繪圖。

表3 不同有機(jī)物料對(duì)土壤養(yǎng)分含量和pH的影響Tab.3 Effects of different organic fertilizer on soil nutrients content and pH value

2 結(jié)果與分析

2.1 不同有機(jī)物料對(duì)土壤速效養(yǎng)分和pH的影響

從表3可見，施用有機(jī)物料可以顯著提高土壤堿解氮（AN）、速效磷（AP）和速效鉀（AK）含量。T3和T4處理AN含量顯著高于其他處理，比CK分別提高74.68 %和82.20 %。T3處理AP和AK含量在各處理中最高，與CK相比分別增加185.32 %和147.51 %，其次為T4處理。T1和T2處理AN和AP含量增加幅度小于T3和T4處理，但T2對(duì)土壤AK的提升效果好于T1。不同處理對(duì)土壤pH值影響不一致，除T2處理提高了土壤pH之外，其他處理都有一定程度降低。

2.2 不同有機(jī)物料對(duì)土壤碳、氮組分和微生物量的影響

由表4可知，施用有機(jī)物料可顯著提高SOC和TN含量，均以T4處理效果最好，比CK分別提高97.16 %和82.81 %；其次為T2和T3處理，且提高幅度顯著高于T1處理。土壤DOC以T4處理提高最多，相比CK提高2.37 %，T1、T2和T3處理相比CK都有不同程度的下降且達(dá)到顯著水平，分別降低18.86 %、42.75 %和16.76 %。施用有機(jī)物料對(duì)土壤微生物量碳也有顯著提高作用，處理間效果具有顯著差異；其中均以T4處理效果最好，其微生物量碳、氮含量均處于最高水平，分別較對(duì)照提高177.96 %和120.96 %，T1處理對(duì)SMBC有顯著提高作用，但對(duì)SMBN促進(jìn)作用不顯著。從土壤微生物熵qMB來看，T1、T3和T4處理均表現(xiàn)出促進(jìn)作用，其中T3和T4處理達(dá)到顯著水平，但T2處理顯著降低了qMB，相比CK下降11.22 %。

表4 不同有機(jī)物料對(duì)土壤碳、氮組分和微生物量的影響Tab.4 Effects of different organic fertilizers on soil carbon and nitrogen fractions and microbial biomass

2.3 不同有機(jī)物料對(duì)土壤酶活性的影響

從圖1可見，T2、T3和T4處理蔗糖酶活性相比CK有顯著提高，且T3和T4處理均高于T2處理，分別比CK提高88.74 %和91.23 %。T1處理蔗糖酶活性與CK相比無明顯差異。土壤脲酶活性以T4處理最高，且顯著高于其他處理，相比CK增加了124.42 %；T2和T3處理次之，且顯著高于T1處理。從土壤酶活性來看，T4處理效果最好，T1處理下土壤酶活性與CK對(duì)比無明顯改變。

圖1 不同有機(jī)物料施用對(duì)土壤酶活性的影響Fig.1 Effects of different organic fertilizers on soil enzyme activities

2.4 不同處理土壤微生物的代謝功能分析

圖2 不同有機(jī)物料處理平均顏色變化率（AWCD）變化Fig.2 Variations of average well color development (AWCD) for different organic fertilizer treatments

圖3 不同處理有機(jī)物料處理土壤微生物對(duì)6類碳源的利用情況Fig.3 Relative absorbance of the six kinds of carbon sources by soil microorganism treated with different organic fertlizers

2.4.1 不同有機(jī)物料施用下土壤微生物碳源利用情況各處理土壤微生物碳源利用的平均顏色變化率（AWCD）如圖2所示。不同處理的AWCD有差異且上升速度不同，并且這種差異隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸加大。與CK相比，各處理AWCD都有提高，說明施用有機(jī)物料能夠提高土壤微生物對(duì)底物碳源的利用能力，其中T2、T3和T4處理微生物利用碳源能力無明顯差異，但都明顯高于T1和CK處理。從不同處理土壤微生物對(duì)6類碳源的相對(duì)利用率分析看（圖3），T1處理對(duì)氨基酸類碳源的相對(duì)利用率最高，T2處理主要利用羧酸類和多聚物類的碳源，T3處理土壤微生物對(duì)酚酸類碳源的利用最多，T4處理利用最多的為碳水化合物類碳源；CK處理單施化肥條件下，對(duì)多聚物類碳源的利用率顯著低于其他處理。

2.4.2 不同有機(jī)物料施用下土壤微生物利用碳源的主成分分析

BIOLOG的主成分分析能夠解釋不同處理土壤微生物碳源利用的差異。BIOLOG ECO平板中31種碳源分為6大類（表5）。利用培養(yǎng)72 h后的BIOLOG比色結(jié)果進(jìn)行主成分分析，結(jié)果表明PC1和PC2分別可以解釋所用變量方差的64.86 %和20.48 %（圖4）。根據(jù)分析結(jié)果將6類碳源分為2大類，由表5可知PC1包含的碳源有4類，分別是碳水化合物類、氨基酸類、酚酸類和胺類；PC2中包含的碳源有2類，分別是羧酸類和多聚物類。

進(jìn)一步分析表明（圖4），各處理之間有明顯的空間分異，T2處理所對(duì)應(yīng)的投影點(diǎn)主要分布于PC2軸的正端，說明該處理土壤中的土壤微生物主要利用PC2軸所荷載的碳源（羧酸類和多聚物類）；T4處理投影點(diǎn)主要分布于PC1軸正端，說明該處理土壤微生物主要利用PC1軸所荷載的碳源（碳水化合物類、氨基酸類、酚酸類和胺類）；T1和T3處理投影點(diǎn)主要分布于PC1和PC2軸的負(fù)端。

表5 元件荷載矩陣Tab.5 Component matrix

圖4 不同處理土壤微生物碳源利用特性的主成分分析Fig.4 PCA analysis of carbon utilization for microbial communities in soil treated by different organic fertilizers

2.4.3 不同有機(jī)物料施用下土壤微生物代謝功能多樣性分析

Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)分別代表了微生物群落的豐富度、最常見種的優(yōu)勢(shì)度和物種的均勻度。從表6可以看出，土壤微生物的Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)在各處理之間差異顯著（P＜0.05）。與對(duì)照相比，不同有機(jī)物料處理均能夠提高土壤微生物豐富度，以T2和T4處理較高，T1和T3處理次之。T2、T3和T4處理土壤微生物優(yōu)勢(shì)度指數(shù)均顯著高于對(duì)照，T1與對(duì)照差異不顯著。各處理均勻度指數(shù)與對(duì)照相比均有顯著提高，但4個(gè)施有機(jī)物料的處理間差異不明顯。

表6 不同處理的土壤微生物代謝功能多樣性指數(shù)Tab.6 Diversity indexes of soil microbial community metabolic function under different organic fertilizer treatments

3 討論

3.1 不同有機(jī)物料施用對(duì)土壤碳、氮組分及速效養(yǎng)分的影響

本研究中，施用有機(jī)物料顯著提高了土壤SOC和TN含量，這與李新華[20]和陳源泉[21]研究結(jié)果一致。草炭富含腐殖酸和有機(jī)質(zhì)[13]，生物炭含碳量豐富[22]、汽爆煙梗和玉米秸稈含有大量纖維素和木質(zhì)素[23-24]，在土壤微生物分解下進(jìn)入土壤，在相同總碳含量條件下，物料組分不同可能造成在土壤中的代謝快慢和產(chǎn)物有所差異，但都提高了土壤有機(jī)碳含量。張杰[25]研究表明，等碳量條件下施用秸稈和木質(zhì)素能顯著增加土壤DOC含量，施用生物炭處理較對(duì)照無顯著差異，高學(xué)振[26]研究發(fā)現(xiàn)，添加生物炭對(duì)砂姜黑土DOC影響不顯著， 本實(shí)驗(yàn)條件下生物炭處理DOC含量與對(duì)照相比未達(dá)到顯著差異，可能與生物炭能減少土壤DOC淋失[27]有關(guān)，需設(shè)置實(shí)驗(yàn)做進(jìn)一步探討。此外，王允青[28]研究表明秸稈還田后會(huì)釋放養(yǎng)分，以磷釋放率最大，與本試驗(yàn)中施用有機(jī)物料提高了土壤養(yǎng)分含量的結(jié)果一致。一方面由于有機(jī)物料多為植物殘?bào)w，富含化學(xué)能和礦質(zhì)養(yǎng)分，在田間腐解過程中釋放養(yǎng)分，提高土壤肥力；另一方面，有機(jī)物料也為土壤微生物繁殖提供了生存能源，提高了與養(yǎng)分代謝有關(guān)的微生物群落的豐度和活力，有關(guān)研究[29-30]發(fā)現(xiàn)有機(jī)肥能夠提高土壤反硝化菌種群落和根際土壤解磷菌活力，從而促進(jìn)土壤養(yǎng)分的代謝和轉(zhuǎn)化。

3.2 不同有機(jī)物料施用對(duì)微生物生物量和土壤酶活性的影響

有機(jī)物料的施入能夠向土壤輸入較多的有機(jī)碳源，為微生物提供所需營(yíng)養(yǎng)，促進(jìn)微生物繁殖，提高土壤微生物生物量。本研究中有機(jī)物料的施用也起到了提高土壤微生物生物量碳、氮和微生物熵的作用。生物炭比表面積大，孔隙多，能夠?yàn)橥寥牢⑸锏母街峁﹫?chǎng)所[31]，能夠吸附和儲(chǔ)存土壤養(yǎng)分，從側(cè)面促進(jìn)土壤微生物的繁殖，因此土壤微生物量相比對(duì)照有顯著提高；但由于生物炭成分結(jié)構(gòu)相對(duì)另外3種有機(jī)物料而言較為穩(wěn)定，不易被微生物利用。因此，本試驗(yàn)中生物炭處理微生物熵顯著低于汽爆煙梗和玉米秸稈處理。草炭含有豐富的有機(jī)質(zhì)，可為微生物提供豐富的活動(dòng)能源，但草炭處理微生物量氮顯著低于其他有機(jī)物料處理，可能是因?yàn)椴萏恐械母乘釋?duì)脲酶有抑制作用，影響土壤氮素轉(zhuǎn)化，減少了微生物可利用氮素含量。蒸汽爆破處理后的作物秸稈面積增大，有利于微生物的棲息和分解有機(jī)物，因此施用煙梗和玉米秸稈處理的微生物量和微生物熵均顯著高于其他處理。

脲酶在一定程度上反映了土壤供氮水平的高低[32]，蔗糖酶參與土壤中的蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖的過程，在碳循環(huán)中有重要作用。本研究中施用有機(jī)物料提高了土壤微生物量，可能是土壤微生物的增加為促進(jìn)含有土壤酶分泌物的產(chǎn)生創(chuàng)造條件，顯著提高了土壤脲酶和蔗糖酶活性，有利于加快有機(jī)物料在土壤中的分解轉(zhuǎn)化[33-35]。

3.3 不同有機(jī)物料施用對(duì)土壤微生物代謝功能多樣性影響

AWCD值反映了土壤微生物利用碳源的能力[36]，本研究中與對(duì)照相比除草炭外的各處理利用碳源的能力都有所提高，有機(jī)物料使用條件下微生物常見物種優(yōu)勢(shì)度和物種均勻度均優(yōu)于對(duì)照。另外，同一種有機(jī)物料處理下微生物群落對(duì)不同碳源的相對(duì)利用率存在明顯差異，原因可能是材料本身組分差異。許文歡[37]認(rèn)為生物炭的施用促進(jìn)了以多聚物類為碳源微生物群落的生長(zhǎng)，但未改變碳源利用多樣性。本研究結(jié)果表明，生物炭有利于以羧酸類和多聚物類為底物的微生物生長(zhǎng)，與其研究結(jié)果一致；然而不同的是在本試驗(yàn)中，生物炭處理在主成分分析中與其他處理明顯區(qū)別開來，可能是生物炭促進(jìn)一些微生物種群繁殖的同時(shí)，會(huì)抑制另一些微生物種群的繁殖，對(duì)豐富度和均一度造成一定影響[38-39]。本試驗(yàn)條件下土壤微生物功能多樣性被改變，可能與土壤質(zhì)地和生物炭用量及種類有關(guān)，需進(jìn)一步試驗(yàn)探究。

4 結(jié)論

施用有機(jī)物料促進(jìn)了土壤有機(jī)碳含量、微生物生物量的提高和土壤酶活性增強(qiáng)，改善了土壤養(yǎng)分狀況，使土壤微生物碳源利用能力得到增強(qiáng)，提高了微生物群落功能多樣性。生物、炭促進(jìn)了以羧酸類和多聚物類為碳源的微生物的生長(zhǎng)，汽爆玉米秸稈促進(jìn)了以碳水化合物類、氨基酸類、酚酸類和胺類為碳源的微生物的生長(zhǎng)?？傊?，有機(jī)物料為土壤微生物提供了豐富的碳源和生長(zhǎng)物質(zhì)，促進(jìn)利用不同種類碳源的微生物生長(zhǎng)，提高了土壤微生物對(duì)有機(jī)物料的轉(zhuǎn)化，對(duì)土壤改良具有積極效應(yīng)。