杜世也，張 穎，袁 文

海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院骨科，上海 200003

椎間盤退行性變（IDD）是引起下腰痛的主要原因之一［1］，嚴重危害公眾健康，并給社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔［2］。微RNA（miRNA）是一種能夠調(diào)控包括造血作用、器官形成、細胞凋亡、細胞增殖和腫瘤發(fā)生等多種細胞活動的非編碼單鏈RNA分子，可通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）結(jié)合干擾其翻譯過程或使其降解來抑制靶基因的表達［3］。研究表明，miRNA在髓核細胞、纖維環(huán)細胞、軟骨終板細胞的凋亡、增殖及細胞外基質(zhì)代謝中起到關(guān)鍵作用［4］，但其機制尚不完全清楚。研究發(fā)現(xiàn)，在慢性阻塞性肺疾病患者的肺成纖維細胞中，過表達miRNA-210可以降低自噬的發(fā)生率［5］，而在鼠髓核細胞中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）引起的自噬激活會下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）的表達［6］。本研究旨在探討在發(fā)生退行性變椎間盤髓核細胞中miRNA-210是否通過調(diào)節(jié)細胞自噬參與細胞外基質(zhì)代謝，進而影響IDD進程。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

收集24例IDD患者（男16例、女8例，年齡39 ～ 60歲、平均51.4歲；IDD組）和6例腰椎骨折患者（男5例、女1例，年齡18 ～ 25歲、平均22.2歲；對照組）的椎間盤組織，所有患者均知情同意。實驗所用主要試劑及設備：DMEM-F12培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、TRIzol細胞RNA抽提裂解液、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑、Opti-MEM培養(yǎng)液（Gibco公司，美國），BCA蛋白濃度檢測試劑盒、ECL發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，中國），單丹磺酰尸胺（MDC）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，中國），SuperScriptⅡReverse Transcriptase試劑盒、SYBR Green Real-Time PCR Master Mix試劑盒（TaKaRa公司，日本），LC3、Beclin-1、Ⅱ型膠原（ColⅡ）、蛋白多糖、MMP-3抗體、MMP-13抗體（Cell Signaling公司，美國），miRNA-210 mimic、miRNA-210 mimic control、miRNA-210 inhibitor、miRNA-210 inhibitor control、自噬相關(guān)蛋白（ATG）siRNA、Quik ChangeⅡXL Site-Directed Mutagenesis試劑盒（Thermo Fisher Scientific公司，美國），自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA；Selleck公司，美國），雙熒光素酶質(zhì)粒（Promega公司，美國），ABI 7500實時熒光定量聚合酶鏈反應（FQ-PCR）儀、ABI 2720 cDNA反轉(zhuǎn)錄儀（Life Technologies公司，美國），恒壓恒流電泳儀（申華生化技術(shù)開發(fā)公司，中國），核酸蛋白測定儀（Eppendorf公司，德國）。

1.2 髓核細胞分離及培養(yǎng)

收集髓核組織并用眼科剪將髓核組織剪至1 mm×1 mm×1 mm的小塊，置于離心管中。加入0.25%胰蛋白酶水浴37℃消化，每5 min搖動1次，20 min后離心（1 500 r/min，離心半徑10 cm，10 min）。棄除上清液后加入0.2%ColⅡ酶37℃水浴消化3 ～ 4 h，每5 min搖動1次。隨后加入含有20%FBS的DMEM-F12培養(yǎng)液終止消化，離心（1 500 r/min，離心半徑10 cm，10 min）后棄除上清液。加入培養(yǎng)液重新懸浮細胞后接種于培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置于含5% CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱中，每2 ～ 3 d更換1次培養(yǎng)液，每天觀察細胞生長及貼壁情況，細胞生長至80% ～ 90%融合時進行傳代。實驗用細胞為3代細胞。

1.3 MDC染色

將細胞用胰蛋白酶消化后離心（1 500 r/min，離心半徑10 cm，10 min），加入1×洗滌緩沖液清洗細胞后再次離心（1 500 r/min，離心半徑10 cm，10 min），棄除上清，加入適量體積的1×洗滌緩沖液使細胞重懸并將細胞密度調(diào)整至106/mL。將細胞懸液與MDC染色液混合均勻（細胞懸液體積∶MDC染色液體積= 9∶1），避光室溫下染色20 ～ 50 min。離心（1 500 r/min，離心半徑10 cm，10 min）收集細胞，加入100 μL收集緩沖液重懸細胞，將細胞懸液滴在載玻片上，熒光顯微鏡下觀察并拍照（激發(fā)濾光片波長355 nm，阻斷濾光片波長512 nm）。

1.4 細胞轉(zhuǎn)染及干預

在細胞融合度達到70% ～ 80%時進行細胞轉(zhuǎn)染。先將Opti-MEM分別與Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑及miRNA序列混合均勻，再將2種混合液混合孵育5 ～ 10 min。將miRNA序列與脂質(zhì)體的復合物均勻滴到細胞表面，置于細胞培養(yǎng)箱中24 h，完成轉(zhuǎn)染。根據(jù)實驗目的需要，部分實驗在進行miRNA-210 inhibitor和miRNA-210 inhibitor control轉(zhuǎn)染前需先用ATG siRNA或自噬抑制劑3-MA處理。

1.5 FQ-PCR

將經(jīng)過轉(zhuǎn)染和干預后的髓核細胞依照TRIzol試劑說明書方法提取細胞RNA，使用分光光度計檢測RNA濃度和純度，并以適當比例稀釋濃度過高的RNA，按照SuperScriptⅡReverse Transcriptase試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。應用FQ-PCR儀，按照SYBR Green Real-Time PCR Master Mix試劑盒說明書檢測相關(guān)指標的表達。

1.6 蛋白質(zhì)印跡分析

應用RIPA裂解液裂解細胞提取細胞蛋白，測定蛋白濃度，上樣進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，初始以80 V恒壓電泳40 min，后提升電壓至120 V電泳80 min。將蛋白條帶從凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，將膜放入封閉液中室溫下?lián)u晃封閉1 h，隨后按一定濃度加入不同一抗，4℃孵育過夜。洗膜后加入二抗室溫下?lián)u晃孵育1 h，清洗后滴加ECL發(fā)光液顯影，拍照，分析蛋白相對表達量。

1.7 生物信息學分析和雙熒光素酶報告實驗

用Target Scan預測miRNA-210靶基因，尋找與自噬相關(guān)的靶基因及其與miRNA-210的結(jié)合位點。應用PCR擴增靶基因的3'-UTR，并將其插入到熒光素酶報告基因質(zhì)粒中，使用QuikChangeⅡ XL Site-Directed Mutagenesis試劑盒構(gòu)建突變型熒光素酶報告質(zhì)粒。隨后用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將雙熒光素酶報告質(zhì)粒和miRNA-210 mimic、miRNA-210 mimic control、miRNA-210 inhibitor、miRNA-210 inhibitor control轉(zhuǎn)染到髓核細胞中，應用雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測其熒光活性。

1.8 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 7.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析并作圖。對于符合正態(tài)分布且方差齊性的組間獨立樣本均數(shù)的比較采用單因素方差分析，對于不符合正態(tài)分布或方差不齊的組間獨立樣本均數(shù)比較采用Wilcoxon秩和檢驗；以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA-210與細胞自噬的關(guān)系

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，在IDD組中，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ和Beclin-1的表達量明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05，圖1a）；FQ-PCR結(jié)果顯示，IDD組miRNA-210表達量明顯升高，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05，圖1b）。MDC染色結(jié)果顯示，IDD組細胞自噬水平低于對照組（圖1c，d）。以上說明發(fā)生退行性變的椎間盤髓核細胞自噬水平降低，miRNA-210表達量增加。

圖1 髓核細胞自噬水平和miRNA-210表達量Fig. 1 Expression of miRNA-210 and autophagy in nucleus pulposus cells

miRNA轉(zhuǎn)染效率如圖2a所示。蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，IDD組上調(diào)miRNA-210會導致髓核細胞中Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ表達量降低，下調(diào)miRNA-210會導致Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ表達量增加，與對照組相比差異均具有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05，圖2b，c）。以上結(jié)果說明miRNA-210可以抑制髓核細胞自噬。

2.2 miRNA-210對細胞外基質(zhì)代謝的影響

FQ-PCR和蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果顯示，IDD組上調(diào)miRNA-210導致髓核細胞中ColⅡ及蛋白多糖表達量降低，MMP-3和MMP-13表達量升高；下調(diào)miRNA-210導致髓核細胞中ColⅡ及蛋白多糖表達量升高，MMP-3和MMP-13表達量降低；與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05，圖3）。以上結(jié)果說明在發(fā)生退行性變的椎間盤髓核細胞中，miRNA-210激活MMP-3和MMP-13，促進細胞外基質(zhì)降解。

圖2 miRNA-210抑制髓核細胞自噬Fig. 2 miRNA-210 inhibiting autophagy of nucleus pulposus cells

圖3 miRNA-210對ColⅡ、蛋白多糖、MMP-3和MMP-13的影響Fig. 3 Effects of miRNA-210 on expression of ColⅡ，aggrecan，MMP-3 and MMP-13

自噬抑制劑3-MA會減弱miRNA-210對ColⅡ、蛋白多糖、MMP-3和MMP-13的調(diào)節(jié)作用（圖4），說明miRNA-210對細胞外基質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)是通過影響細胞自噬進行的。

圖4 細胞自噬參與miRNA-210對細胞外基質(zhì)代謝的影響Fig. 4 Involvement of autophagy in effects of miRNA-210 on extracellular matrix metabolism

2.3 miRNA-210與ATG7的關(guān)系

Target Scan預測到42個miRNA-210靶基因，其中ATG7為自噬相關(guān)基因。ATG7的雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，IDD組中，上調(diào)miRNA-210的髓核細胞野生型熒光素酶報告質(zhì)粒熒光活性明顯降低，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05），而突變型熒光素酶報告質(zhì)粒熒光活性沒有發(fā)生明顯改變；下調(diào)miRNA-210的髓核細胞野生型熒光素酶報告質(zhì)粒熒光活性明顯升高，與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義（P ＜ 0.05），而突變型熒光素酶報告質(zhì)粒熒光活性沒有發(fā)生明顯改變（圖5）。以上結(jié)果說明ATG7為miRNA-210的靶基因，且miRNA-210直接與ATG7的3'-UTR互補結(jié)合；在發(fā)生退行性變的椎間盤髓核細胞中miRNA-210靶向作用于自噬相關(guān)基因ATG7并抑制其表達以調(diào)節(jié)髓核細胞自噬。

ATG7 siRNA和miRNA-210 inhibitor共轉(zhuǎn)染后沉默ATG7，會減弱miRNA-210對ColⅡ、蛋白多糖、MMP-3和MMP-13的調(diào)節(jié)作用（圖6），說明ATG7參與細胞外基質(zhì)代謝，miRNA-210通過沉默ATG7抑制髓核細胞自噬，激活MMP-3和MMP-13，促進細胞外基質(zhì)（ColⅡ和蛋白多糖）降解，參與IDD進程。

圖5 雙熒光素酶報告實驗檢測熒光活性Fig. 5 Detection of fluorescence activity by dual-luciferase reporter assay

圖6 miRNA-210通過沉默ATG7引起細胞外基質(zhì)降解Fig. 6 miRNA-210 promoting extracellular matrix metabolism via silencing ATG7

3 討 論

miRNA與許多疾病的預后和進展息息相關(guān)，是細胞生理和病理過程的重要調(diào)節(jié)分子，在細胞增殖、凋亡、分化和癌變等過程中發(fā)揮重要作用［7］。miRNA通過與靶基因mRNA的3'-UTR結(jié)合，部分或完全抑制其翻譯過程，甚至直接分解靶基因mRNA來沉默靶基因的表達［8］，因此有潛力成為未來基因治療的靶點［9-11］。隨著研究者對于IDD機制研究的深入，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)miRNA在人正常椎間盤和發(fā)生退行性變的椎間盤組織中存在差異性表達，這些差異性表達的miRNA在細胞凋亡、蛋白水解酶和細胞外基質(zhì)的降解等生物過程中發(fā)揮著重要作用，這說明miRNA在IDD發(fā)生的機制中是不可或缺的重要調(diào)節(jié)分子［12-15］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，miRNA-210在發(fā)生退行性變的髓核細胞中表達明顯增加，進一步證實了miRNA-210參與IDD進程。

細胞自噬是一種由30多個自噬相關(guān)基因以及多種信號通路共同調(diào)節(jié)的多環(huán)節(jié)復雜細胞生命活動［16］。自噬活動主要表現(xiàn)為細胞內(nèi)部分長壽蛋白或細胞器被單層或雙層膜包裹后形成自噬體，自噬體再與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體進行消化和降解，從而實現(xiàn)損傷細胞器更新和細胞代謝［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，在發(fā)生退行性變的髓核細胞中自噬水平顯著降低。這與Caramés等［18］在關(guān)節(jié)領(lǐng)域的研究結(jié)果一致，他們發(fā)現(xiàn)在正常的人和小鼠關(guān)節(jié)軟骨中，自噬標志性基因LC3、Beclin-1和ULK-1呈高表達，而在發(fā)生退行性變的人和小鼠關(guān)節(jié)軟骨中，自噬的標志性基因表達明顯減少。

ColⅡ和蛋白多糖是椎間盤細胞外基質(zhì)的主要組成成分，細胞外基質(zhì)由椎間盤內(nèi)的細胞不斷合成和降解且處于動態(tài)平衡［19］。當椎間盤發(fā)生退行性變時，蛋白水解酶降解作用增強，使ColⅡ和蛋白多糖等細胞外基質(zhì)大量降解，導致動態(tài)平衡被打破，最終引起椎間盤高度下降、組織韌性降低等一系列病理改變［20］。ColⅡ和蛋白多糖的丟失被認為是椎間盤退行性變的早期指標［21］。MMP-3和MMP-13是基質(zhì)金屬蛋白酶家族的主要成員，眾多研究表明，MMP-3和MMP-13過表達會引起ColⅡ和蛋白多糖降解，最終導致IDD［22-24］。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miRNA-210會導致ColⅡ及蛋白多糖表達量降低，MMP-3和MMP-13表達量升高；下調(diào)miRNA-210導致ColⅡ及蛋白多糖表達量升高，MMP-3和MMP-13表達量降低；說明miRNA-210可以通過增加MMP-3和MMP-13的表達使細胞外基質(zhì)降解增加，打破細胞外基質(zhì)合成與分解原有的動態(tài)平衡，促進IDD的進展。

近期研究顯示，自噬在細胞外基質(zhì)代謝的過程中也起到重要作用，如在人椎間盤細胞中白藜蘆醇通過激活自噬降低TNF-α介導的MMP-3的表達［6］，在鼠髓核細胞中氨基葡萄糖通過促進自噬抑制白細胞介素1β引起的蛋白多糖降解等［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，IDD組上調(diào)miRNA-210會降低髓核細胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1和LC3Ⅱ/Ⅰ的表達，自噬抑制劑3-MA會減弱miRNA-210對ColⅡ、蛋白多糖、MMP-3和MMP-13的調(diào)節(jié)作用，說明在發(fā)生退行性變的髓核細胞中，自噬參與調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)代謝。

由于ATG7在自噬體和囊泡的形成過程中發(fā)揮重要作用，因此，在眾多的自噬相關(guān)基因中，ATG7是激活細胞自噬必不可少的基因［26］。一方面，ATG7起到連接酶樣作用，使ATG5和ATG12結(jié)合，這是自噬體形成過程中重要的一步［27］；另一方面，ATG7可以使不成熟的胞質(zhì)蛋白LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化為成熟的自噬體膜蛋白LC3Ⅱ［28］。有研究報道，ATG7缺陷小鼠由于缺乏自噬通路，出生后1 d內(nèi)就會死亡［29］。近期大量研究指出，許多miRNA（如miRNA-20a、miRNA-17和miRNA-137等）可以通過靶向沉默ATG7抑制細胞自噬過程［30-32］。本研究通過生物信息預測軟件預測出ATG7是miRNA-210的靶基因，并運用雙熒光素酶報告實驗證實了這一預測，且用siRNA沉默ATG7會減弱miRNA-210 inhibitor引起的ColⅡ和蛋白多糖表達量升高及MMP-3和MMP-13表達量降低的現(xiàn)象。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-210在發(fā)生退行性變的椎間盤組織中的表達量較健康椎間盤組織明顯升高，過表達的miRNA-210通過與自噬相關(guān)基因ATG7的3'-UTR結(jié)合沉默其表達，導致細胞自噬受到抑制，引起細胞外基質(zhì)中MMP-3和MMP-13表達量升高，ColⅡ和蛋白多糖降解增加，從而促使IDD進展。