譚 敏，曹 旭，徐 僑，張 夢，張 駒，韓 旭，賴 朋*

(1.西華大學(xué)西華學(xué)院， 四川 成都 610039； 2.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院， 四川 成都 610039)

目前，化療是惡性腫瘤的主要臨床治療手段，腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥(MDR，multiple drug resistance)是導(dǎo)致化療失敗的重要原因。MDR是指腫瘤細(xì)胞對一種抗腫瘤藥物產(chǎn)生耐藥性的同時，對結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同的其他抗腫瘤藥物也產(chǎn)生交叉耐藥性[1-2]。產(chǎn)生MDR最主要的原因是P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)對抗腫瘤藥物的外排作用。P-gp是MDR1基因表達(dá)產(chǎn)物，為ABC(ATP-binding cassette)家族成員，含2個跨膜結(jié)構(gòu)域，2個ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域。P-gp的底物與結(jié)合位點結(jié)合，消耗兩分子ATP泵出一分子藥物[3-4]。其他原因還有多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)、肺耐藥蛋白(LRP)、谷胱甘肽及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、PKC和TopoII等[5-6]。

P-gp抑制劑是逆轉(zhuǎn)MDR的常用藥物[7-8]，包括：鈣通道阻滯劑(維拉帕米)[9]、環(huán)孢菌素A[10]、抗激素類化合物(他莫昔芬)[11]等。這些逆轉(zhuǎn)劑的作用機(jī)制并不相同，有些作用于MDR1基因，降低 P-gp的表達(dá)[12]；有些與底物競爭結(jié)合P-gp[13]；有些與P-gp ATP結(jié)合部位結(jié)合抑制其作用[14]。近年來發(fā)現(xiàn)許多天然產(chǎn)物也有類似作用，如異喹啉類生物堿、粉防已堿等可通過抑制P-gp活性增強(qiáng)阿霉素或長春新堿等藥物的抗癌效果，這些化合物被稱為化療增敏劑[15-16]。

本研究從豆科植物皂莢(GleditsiaSinensisLam.)的棘刺中提取分離純化得到刺囊酸作為先導(dǎo)化合物，經(jīng)相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)制備了一系列衍生物(受試衍生物化學(xué)結(jié)構(gòu)及編號分別見圖1和表1)[17]。本實驗選取刺囊酸及其衍生物作為實驗對象，探索刺囊酸及其衍生物對腫瘤多藥耐藥的影響，并對其逆轉(zhuǎn)多藥耐藥機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究。

圖 1 刺囊酸(EA)及其衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

表1 刺囊酸及其衍生物的編號

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人乳腺癌細(xì)胞敏感株MCF-7、人肝癌敏感株HepG-2、105IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基、阿霉素購自Sigma Aldrich公司；10%小牛血清購自浙江天航生物科技股份有限公司；ELISA試劑盒購自R&D Systems公司。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀購自北京普天新橋技術(shù)有限公司，ELISA試劑盒購自上?？祈樕锟萍加邢薰尽?/p>

1.3 實驗方法

1.3.1 腫瘤細(xì)胞的耐藥實驗

腫瘤細(xì)胞敏感株MCF-7和HepG-2用含10%小牛血清+105IU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基在恒溫培養(yǎng)箱37 ℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)。相應(yīng)阿霉素耐藥株MCF-7/DOX、HepG-2/DOX連續(xù)培養(yǎng)在含1.0 mg/L的阿霉素的上述培養(yǎng)基，在恒溫培養(yǎng)箱37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)。

取對數(shù)生長期的敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞接種于96孔板，每孔內(nèi)180 μL，約5×103個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。敏感株和耐藥株分別以10倍稀釋的方法由高到低加入20 μL不同濃度的阿霉素(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L)作為實驗組，對照組只加等體積的培養(yǎng)基不加藥物。

采用常規(guī)MTT實驗方法，于全自動酶標(biāo)儀上測定各孔在490 nm處吸光度(A)值，取3孔平均值計算細(xì)胞生長率和抑制率：生長率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%；抑制率(%)=100%-生長率。使用SPSS19.0統(tǒng)計得出IC50。耐藥倍數(shù)=耐藥株IC50/ 敏感株IC50計算出耐藥細(xì)胞株耐藥倍數(shù)。

1.3.2 刺囊酸及其衍生物細(xì)胞毒測定

各平行3次取對數(shù)生長期的敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞接種于96孔板，每孔內(nèi)180 μL，約5×103個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。敏感株和耐藥株分別以10倍比稀釋的方法由高到低加入20 μL不同濃度的刺囊酸及其衍生物(10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol/L)，對照組只加等體積的培養(yǎng)基不加藥物。

采用常規(guī)MTT實驗方法，于全自動酶標(biāo)儀上測定各孔490 nm處吸光度(A)值，取3孔平均值計算細(xì)胞生長率和抑制率：生長率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%；抑制率(%)=100%-生長率。使用SPSS19.0統(tǒng)計得出IC50。

1.3.3 MDR逆轉(zhuǎn)實驗

各平行3次取對數(shù)生長期耐藥株HepG-2/DOX和MCF-7/DOX接種于96孔板，每孔內(nèi)180 μL，約5×103個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。再分別加入10 μL不同濃度的阿霉素(2×10-3、2×10-4、2×10-5、2×10-6、2×10-7mol/L)，最后按高、中、低3種劑量加入10 μL不同濃度的刺囊酸及衍生物(設(shè)3個濃度，最高濃度為相應(yīng)受試物IC50的1/10，細(xì)胞活力基本不受影響，此實驗設(shè)為2、0.5、0.1 μmol/L)，對照組只加等體積的培養(yǎng)基不加藥物。

采用常規(guī)MTT實驗方法，于全自動酶標(biāo)儀上測定各孔490 nm處吸光度(A)值，取3孔平均值計算細(xì)胞生長率和抑制率：生長率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%；抑制率(%)=100%-生長率。使用SPSS19.0統(tǒng)計得出IC50。MDR逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥株IC50/ 加入逆轉(zhuǎn)劑后IC50計算受試化合物對MDR的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。

1.3.4 測定P-gp的表達(dá)

采用ELISA法測定P-gp的水平。96孔板中的HepG-2/DOX細(xì)胞與濃度為2 μmol/L的受試物或空白培養(yǎng)基共培養(yǎng)24 h后，倒去培養(yǎng)基，加入0.1%Tween-20/PBS洗滌(50 μL/孔)30 s，敞開置于37 ℃環(huán)境中30 min，加入固定液(100 μL/孔)，5 min后加入0.1%Tween-20/PBS洗滌(200 μL/孔)20 min，PBS洗滌2次，加入1%的BSA-PBS(100 μL/孔)4 ℃靜置1 h，加入ddH2O稀釋的一抗(100 μL/孔)，4 ℃過夜，PBS連洗3次，加入用1%的BSA-PBS稀釋的二抗(100 μL/孔)，室溫3 h，PBS連洗5次，加入底物液(100 μL/孔)，10 min后1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，490 nm處讀數(shù)。采用相同方法，不加受試化合物，測定HepG-2細(xì)胞中P-gp的表達(dá)。

1.3.5 統(tǒng)計方法

2 實驗結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞耐藥倍數(shù)

單獨使用阿霉素(DOX)作用于敏感株和耐藥株的IC50有顯著差異(見表2),經(jīng)過計算得到耐藥細(xì)胞株耐藥倍數(shù)MCF-7/DOX為32.8，HepG-2/DOX為32.7。

表2 敏感株及耐藥株對阿霉素的耐藥測試結(jié)果

2.2 受試化合物的細(xì)胞毒作用

受試化合物對腫瘤細(xì)胞敏感株和耐藥株的細(xì)胞毒作用測試結(jié)果(見表3)。

表3 受試化合物對腫瘤細(xì)胞敏感株及耐藥株的

注：數(shù)據(jù)由SPSS19.0統(tǒng)計。

2.3 受試化合物的MDR逆轉(zhuǎn)倍數(shù)

受試化合物對MCF-7/DOX和HepG-2/DOX 2種耐藥株細(xì)胞均有劑量依賴性的增敏作用(見圖2)，其中TRSZ-5在2 μmol/L劑量下最大逆轉(zhuǎn)倍數(shù)對MCF-7/DOX達(dá)7.3，HepG-2/DOX為6.5。

A-F分別表示受試化合物EA、TRSZ-2、TRSZ-3、TRSZ-4、TRSZ-5、TRSZ-6逆轉(zhuǎn)MCF-7/DOX和HepG-2/DOX細(xì)胞對阿霉素(DOX)耐藥的結(jié)果。*表示與單用阿霉素相比P<0.05)。

2.4 P-gp的表達(dá)

ELISA法測定敏感株HepG-2、耐藥株HepG-2/DOX與受試化合物共培養(yǎng)后P-gp的表達(dá)，見圖3。結(jié)果表明，2 μmol/L劑量的EA及其衍生物顯著的降低了P-gp在HepG-2/DOX細(xì)胞中的表達(dá)(實驗指標(biāo)為490 nm處吸光度顯著降低)，其中化合物TRSZ-5的作用最明顯，這與逆轉(zhuǎn)耐藥實驗的結(jié)果是一致的。

圖 2 刺囊酸及刺囊酸衍生物逆轉(zhuǎn)MCF-7/DOX和HepG-2/DOX細(xì)胞對阿霉素(DOX)耐藥的結(jié)果

圖 3 EA及其衍生物對腫瘤細(xì)胞P-gp表達(dá)的影響

測定HepG-2敏感株中P-gp的表達(dá)使用HepG-2敏感株，其余采用HepG-2/DOX耐藥株進(jìn)行。

3 討論

阿霉素對腫瘤細(xì)胞MCF-7和HepG-2具有殺傷作用，由表2可知，與腫瘤細(xì)胞敏感株相比，耐藥株的IC50顯著增加，說明耐藥株細(xì)胞對阿霉素的殺傷有明顯抵抗作用，可以作為研究對象來研究刺囊酸及其衍生物的化療增敏作用。

由表3可知，受試化合物是有一定細(xì)胞毒性的，為了避免由于受試化合物的細(xì)胞毒作用對實驗結(jié)果造成干擾，實驗選用了高、中、低3種濃度的受試化合物，分別為2、0.5、0.1 μmol/L。由圖2可知，相比于低濃度，在高濃度和中濃度時，耐藥株的IC50明顯降低，即刺囊酸及其衍生物對耐藥株的化療增敏作用顯著增強(qiáng)。但是由于刺囊酸及其衍生物是有細(xì)胞毒性的，所以濃度較高時，受試化合物對耐藥株的細(xì)胞殺傷作用是不可忽略的；因此,在高濃度時阿霉素對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用及其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

受試化合物對MCF-7/DOX和HepG-2/DOX 2種耐藥株細(xì)胞均有劑量依賴性的增敏作用，其中化合物TRSZ-5效果尤其突出。分析其化學(xué)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，該化合物酯化了EA的羧基，且3-OH被羰基取代，這樣的結(jié)構(gòu)衍生明顯增加了化合物親脂性。親脂性強(qiáng)的化合物容易通過細(xì)胞膜，所以和其他受試化合物相比，親脂性強(qiáng)的TRSZ-5更易于跨膜轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮化療增敏作用。通過增加刺囊酸衍生物的親脂性來增強(qiáng)化療增敏作用可能是此后結(jié)構(gòu)修改的一個方向。

ELISA實驗結(jié)果表明，耐藥株的P-gp表達(dá)明顯升高，這說明細(xì)胞內(nèi)的化療藥物大量排出，產(chǎn)生耐藥。刺囊酸及刺囊酸衍生物能逆轉(zhuǎn)阿霉素耐藥從而產(chǎn)生化療增敏作用，同時此作用具有劑量依賴性。雖然ELISA實驗的數(shù)據(jù)提供了EA及其衍生物作為化療增敏劑的一種可能作用機(jī)制，即EA衍生物下調(diào)了耐藥細(xì)胞P-gp的表達(dá)，減少化療藥物外排，但引起耐藥的原因是多種多樣的，相關(guān)研究表明多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)[18]、肺耐藥蛋白(LRP)[19]、谷胱甘肽及谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶[20]、PKC和TopoII[21]等均與多藥耐藥有關(guān)[22]；因此探討EA及其衍生物與這些靶點的相互作用也是十分必要的，這也是以后研究的一個方向。

4 結(jié)論

本研究采用體外細(xì)胞研究的方法，考察了刺囊酸及其衍生物對MCF-7/DOX和HepG-2/DOX的影響。研究結(jié)果表明，受試化合物可通過降低耐藥細(xì)胞P-糖蛋白表達(dá)而使阿霉素效果提升，起到逆轉(zhuǎn)多藥耐藥、增加化療藥物敏感性的作用。