劉暢宇 陳勛 龍雨青 陳婭 劉湘丹，2 周日寶

（1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙 410208；2. 湖南省中藥飲片標(biāo)準(zhǔn)化及功能工程技術(shù)研究中心，長沙 410208）

花是植物六大器官之一，除作觀賞外，很多還具藥用價(jià)值和食用價(jià)值。其中，以花類藥材為例，《中藥大辭典》中，就有160多種花類植物可以入藥［1］，常用臨床花類中藥近50種。但因有些花類藥材如金銀花、山銀花、槐花、三七花等存在花期短、易凋謝或僅以花蕾或初開的花入藥等缺陷，易導(dǎo)致資源浪費(fèi)。研究如何獲得長花期、高品質(zhì)花卉植物對(duì)提高其觀賞價(jià)值、利用價(jià)值、調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，增加農(nóng)民收入有重要意義。

大量研究表明，植物激素乙烯在植物開花和衰老過程中起關(guān)鍵作用。近年來，國內(nèi)外圍繞乙烯在花發(fā)育和衰老過程中的動(dòng)態(tài)變化及其調(diào)節(jié)效應(yīng)進(jìn)行研究，取得較大進(jìn)展，其中很多關(guān)鍵基因被分離鑒定［2-4］。目前，在分子水平上，關(guān)于延長植物花期、調(diào)控花發(fā)育的研究主要集中于乙烯生物合成和乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑兩大方面，可有選擇地阻斷乙烯生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)某一環(huán)節(jié)來延遲花的衰老［5］。本文主要對(duì)近年來乙烯生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中介導(dǎo)花衰老進(jìn)程的相關(guān)基因克隆及調(diào)控相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 花衰老進(jìn)程中乙烯相關(guān)功能

開花是植物重要生理過程?；ㄋダ鲜茄芯恐参锼ダ霞捌湔{(diào)控過程的理想系統(tǒng)［6-8］，表現(xiàn)為花瓣萎蔫或脫落、花色改變、花徑變小等特征，涉及一系列生理代謝過程，是基因表達(dá)、蛋白質(zhì)合成及內(nèi)外因素綜合調(diào)控的結(jié)果［9］。內(nèi)源激素中，與花衰老相關(guān)的主要是乙烯（Ethylene）和脫落酸（ABA）［10-12］，因絕大多數(shù)雙子葉植物花瓣衰老對(duì)乙烯敏感［13］，且國內(nèi)外圍繞乙烯在花發(fā)育和衰老過程中相關(guān)機(jī)制已取得較多研究，故目前關(guān)于延緩切花衰老和調(diào)控花發(fā)育的研究主要集中于乙烯方面。

乙烯為結(jié)構(gòu)最簡單的小分子烯烴，以氣體形式存在于自然界，為調(diào)控植物生長發(fā)育、導(dǎo)致植物衰老的重要內(nèi)源激素，存在于植物整個(gè)生命周期，在種子萌發(fā)、植物開花、器官衰老與脫落、果實(shí)成熟、性別分化以及對(duì)生物脅迫和非生物脅迫等生理過程中均起重要作用，被譽(yù)為“果蔬成熟激素”［3，14］。一般來說，植物體內(nèi)乙烯含量很低，在未成熟組織中合成微少，僅在成熟衰老組織及受脅迫組織等特定階段或特定條件中大量產(chǎn)生。在高等植物中，乙烯生成主要分為2個(gè)系統(tǒng)［15］：系統(tǒng)Ⅰ乙烯具自抑制機(jī)制，調(diào)控植物正常生長、發(fā)育和應(yīng)對(duì)脅迫反應(yīng)等，僅少量乙烯生成；系統(tǒng)Ⅱ具自催化機(jī)制，用于躍變期乙烯大量生產(chǎn)，促花凋亡和果實(shí)成熟?；ㄋダ线^程與乙烯息息相關(guān)，乙烯在花中合成及轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與果實(shí)相同（圖1）［16］。因此，研究乙烯生物合成途徑和調(diào)節(jié)機(jī)理，對(duì)調(diào)控內(nèi)源乙烯、認(rèn)識(shí)植物成熟過程，調(diào)節(jié)花發(fā)育與衰老有重大意義。

圖1 高等植物乙烯合成和感應(yīng)相互作用圖解［16］

2 乙烯生物合成途徑及其花衰老相關(guān)基因研究

2.1 乙烯生物合成途徑

1964年，Lieberman等［17-18］首次提出并證實(shí)乙烯生物合成途徑中真正前體為蛋氨酸（即甲硫氨酸）；其后，Adams等［19］發(fā)現(xiàn)1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）為乙烯生物合成直接前體。目前，根據(jù)前人研究成果［11，20-22］，乙烯生物合成線性模型可歸納為：蛋氨酸/甲硫氨酸（Methionine，Met）→S-腺苷蛋氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）→ACC→乙烯（圖2）。此途徑中，主要包括3個(gè)酶反應(yīng)：（1）S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosy-L-methionine synthetase，SAMS）催化ATP的腺苷基團(tuán)與Met生成SAM；（2）1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase，ACS）催化SAM裂解為甲硫腺苷（5'-methylthioadenosine，MTA）和ACC；（3）1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase，ACO）催化前體ACC最終合成乙烯。其中，ACC為重要的中間產(chǎn)物，ACC合酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）為關(guān)鍵酶［4，23］。

圖2 植物乙烯合成通路示意圖

2.2 乙烯生物合成途徑中介導(dǎo)花衰老相關(guān)基因的研究

2.2.1 SAMS及其調(diào)控花衰老的研究 SAMS為重要代謝酶類，為多基因家族基因編碼蛋白，在植物中，

參與多種生理作用，在進(jìn)化上具高保守性［20］。研究發(fā)現(xiàn)，SAMS作為乙烯生物合成途徑中第1個(gè)酶，

其催化產(chǎn)物SAM為植物體內(nèi)乙烯前體，其含量在一定程度上影響ACC合成；但一般認(rèn)為SAMS在乙烯合成中不是限速酶。除乙烯合成，SAMS還充當(dāng)細(xì)胞甲基化供體，參與多胺、甜菜堿、麥根酸等多種生物合成過程，并與植物響應(yīng)逆境脅迫相關(guān)［24-26］。

在基因水平上，SAMS主要在動(dòng)物和微生物上開展研究，在植物中研究相對(duì)較遲，且花中相關(guān)報(bào)道極少。目前，除擬南芥［27-28］、水稻［29］等模式植物，已從香石竹［30］、玉簪花［20］、石蒜［31］、茶［32］、高山離子芥［33］等植物中克隆到SAMS基因。經(jīng)研究，Kim等［26］從白菜中分離出SAMS基因，構(gòu)建SAMS過表達(dá)和RNAi載體轉(zhuǎn)基因煙草，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RNAi植株中ACS表達(dá)下降，過表達(dá)植株中ACS表達(dá)水平小幅上升，表明SAMS在轉(zhuǎn)錄水平上一定程度地調(diào)控乙烯合成。催花研究中，劉建新等［14］從擎天鳳梨開花植株單克隆獲得擎天鳳梨SAMS基因，探究SAMS基因在開花期表達(dá)模式和乙烯釋放量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)所得SAMs1在不同組織中表達(dá)模式與乙烯釋放量明顯一致，推測(cè)其在乙烯生物合成、苞片呈色以及催花研究中發(fā)揮重要作用。此外，大麗花花瓣中DpSAMS表達(dá)量隨大麗花花瓣的開放與衰老，呈逐漸上升趨勢(shì)，且對(duì)外源乙烯敏感，推測(cè)DpSAMS為大麗花衰老相關(guān)［9］。綜上所述，SAMS與乙烯生物合成一定程度上相關(guān)，可能影響花發(fā)育衰老進(jìn)程。

在乙烯合成過程中，雖一般不認(rèn)為SAMS是限速酶，但SAMS在一定程度上也能影響乙烯生物合成途徑，繼而影響植物生長發(fā)育，深入研究SAMS基因?qū)φ{(diào)控花發(fā)育衰老有一定意義。

2.2.2 ACS及其調(diào)控花衰老的研究 ACS為多基因家族，其家族成員間蛋白和序列存在一定保守性和差異性，保守性主要表現(xiàn)于N端，差異性主要表現(xiàn)于C端，某些同源基因因差異較大致其生化特性和功能不同［34-35］；ACS是乙烯生物合成的重要限速酶，其酶活性是ACC和乙烯調(diào)控植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)，直接關(guān)系到植物體內(nèi)乙烯含量［35］，可通過在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平上調(diào)控ACS，從而影響乙烯含量延緩植株衰老。但一般情況下，ACS轉(zhuǎn)錄水平很低，其蛋白極不穩(wěn)定，導(dǎo)致胞質(zhì)中ACS蛋白濃度低，且ACS半衰期短、易水解，故該酶特性研究進(jìn)展較緩［36-37］。

目前，已從不同植物中分離得到ACS基因，并驗(yàn)證其與植物發(fā)育衰老密切相關(guān)。果實(shí)成熟研究中，研究者已對(duì)番茄［38-40］、西葫蘆［41］等植物的ACS基因進(jìn)行克隆，并利用基因工程手段在植株中導(dǎo)入ACS反義RNA或RNAi基因，從而使果實(shí)過熟遲滯，或通過提高果實(shí)中ACS基因表達(dá)量而促進(jìn)植株生長發(fā)育，以上研究證明ACS參與調(diào)控乙烯生成，作為乙烯生物合成關(guān)鍵酶調(diào)控植株發(fā)育和衰老。在花衰老研究中，Ma等［42］從月季花瓣中克隆得到3個(gè)ACS基因（RhACS1-RhACS3），發(fā)現(xiàn)ACS基因成員間表達(dá)存在時(shí)間上的接替過程，其中RhACS1和RhACS2主要在花朵衰老時(shí)表達(dá)，RhACS3在花朵開放期間表達(dá)，進(jìn)入衰老后減弱，表明RhACS1、RhACS2表達(dá)與衰老相伴，RhACS3與開放相關(guān)；對(duì)“云香”水仙中NtACS1進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)NtACS1在花瓣及副冠中表達(dá)隨花衰老均呈逐漸下降趨勢(shì)，且表達(dá)峰值都在花苞期，推測(cè)NtACS1可能在乙烯生物合成途徑系統(tǒng)1發(fā)揮作用，與“云香”水仙花發(fā)育初期乙烯生物合成有關(guān)［43-44］；研究者通過比較文心蘭中OnACS2的表達(dá)與乙烯釋放速率的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，文心蘭花朵各部位的乙烯釋放速率和OnACS2表達(dá)量都呈先上升再下降趨勢(shì)，且乙烯釋放速率上升出現(xiàn)在OnACS2表達(dá)上升時(shí)或之后，推測(cè)OnACS2的表達(dá)積累影響了花中乙稀釋放［45］。因此，以上研究均表明：ACS基因編碼的蛋白可能在乙烯生物合成途徑中發(fā)揮重要的催化作用，ACS基因的表達(dá)積累可能促使花中乙烯釋放，從而促使花開放或加速花衰老。

此外，ACS基因家族的表達(dá)不僅受到轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)，其翻譯水平的調(diào)節(jié)，尤其是ACS蛋白的磷酸化修飾和泛素化降解，對(duì)于植物乙烯生物合成也是至關(guān)重要的［46-47］。研究者可通過去磷酸化和ACS泛素化蛋白酶體降解等手段，降低ACS穩(wěn)定性和活性，繼而抑制植物體內(nèi)乙烯合成，近年來已陸續(xù)開展在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控ACS影響乙烯合成的相關(guān)研究［47-51］。但目前通過在翻譯水平上調(diào)控ACS來影響植株乙烯合成的研究主要在模式植物擬南芥等幼苗、根等部位進(jìn)行，對(duì)于植物花器官等研究尚少。

因此，可通過在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平上修飾和控制ACS基因，影響植物體內(nèi)乙烯生成，繼而調(diào)控植物發(fā)育衰老進(jìn)程。目前，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控ACS來延長花期已在不同植物上得到應(yīng)用，如利用基因工程調(diào)控 ACS 基因來延長蝴蝶蘭［52-53］、洋桔梗［54］、菠蘿花［55］等花卉壽命。研究者可進(jìn)一步將通過在翻譯水平上負(fù)調(diào)控ACS從而減少乙烯合成的研究推廣至花類植物。

2.2.3 ACO及其調(diào)控花衰老研究 ACO為多基因家族，表達(dá)具時(shí)空特異性，因其需抗壞血酸和氧氣為共底物，且需Fe2+和CO2為輔因子，故稱其ACC氧化酶［56］。在乙烯生物合成中，最初認(rèn)為僅ACS酶活性為控制合成的關(guān)鍵步驟，ACO僅作輔助。但研究表明，ACO活性也是控制乙烯合成的重要因素。ACO直接氧化ACC成乙烯，為乙烯生物合成最終反應(yīng)，但目前來說，對(duì)離體條件下ACO的研究進(jìn)展仍較為緩慢［57］。

近年來，已先后從月季［42］、芍藥［58］、香石竹［59］、文心蘭［60］等花卉植物中分離得到ACO基因全長或片段，并驗(yàn)證其與植物生長發(fā)育密切相關(guān)，調(diào)控植株衰老進(jìn)程。據(jù)研究，番茄基因組中已克隆得到6個(gè)ACO 基因（LeACO1-LeACO6）［61-62］，番茄中ACO各成員在果實(shí)發(fā)育與衰老中表達(dá)模式具顯著差異，除LeACO2在果實(shí)中沒有明顯的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物積累，其他ACO家族基因均在果實(shí)整個(gè)發(fā)育階段乙烯生物合成途徑中發(fā)揮一定作用，其中對(duì)LeACO1-LeACO3研究較多，ACO1、ACO3轉(zhuǎn)錄本在花、葉片及果實(shí)衰老過程中有所積累，ACO1在果實(shí)成熟衰老起主要作用，在花發(fā)育過程中，ACO1-ACO3轉(zhuǎn)錄水平均受到花期調(diào)控［63-64］。除果實(shí)，在花卉中也有類似報(bào)道，玉簪花HpACO隨花期變化表達(dá)逐漸增強(qiáng)，在盛花期達(dá)到最高，在衰花期有所下降，表明HpACO可能參與調(diào)控玉簪開花和衰老進(jìn)程［20］。對(duì)文心蘭進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，文心蘭花中各部位OnACO2表達(dá)水平與乙烯釋放速率均隨花衰老對(duì)應(yīng)急劇升高，且OnACO2表達(dá)量上升在乙烯釋放上升之前，推測(cè)OnACO2可能為文心蘭花衰老相關(guān)功能基因，其表達(dá)量升高可能為乙烯產(chǎn)生的前提條件［60］。孫申申等［44，65-66］以“云香”水仙花瓣為材料，分離得到NtACO1和NtACOY2，2個(gè)基因在花瓣和副冠中的表達(dá)量隨花發(fā)育和衰老均呈整體上升趨勢(shì)，分別構(gòu)建NtACO1和NtACOY2過表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草，與野生型相比，2種轉(zhuǎn)基因煙草營養(yǎng)生長期縮短，開花提前，花期縮短，表明NtACO1及NtACOY2均為乙烯生物合成的可能功能基因，參與調(diào)控“云香”水仙的花發(fā)育與衰老進(jìn)程。以上研究均證明ACO基因可參與調(diào)控乙烯生物合成，繼而影響植物花期。

開展ACO基因相關(guān)研究將有助于為調(diào)控乙烯生物合成從而獲得花期延長的優(yōu)良育種提供研究參考。目前，通過調(diào)控ACO基因?qū)崿F(xiàn)抗衰老轉(zhuǎn)基因植物育種已有一定研究基礎(chǔ)，調(diào)控ACO基因以獲得花期延長的石斛蘭［67］、石竹［68］、康乃馨［69］等轉(zhuǎn)基因花卉培育已有報(bào)道。

3 乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其花衰老相關(guān)基因的研究

3.1 乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

乙烯生物合成為乙烯作用的上游部分，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)則為下游，其研究起步較晚，進(jìn)展較快，乙烯的生物學(xué)效應(yīng)被認(rèn)為是通過乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑得以實(shí)現(xiàn)的［70-71］。目前，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在模式植物擬南芥中已建立相關(guān)線性模型，即乙烯→乙烯受體ETR家族→CTR家族→EIN2→EIN3/EIL→ERF→乙烯反應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)（圖3）。

圖3 乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

研究發(fā)現(xiàn)，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，上游的乙 烯 受 體（Ethylene receptor，ETR） 與 CTR1（Constitutive triple response 1）為負(fù)調(diào)控元件，而下游 EIN2（Ethylene insensitive 2）、EIN3/EIL（Ethylene insensitive 3/ EIN3-like）和乙烯響應(yīng)因子（Ethylene response factor，ERF）中ERF1則為乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控器［5］。

3.1.1 ETR ERSs等編碼的ETR在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上感知乙烯信號(hào)，是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的第一級(jí)元件，起負(fù)調(diào)控作用。在模式植物擬南芥中，共發(fā)現(xiàn)5個(gè)ETR蛋白，由一個(gè)多基因家族編碼，可分為ETR1亞族（ETR1、ERS1）和ETR2亞族（ETR2、ERS2和EIN4），其中ETR1對(duì)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)影響最大。乙烯敏感性與乙烯受體有關(guān)，主要表現(xiàn)在：當(dāng)受體增多，乙烯敏感性降低，與受體的負(fù)調(diào)控模式一致；其次，乙烯受體家族具非冗余性，每個(gè)受體在乙烯信號(hào)中除具普遍作用還具自身獨(dú)特的功能［72-73］。且研究表明，ETR基因任意一個(gè)發(fā)生功能獲得性突變均影響受體與乙烯的結(jié)合能力，而導(dǎo)致乙烯不敏感表型，進(jìn)一步證實(shí)乙烯受體對(duì)乙烯反應(yīng)起負(fù)調(diào)控作用［74-76］。此外，研究者發(fā)現(xiàn)，乙烯受體基因在調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)，還特別受銅離子和RTE1（Reversion to ethylene sensitivity 1）蛋白的影響。乙烯與受體結(jié)合需要亞銅離子（Cu+）作為輔助，銅轉(zhuǎn)運(yùn)體RAN1（Responsive to antagonist 1）蛋白被發(fā)現(xiàn)負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)銅離子并維持其濃度梯度，對(duì)維持乙烯受體正常構(gòu)象、活性及生物發(fā)生發(fā)揮重要作用［77］；而RTE1蛋白被認(rèn)為是ETR1受體功能的正調(diào)節(jié)因子，其專一性地與ETR1發(fā)生互作，通過ETR1的氨基端（殘基1-349）抑制乙烯信號(hào)傳遞［78-79］。

3.1.2 CTR1CTR1為乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中鑒定出的第一個(gè)基因，N端可與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的乙烯受體相結(jié)合，C端具類似哺乳動(dòng)物Raf的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的結(jié)構(gòu)［80-81］，體外磷酸化試驗(yàn)表明其具絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，活性特征與Raf1一定程度類似，是乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中心組分［5，81］。可與乙烯受體協(xié)同影響植物乙烯敏感性，當(dāng)缺乏乙烯時(shí)，乙烯受體處于激活狀態(tài)與CTR1結(jié)合，活性狀態(tài)下的CTR1能使EIN2磷酸化，磷酸化的EIN2蛋白停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，致乙烯信號(hào)傳遞中斷，協(xié)同抑制下游乙烯信號(hào)；反之，當(dāng)乙烯濃度高時(shí)，受體結(jié)合乙烯，失去活性，CTR1不能被激活，EIN2不磷酸化，其羧基端片段轉(zhuǎn)移入核，激活下游的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促乙烯信號(hào)向下傳遞［81-84］。除EIN2途徑，還有研究認(rèn)為CTR1可繞過EIN2而通過MAPK激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)直接影響EIN3，進(jìn)而調(diào)控乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑［71，85］。此外，CTR基因的表達(dá)可能不完全受內(nèi)源乙烯的調(diào)控，還受其他未知因子調(diào)控。

3.1.3 EIN2 EIN2為乙烯應(yīng)答途徑中關(guān)鍵正調(diào)控因子，與下游的EIN3/EILs協(xié)同正調(diào)控乙烯反應(yīng)，半衰期短，為定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的跨膜蛋白［81，86-87］。研究表明，EIN2可能充當(dāng)雙功能信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)器，N端負(fù)責(zé)接受上游乙烯信號(hào)，并參與乙烯的暗形態(tài)反應(yīng)；C端（EIN2-CEND）則負(fù)責(zé)激活下游乙烯將信號(hào)向下轉(zhuǎn)導(dǎo)［80，87-88］，且 EIN2-CEND 可被 F-box蛋白EIN2 Targting Protein 1/2（ETP1/2）識(shí)別，并經(jīng)由蛋白酶體依賴的泛素化降解途徑降解［81，86］。迄今為止，關(guān)于EIN2的生化功能及調(diào)控乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制仍不十分清楚，但已知EIN2是目前唯一的單基因功能缺失突變導(dǎo)致擬南芥乙烯完全不敏感的基因［88-89］，表明EIN2在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中占據(jù)核心地位；且近年來關(guān)于解析EIN2的生化功能方面已有突破性進(jìn)展，Li等［90］揭示EIN2是介導(dǎo)下游組分EBF1/2（EIN3-binding F-box protein 1/2）mRNA 3'UTR翻譯抑制的必要組分，其通過介導(dǎo)EBF1/2，從而調(diào)控乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制，并解析了一種涉及EIN2、EIN5及EBF1/2非編碼區(qū)共同組成的乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)新機(jī)制。除乙烯信號(hào)通路，其他信號(hào)途徑中也篩選到EIN2突變體，表明EIN2可能在其他信號(hào)途徑中也起作用，或?yàn)槎喾N信號(hào)途徑交叉點(diǎn)。

3.1.4 EIN3及EILsEIN3及5個(gè)EILs（EIL1-EIL5）為正調(diào)控因子，由植物特異的轉(zhuǎn)錄因子基因家族編碼［70］。其中EIL1與EIN3相似度最高，有研究發(fā)現(xiàn)，植株中EIN3或EIL1過表達(dá)則表現(xiàn)出組成型乙烯表型，EIN3或EIL1單基因功能缺失，突變體表現(xiàn)乙烯部分不敏感，EIN3/EIL1雙突變體表現(xiàn)出完全乙烯不敏感，因此，EIN3/EIL1在乙烯信號(hào)通路中發(fā)揮重要作用，EIN3家族成員間存在功能冗余，其他EILs成員（EIL2-EIL5）可能在特定組織或發(fā)育階段對(duì)乙烯反應(yīng)作用較?。?5，91-92］。EIN3/EILs可與 ERF等啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)含EIN3結(jié)合位點(diǎn)（EIN3-binding site，EBS），也稱初級(jí)乙烯應(yīng)答元件（Primary ethylene response element，PERE）上的特定DNA序列結(jié)合，繼而誘導(dǎo)ERF表達(dá)，進(jìn)行乙烯信號(hào)傳導(dǎo)［93］。除受EIN2調(diào)控，EIN3/EIL1蛋白的積累和穩(wěn)定性還受到其上游的F-box蛋白EBF1/EBF2泛素化降解，EBF1/EBF2通過介導(dǎo)EIN3等轉(zhuǎn)錄因子而間接對(duì)乙烯信號(hào)進(jìn)行負(fù)調(diào)控［94］。此外，EIN3/EIL1也是與其他信號(hào)通路進(jìn)行交叉對(duì)話的重要節(jié)點(diǎn)［89］。

3.1.5 ERF 乙烯反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（Ethylene-responsive element binding protein，ERF 也 稱 EREBP），為乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中最下游元件，屬AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族，具1個(gè)AP2/ERF結(jié)構(gòu)域［95］，為植物特有轉(zhuǎn)錄因子，在植物體內(nèi)分布廣泛，基因家族龐大，研究表明，每種植物有100種以上ERF轉(zhuǎn)錄因子，于植物生長發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及各種脅迫過程中起重要作用［95-98］。根據(jù)與不同順式作用元件的結(jié)合，ERF家族可分為2個(gè)主要亞家族：即ERF和CBF/DREB亞家族。ERF亞家族可結(jié)合GCC-box（序列AGCCGCC）調(diào)控植物抗病相關(guān)基因及其他信號(hào)途徑的基因表達(dá)；CBF/DREB亞家族可結(jié)合脫水響應(yīng)元件DRE盒（TACCGACAT）或CRT元件（A/GCCGAC）調(diào)控植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)性等［70，80，95-96］。近年來，關(guān)于 ERF 在調(diào)控植物發(fā)育代謝及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面相關(guān)研究已廣泛開展，但ERF類轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多，功能存在冗余，組學(xué)分析難以明確單個(gè)家族成員的具體功能［99］。盡管越來越多的研究表明，ERF蛋白在植物成熟過程中起重要作用，但ERF蛋白在植物成熟研究中相關(guān)乙烯生物合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制仍不完全清楚，信息尚少［100］，且其真正參與乙烯信號(hào)調(diào)控的可能較少。目前，已知ERF1為EIN3/EILs的直接作用目標(biāo)，其超表達(dá)突變體表現(xiàn)部分組成性乙烯反應(yīng)，為正轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子［93，101］。

3.2 乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中介導(dǎo)花衰老相關(guān)基因的研究

近年來，已廣泛開展乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因介導(dǎo)花發(fā)育與衰老進(jìn)程的相關(guān)研究，研究證明，乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因可影響花卉植物發(fā)育衰老進(jìn)程，以下列舉部分研究成果。研究發(fā)現(xiàn)，不同植物乙烯受體ETR基因家族成員在花發(fā)育與衰老過程中表達(dá)情況有所不同：臘梅乙烯受體基因CpETR-1-CpETR-3轉(zhuǎn)錄水平與臘梅花開放衰老進(jìn)程關(guān)聯(lián)緊密，經(jīng)qRTPCR，發(fā)現(xiàn)CpETR-1與CpETR-2表達(dá)量隨臘梅花期變迭有一致變化規(guī)律，CpETR-3的表達(dá)在花開放前期變化不明顯，但三者在衰老期增幅均達(dá)顯著水平，且三者表達(dá)均受乙烯作用抑制劑1-MCP和外源乙烯影響，表明乙烯受體基因參與調(diào)控蠟梅花朵開放衰老進(jìn)程［102］；田曉巖等［103］克隆了文心蘭乙烯受體基因OnERS1，結(jié)合切花衰老進(jìn)程乙烯釋放量和OnERS1時(shí)空特異性表達(dá)，推測(cè)OnERS1為花衰老功能基因，并負(fù)調(diào)控乙烯反應(yīng)。Chen等［104］克隆了文心蘭OgEIL1和OgEIL2，并進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果表明，OgEIL1和OgEIL2的表達(dá)均與乙烯相關(guān)，兩者均參與調(diào)控文心蘭花的衰老，OgEIL1的功能與擬南芥EIN3相同，并推測(cè)OgEIL1對(duì)外源乙烯更敏感，而OgEIL2對(duì)內(nèi)源乙烯敏感。ERF類轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控乙烯響應(yīng)前景也越來越受到關(guān)注，在觀賞植物方面，Liu等［105］對(duì)矮牽牛中13個(gè)ERF基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其第Ⅶ組ERF基因與花瓣和雌蕊乙烯產(chǎn)量增加有很強(qiáng)關(guān)聯(lián)，可能與矮牽?；ㄋダ舷嚓P(guān)。吳凡等從“洛陽紅”牡丹切花中分離3個(gè)ERF基因（PsERF1-PsERF3），并分別檢測(cè)其乙烯敏感型“洛陽紅”和乙烯不敏感型“雪映桃花”牡丹中不同花發(fā)育時(shí)期中表達(dá)情況，其中PsERF1在兩品種花瓣中表達(dá)量顯著高于其他花器官，其表達(dá)量在“洛陽紅”切花發(fā)育過程中逐漸增加，而在“雪映桃花”切花中逐漸降低，推測(cè)其為牡丹切花乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因，而PsERF2和PsERF3則可能同時(shí)參與多種信號(hào)途徑，其中，PsERF2可能參與乙烯與ABA信號(hào)途徑的互作［99］。此外，乙烯參與調(diào)控植物性別分化，當(dāng)內(nèi)源乙烯積累一定量便可持續(xù)調(diào)控雄花向雌花轉(zhuǎn)化，印度南瓜性別分化過程中，EIN3-like在乙烯生成過程中起關(guān)鍵正調(diào)控作用，促乙烯產(chǎn)生，而CpETR1、CTR-like、CpCTR1和CpCTR2在雄花中負(fù)調(diào)控乙烯信號(hào)傳導(dǎo)［106］。

通過研究發(fā)現(xiàn)，很多花對(duì)乙烯敏感，而不同植物乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組分在花發(fā)育及衰老過程中具不同轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)特性，可根據(jù)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)標(biāo)準(zhǔn)模式，通過調(diào)節(jié)乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因表達(dá)得到多條途徑延緩花衰老，并調(diào)控花對(duì)乙烯的敏感性。

4 乙烯生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中其他相關(guān)酶的研究

乙烯反應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜的植物生理學(xué)過程，與很多其他通路相互影響耦連，除乙烯標(biāo)準(zhǔn)路徑中關(guān)鍵酶，還有其他酶可通過影響乙烯上下游反應(yīng)從

而調(diào)控乙烯。有研究者發(fā)現(xiàn)：擬南芥中CIPKL可參與乙烯生物合成，AtCIPKL蛋白對(duì)ACC和乙烯利敏感性反應(yīng)具差異，AtCIPKL過表達(dá)植株乙烯含量明顯降低，推測(cè)AtCIPKL作為負(fù)調(diào)控參與乙烯生物合成中ACC轉(zhuǎn)化為乙烯過程，通過影響AtACO2活性從而改變乙烯的含量［107］；某些花發(fā)育相關(guān)基因也與植株的衰老有關(guān)，如Chen等［108-110］認(rèn)為FOREVER YOUNG FLOWER（FYF）可能抑制花器官衰老與脫落：其通過參與乙烯反應(yīng)，有效抑制乙烯反應(yīng)下游基因的表達(dá)，且研究表明，轉(zhuǎn)FYF的植株對(duì)乙烯不敏感，花衰老顯著延遲，通過研究擬南芥中FYF與乙烯響應(yīng)DNA結(jié)合因子（Ethylene response DNA-binding factors，EDFs）的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)EDF1/EDF2/EDF3/EDF4異位表達(dá)將激活衰老相關(guān)基因并促進(jìn)花衰老/脫落，而FYF通過激活一個(gè)ERF基因（FUF1），負(fù)調(diào)控乙烯響應(yīng)中下游基因EDF1/EDF2/EDF3/EDF4，從而調(diào)節(jié)花衰老/脫落；bHLH轉(zhuǎn)錄因子也可能影響乙烯反應(yīng)，Jing等［111］研究表明，bHLH轉(zhuǎn)錄因子基因PhFBH4在矮牽?；ㄋダ掀溟g顯著上調(diào)，通過調(diào)控乙烯生物合成途徑而影響植物生長發(fā)育，沉默或過表達(dá)矮牽牛中PhFBH4可降低或增加ACS1和ACO1的轉(zhuǎn)錄本豐度，從而影響乙烯產(chǎn)量，其中ACS1是PhFBH4蛋白的直接靶點(diǎn)。此外，還有ARGOS［112］、PIF3［113-114］、PIF5［115］等基因也可通過影響乙烯途徑相關(guān)酶從而作用于乙烯反應(yīng)。

5 小結(jié)與展望

近年來，國內(nèi)外對(duì)于乙烯生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的認(rèn)識(shí)已取得長足進(jìn)步，但對(duì)于信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)節(jié)機(jī)制以及整個(gè)乙烯反應(yīng)與植物其他信號(hào)途徑之間的交叉反應(yīng)還需更為深入的研究。此外，圍繞乙烯在開花和衰老相關(guān)研究雖已有一定基礎(chǔ)，但利用基因工程手段從根本上調(diào)控乙烯生成，獲得花期延長的轉(zhuǎn)基因植物還未大規(guī)模研究。目前，大多數(shù)仍處于乙烯反應(yīng)相關(guān)基因克隆階段。成功案例主要是某些應(yīng)用廣的觀賞花卉，對(duì)于可藥用及食用花類等研究尚少。

調(diào)控植物乙烯合成和傳導(dǎo)進(jìn)程對(duì)調(diào)控花開放和衰老進(jìn)程的快慢具有十分重要的研究意義，且利用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)延長花期是花類育種的有效手段。目前，在分子水平上，通過調(diào)控乙烯反應(yīng)從而獲得長花期植物主要有以下途徑：（1）采用分子生物學(xué)方法沉默或抑制乙烯生物合成有關(guān)酶基因的表達(dá)，減少合成乙烯的前體，降低花瓣對(duì)乙烯的敏感性，如導(dǎo)入SAM水解酶、導(dǎo)入反義或正義的ACS或ACO、導(dǎo)入ACC脫氨酶基因等。（2）通過基因工程阻斷乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，沉默或抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)功能基因或?qū)肫渫蛔兓虻?，從而改變植物組織對(duì)乙烯的響應(yīng)。

除一些觀賞切花，許多藥用及食用花類如金銀花、山銀花、三七花、黃花菜、槐花等也存在花期短，易凋謝，花蕾入用等缺陷。將調(diào)控乙烯反應(yīng)從而延緩花衰老的研究應(yīng)用于其他經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、應(yīng)用廣的藥用及食用花類等很有前景。對(duì)已報(bào)道的短花期藥材或作物，研究者們亦可利用生物手段，對(duì)目的植株乙烯生物合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因進(jìn)行克隆和遺傳操作，從基因水平上延緩衰老，獲得長花期、高品質(zhì)的優(yōu)良轉(zhuǎn)基因育種，從而提高其經(jīng)濟(jì)價(jià)值和利用價(jià)值，對(duì)增加農(nóng)民收入和調(diào)整產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)有重大意義。