徐敬昭 陳貝 杜秉海 趙東英 汪城墻 丁延芹

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，泰安 271018）

在土壤生態(tài)系統(tǒng)中，大部分細(xì)菌雖然存在而且有明顯的生物學(xué)活性，但難以被傳統(tǒng)的富營養(yǎng)培養(yǎng)基分離，不同的微生物學(xué)家使用很多術(shù)語來描述這些細(xì)菌，包括“寡營養(yǎng)細(xì)菌”［1］和“活的不可培養(yǎng)（Viable but non-culturable，VBNC）細(xì)菌”［2］等。寡營養(yǎng)細(xì)菌數(shù)量巨大、種類繁多、基因資源豐富，因此開發(fā)此類微生物已成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)?，F(xiàn)階段的研究策略主要分為兩大類：一方面不斷改進(jìn)現(xiàn)有的微生物培養(yǎng)技術(shù)；另一方面結(jié)合生物化學(xué)和分子生物學(xué)的原理建立與發(fā)展非培養(yǎng)方法，如磷酸脂肪酸（Phosphohpids fattyacid，PLFA）分析、Biology微孔板法及宏基因組測序等［3］。

雖然以組學(xué)為代表的非培養(yǎng)方法推動(dòng)了微生物資源的挖掘與利用，但這類方法也存在一些問題：首先，很難在細(xì)胞水平上對微生物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，無法深入了解微生物細(xì)胞的生命活動(dòng)規(guī)律；其次，很難科學(xué)地描述和驗(yàn)證微生物群落中不同種群之間的相互作用關(guān)系。因此，在利用非培養(yǎng)方法研究微生物多樣性的同時(shí)，有必要不斷優(yōu)化現(xiàn)有微生物培養(yǎng)技術(shù)，二者結(jié)合以幫助我們深入研究微生物生命活動(dòng)規(guī)律并探索其重要的生物學(xué)功能，在真正意義上實(shí)現(xiàn)微生物資源的開發(fā)與利用。

寡營養(yǎng)細(xì)菌難以分離的原因及應(yīng)對策略：（1）少數(shù)易培養(yǎng)微生物的競爭性干擾。根據(jù)MacArthur提出的 “R-K選擇”理論，易培養(yǎng)細(xì)菌是環(huán)境中的“R 選擇”者，能在短時(shí)間內(nèi)迅速倍增。而寡營養(yǎng)細(xì)菌作為環(huán)境中占多數(shù)的“K 選擇”者，能對有限資源進(jìn)行最有效地利用，保持極低的生長率，以適應(yīng)生境中的低營養(yǎng)條件。利用傳統(tǒng)的富營養(yǎng)培養(yǎng)基可對易培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行有效富集，然而其生長必然伴隨著營養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗以及有害代謝產(chǎn)物的積累，進(jìn)而抑制多數(shù)寡營養(yǎng)細(xì)菌的生長，使得最終分離的不一定是生境中密度最高或發(fā)揮主要功能的細(xì)菌。Button等［4］使用稀釋培養(yǎng)法，即當(dāng)把樣品中的微生物群體稀釋至痕量時(shí)，樣品中的“K 選擇”者可以不受“R 選擇”者的干擾，大大提高寡營養(yǎng)細(xì)菌被分離的可能性。（2）傳統(tǒng)培養(yǎng)基無法提供不同種類微生物生長所需的全部營養(yǎng)物質(zhì)。自然界中微生物種類豐富，不同種類的微生物生長代謝類型不同，對反應(yīng)的底物要求也存在差異。傳統(tǒng)培養(yǎng)基大大簡化了營養(yǎng)組成，無法提供不同微生物生長繁殖所必需的某些化學(xué)物質(zhì)。為彌補(bǔ)這一缺陷，通常將土壤浸出液添加到合成培養(yǎng)基中，但添加比例通常為1∶100-1 000［5-6］，這在很大程度上稀釋了其中所含生長因子的有效濃度。（3）傳統(tǒng)富營養(yǎng)培養(yǎng)基營養(yǎng)成分相對豐富或氧化環(huán)境的壓力。1 g土壤中通常含有106-109個(gè)微生物細(xì)胞［7］，分配到每一個(gè)微生物細(xì)胞，其可利用的營養(yǎng)物質(zhì)極度匱乏，多數(shù)處于“寡營養(yǎng)”狀態(tài)，傳統(tǒng)分離方法通常將微生物迅速置于富營養(yǎng)狀態(tài)，突然的營養(yǎng)變化凸顯了一些細(xì)菌固有的基因缺陷，甚至成為其生長的主要障礙。這其中就包括有毒物質(zhì)的形成，如半乳糖苷增多、氧代謝形成有毒產(chǎn)物或自由基積累過快不可逆轉(zhuǎn)的對部分細(xì)胞造成損傷。研究表明，丙酮酸鈉與過氧化氫酶能降解培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的毒性氧［8］，對恢復(fù)微生物可培養(yǎng)性具有良好效果。

植物根際往往存在一類被稱為植物根際促生菌［9］（Plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）的微生物，它們能通過固氮、溶磷、拮抗病原菌以及產(chǎn)生鐵載體、各類水解酶和植物激素等方式顯著促進(jìn)植物生長［10］。寡營養(yǎng)細(xì)菌難以被傳統(tǒng)的富營養(yǎng)培養(yǎng)基分離得到，不僅僅是由于營養(yǎng)水平的限制，而是上述因素的綜合效應(yīng)。因此，本研究基于稀釋培養(yǎng)法，直接使用土壤浸出液配制寡營養(yǎng)培養(yǎng)基，以更好地模擬土壤原生境的營養(yǎng)成分，同時(shí)輔以丙酮酸鈉和過氧化氫酶以降解毒性氧物質(zhì)，來分離寡營養(yǎng)細(xì)菌，并通過測定其產(chǎn)生鐵載體能力以及降解蛋白質(zhì)能力探索菌株在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

供試植株選用黃瓜（Cucumis sativusL.）于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室培育，于2017年2月播種，4月定植，常規(guī)栽培管理，植株長勢良好，至8月采集根際土壤樣品。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 （1）土壤浸出液：土壤 50.00 g，去離子水 1 L，pH 自然，混勻后用四層紗布粗濾，4℃，10 000 r/min離心1 min，取上清液于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)4類培養(yǎng)基配方詳見表1，具體配制過程如下：1、2號培養(yǎng)基滅菌前成分相同，即只含土壤浸出液，因此將1×105Pa滅菌的土壤浸出液與0.22 μm微孔濾膜過濾除菌的土壤浸出液等體積混合后，倒板；3號培養(yǎng)基滅菌前為使用土壤浸出液配制2% LB：胰蛋白胨 0.20 g，酵母提取物 0.10 g，NaCl 0.20 g，土壤浸出液 1 L，pH 自然，1×105Pa滅菌20 min，待培養(yǎng)基冷卻至50-60℃與0.22 μm微孔濾膜過濾除菌土壤浸出液等體積混合，倒板；4號培養(yǎng)基滅菌前為使用去離子水配制1% LB：胰蛋白胨 0.10 g，酵母提取物0.05 g，NaCl 0.10 g，去離子水 1 L，pH 自然，1×105Pa滅菌20 min，倒板。（3）2.27 mol/L丙酮酸鈉溶液：丙酮酸鈉 0.25 g，去離子水 1 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，吸取100 μL涂布于對應(yīng)培養(yǎng)基平板上，使涂布平板最終含有0.125%的丙酮酸鈉。（4）1×107U/L過氧化氫酶溶液：過氧化氫酶 2.00 g，0.05 mol/L磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液 1 L，pH 7.0，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，吸取200 μL涂布于對應(yīng)培養(yǎng)基平板上，使涂布平板最終含有2 000 U的過氧化氫酶。（5）CAS檢測培養(yǎng)基［11］。（6）干酪素培養(yǎng)基：干酪素 10.00 g，瓊脂15.00 g，去離子水 1 L，pH 7.4。（7）產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基：干酪素 10.00 g，去離子水 1 L，pH 7.4。上述（5）-（7）培養(yǎng)基1×105Pa滅菌20 min。

表1 培養(yǎng)基配方

1.2.2 土壤樣品采集 2017年11月9日從山東農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室（36°11'N，117°06'E）采集黃瓜的根際土壤樣品。經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)后選稀釋度10-6-10-7的土壤懸液各取100 μL涂布于寡營養(yǎng)培養(yǎng)基平板上，于37℃溫箱中培養(yǎng)。然后挑取不同形態(tài)的菌落，在平板上劃線分離單菌落并結(jié)合鏡檢至菌落形態(tài)單一為止，并對菌株進(jìn)行編號，分別保藏于4℃和-20℃冰箱備用。

1.2.3 菌株分離鑒定 菌落與細(xì)胞形態(tài)鑒定參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》［12］。部分生理生化鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［13］，通過Biology微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行生長實(shí)驗(yàn)與化學(xué)敏感實(shí)驗(yàn)。利用基因組快速抽提試劑盒（生工SK8255）提取基因組，提取方法參照配套說明書。采用細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物 27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和 1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）， 擴(kuò)增片段長度約為1 500 bp；gyrB基因引物XgyrB1F（5'-ACGAGTACAACCCGGACAA-3'） 和 XgyrB1R（5'-CCCATCARGGTGCTGAAGAT-3'），擴(kuò)增片段長度約為700 bp。對提取的菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用50 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：模板1 μL，引 物（F）1 μL， 引 物（R）1 μL，5×TransStart FastPfu Buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，TransStart FastPfu DNA Polymerase 1 μL， 加 超 純水補(bǔ)足到 50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性2 min；95℃變性20 s；55℃退火20 s；72℃延伸1 min（gyrB30 s），30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5 min，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物于4℃保存。對擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測?；蛐蛄杏缮虾Ｉ锕こ谭?wù)有限公司進(jìn)行測定，將所獲得序列利用BLAST比對分析，從NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫中挑選相似性序列并得到序列號信息，運(yùn)用MEGA7.0軟件生成N-J進(jìn)化樹，分析同源性關(guān)系較近的菌株。

1.2.4 菌株對植物促生功能的檢測 參照王君［14］的方法對菌株的蛋白酶和鐵載體產(chǎn)生能力進(jìn)行測定，蛋白酶活性測定參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》［15］。其中，試驗(yàn)所采用陰性對照為鏈狀副球菌（Paracoccus alkenifer），是本實(shí)驗(yàn)室保存的一株無蛋白酶與鐵載體產(chǎn)生能力的細(xì)菌。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果

2.1.1 分離菌株的形態(tài)觀察結(jié)果 培養(yǎng)7 d后，本研究所設(shè)計(jì)的4種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)分別為：1號培養(yǎng)基32個(gè)，2號培養(yǎng)基23個(gè)，3號培養(yǎng)基40個(gè)，4號培養(yǎng)基8個(gè)。根據(jù)菌落形態(tài)差異，從上述培養(yǎng)基上挑取菌落數(shù)較多、生長速度較慢得1類菌，用三區(qū)劃線法進(jìn)行純化，將其命名為S35。通過細(xì)胞形態(tài)觀察及革蘭氏染色進(jìn)行初步鑒定，S35為G-菌、無內(nèi)生孢子、短桿狀、菌落較小微凸呈黃色、表面光滑濕潤不透明（圖1）。

2.1.2 菌株S35生理生化鑒定結(jié)果 本研究共測定了菌株S35的77項(xiàng)生理生化特性（表2），其中脲酶陰性，氧化酶、鳥氨酸脫羧酶、賴氨酸脫羧酶、脂酶和精氨酸雙水解酶陽性，利用L-丙氨酸、L-組氨酸、L-乳酸及檸檬酸，能夠利用葡萄糖、麥芽糖和乳糖產(chǎn)酸，與模式株S. maltophilia的生理生化結(jié)果一致。

圖1 菌株S35革蘭氏染色

2.1.3 菌株S35基因序列分析結(jié)果 菌株S35經(jīng)PCR擴(kuò)增的16S rRNA基因片段大小為1 438 bp，在GenBank中進(jìn)行序列比對分析，與Stenotrophomonas maltophilia（登錄號：FJ906801.1）一致性為100%；gyrB基因片段大小為695 bp，與S. maltophilia（登錄號：EU499066.1）一致性為100%。使用MEGA 7.0軟件通過N-J法分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），S35菌株與嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌均處同一支，遺傳進(jìn)化距離最近。

其中，gyrB的基因序列為：GAATCATCATCAT GACCGACGCCGACGTCGACGGCGCCCACATCCGCA CCCTGCTGCTGACGTTCTTCTACCGTCAGATGCCGG AGCTGATCGAGCGCGGTTACGTCTACATCGGCCTG CCGCCGCTGTACAAGATCAAGCAGGGCAAGCAGGAGCTGTACCTGAAGGACGACCCGGCGCTGGACAGC TACCTGGCCAGCAGCGCAGTGGAAAACGCTGCACT GGTGCCGGCCACCGGCGAGCCCGGCATCGAAGGCC TTGCGCTGGAGAAGCTGCTGCTGGCCTACGCGGCC GCGCTGGATTCGATCGAGCGCAACGCACATCGCTAC GACCGCAACCTGCTTGAAGCGCTGGTCGATTTCGTA CCGATGGACCTGCTGCCGGTGAAGGCGAGGGCCTG GATGCACTGGCCAAGCGCCTCAACCAGGCCGCGCTT GCAGGAAGCCAACGACGAGCGCCCGGCCGCTGTGC TGGTGACCCGTCGCCACATGGGTGAACAGCACATCC AGGTGCTGCCGATGTCGGCCTTCGAAAGCGGCGAA CTGCGCGCAATCCACCAGGCATCGAAGCTGCTGCAC GGTCTGGTGCGACCATTTCCCGCGGTGCCAAGTCGA TCGAAGTCGACAGCTTTGCCAAGGCACAGAACTGG CTGCTCGAGGAGGCCAAGCGCGGCCGCCAGATCCA GCGATTCAAGG。

表2 菌株S35生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 菌株S35蛋白酶與鐵載體產(chǎn)生能力檢測結(jié)果

將菌株S35接種到干酪素檢測培養(yǎng)基和通用CAS檢測培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)72 h后菌株周圍均出現(xiàn)明顯水解圈和顯色圈，根據(jù)其直徑大小可以判定S35產(chǎn)蛋白酶和鐵載體的能力大小（圖3和表3），說明菌株S35具有產(chǎn)蛋白酶和鐵載體的能力。經(jīng)干酪素發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后菌株S35在40℃，pH 11的條件下測定的蛋白酶活力為36 U/mL。

圖2 基于16S rRNA（A）和gyrB（B）基因序列構(gòu)建菌株S35系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 菌株S35產(chǎn)蛋白酶與鐵載體檢測結(jié)果

表3 菌株S35產(chǎn)蛋白酶與鐵載體檢測結(jié)果

3 討論

一般認(rèn)為，自然環(huán)境中微生物數(shù)量龐大，其可利用的營養(yǎng)物質(zhì)極度匱乏，多數(shù)處于“寡營養(yǎng)”狀態(tài)，且一些微生物適宜生長在與自然環(huán)境相近的基質(zhì)中［16］。因此，采用低營養(yǎng)或輔以含少量生長因子的土壤浸出液制成的培養(yǎng)基會(huì)獲得較好的培養(yǎng)效果［17］。通過比較本研究所設(shè)計(jì)的4種培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，可以看出丙酮酸鈉、過氧化氫酶以及土壤浸出液的使用確實(shí)可增加寡營養(yǎng)培養(yǎng)基上可培養(yǎng)的菌落數(shù)，進(jìn)一步證實(shí)上述推論。當(dāng)然，我們應(yīng)充分重視自然生境中微生物的分布可能是隨營養(yǎng)漸變而呈現(xiàn)梯度分布，所以培養(yǎng)策略不應(yīng)是全營養(yǎng)或100%稀釋后的簡單選擇，后續(xù)研究應(yīng)使用不同營養(yǎng)梯度來深入分析營養(yǎng)濃度對菌株分離的影響。

研究表明［18-19］，使用常見細(xì)菌培養(yǎng)基很難分離得到的嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。本研究發(fā)現(xiàn)，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌在100% LB培養(yǎng)基上純培養(yǎng)時(shí)，生長速度快、菌落較大且飽滿，推測其在通常情況下不易分離得到的原因是在富營養(yǎng)培養(yǎng)基上受具有生長優(yōu)勢的細(xì)菌的干擾。因此，實(shí)驗(yàn)采用稀釋培養(yǎng)法同時(shí)配合低營養(yǎng)物質(zhì)濃度確實(shí)可以分離獲得在傳統(tǒng)富營養(yǎng)培養(yǎng)基上不易分離的細(xì)菌。其中，土壤浸出液的使用最大限度模擬土壤原生境，因此更加有利于植物根際環(huán)境中優(yōu)勢菌的生長。

本研究利用寡營養(yǎng)培養(yǎng)基從黃瓜根際土壤中分離得到S. maltophiliaS35。嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌是一種革蘭氏陰性桿菌，屬于黃單胞菌目黃單胞菌科。該菌于1958年首次分離發(fā)現(xiàn)，1993年有學(xué)者根據(jù)其無黃單胞菌素，無植物病原性，且能在37℃生長等特性提議將此菌命名為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌。2017年，Singh等［20］首次報(bào)道S. maltophiliaSBP-9具有ACC脫氨酶活性并在鹽脅迫下可賦予小麥全植株的耐受性，增強(qiáng)小麥對生物和非生物脅迫的抗性。因此，接下來我們將進(jìn)一步探索此菌在植物根際促生方面的應(yīng)用潛力。

4 結(jié)論

本研究利用土壤浸出液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，適當(dāng)添加能夠降低活性氧的成分來分離土壤中寡營養(yǎng)微生物是一類行之有效的方法。利用上述方法從黃瓜根際土壤分離得到嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，該菌株具有產(chǎn)蛋白酶和鐵載體的能力。