李維 張永紅 劉旋 張紅妮 鄧文靜 鐘玉潔 馬莉 張娜 楊拴盈

1西安交通大學第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科 710004；2西安交通大學第二附屬醫(yī)院病理科 710004

肺癌是嚴重危害人類健康的疾病,其發(fā)病受環(huán)境、基因等多因素影響,并且不易早期發(fā)現(xiàn),治療效果不佳。肺癌是我國近10年病死率最高的腫瘤[1],也是美國預測2018年病死率最高的腫瘤[2]。肺癌中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)達85%,近年來,靶向治療及免疫治療在NSCLC的應用,顯著延長部分患者的疾病緩解期,但治愈肺癌的目標仍任重而道遠,研究NSCLC發(fā)病機制尋找更有效的治療方法仍然是目前研究的重點。本課題前期通過肺腺癌線粒體蛋白質組學研究,篩選出一系列差異蛋白,其中補體成分1q亞單位結合蛋白(complement component 1q subcomponent binding protein,C1QBP)在肺腺癌組織細胞和正常肺組織細胞間的差異超過2倍。C1QBP在多種腫瘤中表達均升高[3],而其與NSCLC的相關研究少見報道。本研究將進一步檢測組織標本中C1QBP蛋白的表達,結合臨床特征進行分析,并對C1QBP進行生物信息學分析,為進一步探究其在NSCLC發(fā)生中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 組織來源 46例肺癌組織標本取自西安交通大學第二附屬醫(yī)院手術病例標本,其中24例同時收集癌旁＞5 cm 處正常肺組織標本,其中男30例,女16例;年齡(57.7±8.6)歲,年齡范圍為43～75歲,其中＜60歲25例,≥60歲21例;組織低分化23例,高分化23例;根據國際抗癌聯(lián)盟2017年第8版TNM 分期標準：Ⅰ期/Ⅱ期25例,Ⅲ期/Ⅳ期21例;24例無淋巴結轉移,22例有淋巴結轉移;腺癌26例,鱗癌20例。所有入選病例術前未經放、化療,無肝硬化、自身免疫病等合并癥,術后經病理確診為肺癌。組織標本經10%甲醛溶液固定,常規(guī)石蠟包埋、切片備用。本研究經西安交通大學第二附屬醫(yī)院倫理委員會批準(2019002)。

1.2 主要試劑 兔抗人C1QBP 多克隆抗體(英國Biorbyt公司),SP9001生物素-鏈霉卵白素免疫組織化學檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司),DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司),脫脂奶粉,其它實驗試劑均為國產分析純。

1.3 免疫組織化學染色 石蠟組織標本切成4μm切片,常規(guī)脫蠟和水化,加檸檬酸緩沖液后置于微波爐中進行抗原修復,3%H2O2孵育,正常山羊血清封閉抗體,滴加稀釋的一抗兔抗人多克隆抗體C1QBP(1∶200),4 ℃冰箱過夜,滴加二抗工作液孵育,辣根過氧化物酶標記鏈霉素卵白素孵育,DAB顯色,蘇木精溶液復染,脫水,晾干后中性樹膠封片。用已知陽性片作為陽性對照,PBS 代替一抗作為陰性對照。

由1位主治醫(yī)師和1位副主任醫(yī)師采取雙盲法進行免疫組織化學結果判斷[4],以細胞中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性,每例隨機觀察5個高倍鏡視野,每個視野大于200個細胞。采用半定量積分法判定結果,根據陽性細胞所占百分比(無細胞著色為0分;＜10%為1分;10%～50%為2分;＞50%為3分)和染色強度(未著色為0 分;淡黃色為1分;中度黃色為2分;棕黃色為3分)進行評分,將2種分值相乘：0分為“-”,1～4分為“+”,＞4分為“++”。定 義“-”為陰性表達,“+、++”為陽性表達。

1.4 生物信息學分析 采用NCBI數(shù)據庫查詢C1QBP(Q07021)蛋白質序列,在此基礎上,利用ExPASy中的ProtParam 在線工具進行理化性質分析。其中包括：氨基酸數(shù)量、蛋白相對分子質量、理論p I值,氨基酸組成、分子式、蛋白半衰期、穩(wěn)定性、親/疏水性等。利用SOPMA、PDBe對C1QBP的二級結構進行分析,利用TMpred和SMART 對跨膜結構和結構域進行預測,利用Prot Fun 2.2 Server進行蛋白質功能分析,采用STRING 數(shù)據庫預測C1QBP相互作用蛋白,并分析可能作用的信號通路。

1.5 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據應用SPSS 16.0軟件進行處理,采用Fisher確切概率法分別分析腺癌和正常組織,鱗癌和正常組織的組間差異。C1QBP陽性表達程度和患者年齡、性別、腫瘤分化程度、淋巴結轉移及腫瘤類型的關系采用Spearman系數(shù)進行比較分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學結果 在肺腺癌和鱗癌中C1QBP以棕黃色顆粒主要表達于胞漿,在高表達的組織中細胞核也有表達,而在正常肺組織中表達量很少(圖1～3)。在肺腺癌組織中表達陽性率為92.31%(24/26),而在正常肺組織中表達陽性率為37.50%(9/24)(P＜0.001),差異有統(tǒng)計學意義;在肺鱗癌組織中表達陽性率為95.00%(19/20),與正常肺組織比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.001),見表1。進一步采用Spearman相關系數(shù)來分析C1QBP 陽性表達的程度和患者年齡、性別、腫瘤分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移及腫瘤類型的關系(表2)。研究結果提示,C1QBP 陽性表達的程度和患者的年齡、性別、TNM 分期、淋巴結轉移及腫瘤類型均無關,和患者腫瘤細胞的分化程度有關。

圖1 補體成分1q亞單位結合蛋白在肺腺癌中的表達IHC ×400

圖2 補體成分1q亞單位結合蛋白在肺鱗癌中的表達IHC ×400

圖3 補體成分1q亞單位結合蛋白在癌旁正常肺組織的表達 IHC ×400

表1 C1QBP在非小細胞肺癌和正常肺組織中的表達(例)

表2 C1QBP表達的分級和患者臨床特點的關系(例)

2.2 生物信息分析結果 C1QBP 蛋白全序列由282 個氨基酸組成,蛋白相對分子質量為31 362.24,理論p I為4.74,其組成中含量相對較多的氨基酸包括：谷氨酸10.3%,亮氨酸11.0%,天冬氨酸7.1%,色氨酸7.1%,甘氨酸7.1%。分子式為：C1379H2169N375O440S10。哺乳動物網狀細胞體外研究估計半衰期為30 h。C1QBP的不穩(wěn)定系數(shù)為48.69,提示該蛋白是不穩(wěn)定的。而脂溶指數(shù)為79.86,其總的平均親水性系數(shù)(GRAVY)為-0.461。

UniProt KB在線查詢C1QBP(Q07021)的氨基酸序列見圖4,SOPMA 軟件對C1QBP 二級結構進行預測,主要包括無規(guī)則彎曲(47.87%)、α-螺旋(32.98%)、延 伸 鏈(15.25%)、β 轉 角(3.90%),見圖5、6。在PDBe 數(shù)據庫中查詢C1QBP的三級結構已知為：3RPX(圖7)。

圖4 補體成分1q亞單位結合蛋白的氨基酸序列

圖5 SOPMA 軟件對補體成分1q亞單位結合蛋白二級結構預測統(tǒng)計結果

圖6 SOPMA 軟件對補體成分1q亞單位結合蛋白二級結構預測分布圖

運行在線工具TMpred對C1QBP 蛋白的跨膜結構域進行預測,結果提示并未發(fā)現(xiàn)有顯著意義的跨膜結構域。運用在線工具SMART 發(fā)現(xiàn)C1QBP蛋白質在序列的86-279 位氨基酸之間存在MAM33結構域(圖8)。

圖7 PDBe數(shù)據庫中補體成分1q亞單位結合蛋白的三級結構

圖8 SMART 數(shù)據庫中的補體成分1q亞單位結合蛋白蛋白質的結構域

利用Prot Fun 2.2 Server對C1QBP 進行功能分析發(fā)現(xiàn),C1QBP 最有可能的功能分類依次是：信號轉導、應激反應、免疫反應、激素等(表3)。

表3 Prot Fun 2.2 Server中C1QBP功能初步分析結果

采用STRING 數(shù)據庫預測C1QBP相互作用蛋白。STRING 數(shù)據庫擴大了相互作用的預測范圍,該數(shù)據庫包含了直接(物理上)和間接(功能上)的各種相互作用關系,數(shù)據結果根據基因背景、高通量實驗、共表達和已知信息綜合所得,并對每一個相互作用關系進行評分,該數(shù)據庫目前涵蓋了來自1 133個物種的5 214 234種蛋白質的相互作用信息。STRING 數(shù)據庫預測C1QBP 評分最高的10種蛋白質依次為： 激肽原1(kininogen-1,KNG1)、血漿激肽釋放酶、凝血因子Ⅻ(coagulation factorⅫ,F12)、脯氨酰羧肽酶、凝血因子Ⅺ(coagulation factor Ⅺ,F11)、絲氨酸蛋白酶抑制劑家族G1、富含絲氨酸/精氨酸剪接因子1、糖蛋白9、α-2-巨球蛋白、血小板膜糖蛋白(圖9)。

圖9 STRING 數(shù)據庫中C1QBP相互作用蛋白預測結果

3 討論

C1QBP又稱人透明質酸結合蛋白、P32 或gC1q R,為酸性蛋白,主要定位于線粒體,也可存在于細胞膜、細胞核、內質網和高爾基體等其他部位[5]。編碼C1QBP 旳基因位于人染色體17p12-13[6],包括6 個外顯子和5 個內含子。蛋白質的一、二及三級結構是它的功能的基礎,最終形成的成熟的C1QBP蛋白具有特殊的晶體結構：3個單體分子形成1個中空圓環(huán)型的三聚體,并有1個三重對稱軸,這種結構大大提高了其與配體的結合能力[7]。在線工具SMART 發(fā)現(xiàn)的C1QBP 結構域MAM33,是結合C1Q 球型頭部結構的關鍵,和線粒體氧化磷酸化及細胞核與線粒體的相互作用有關,在C1QBP的功能中有重要作用[8]。

ProtFun 2.2 Server分析結果表明C1QBP 最有可能的功能分類依次是：信號轉導、應激反應、免疫反應等。生物信息學分析C1QBP缺乏跨膜結構,并且是不穩(wěn)定蛋白,因此,其只有通過與其他跨膜蛋白相互作用來傳導細胞內信號。C1QBP 脂溶指數(shù)達79.86,親水性系數(shù)為負值,既有親水部分,又有疏水部分,為和其他蛋白的結合奠定了結構基礎。C1QBP通過L1CAM 影響腫瘤細胞的黏附和轉移,并通過調節(jié)GSK3/β-Catenin/L1CAM信號通路調節(jié)腎癌細胞的轉移[9];鋅指蛋白32是氧化劑刺激后細胞存活的關鍵,C1QBP 是鋅指蛋白32的直接靶基因,兩者結合使p38MAPK 途徑失活,從而發(fā)揮鋅指蛋白32對氧化應激誘導的細胞凋亡的保護作用[10]。C1QBP 還可與C1Q 結合可以調節(jié)多種免疫應答[11],抑制淋巴細胞的增殖,影響成纖維細胞和內皮細胞的黏附等。C1QBP 與SF2/ASF/SRSF1結合,激活m TOR C1信號通路引起細胞增殖[12]。因此,C1QBP是一種多功能伴侶蛋白,有多種不同的生物功能[13]。

本實驗采用免疫組織化學法檢測NSCLC 和正常肺組織C1QBP的表達,發(fā)現(xiàn)肺腺癌和鱗癌組織中C1QBP的表達明顯高于正常肺組織,并且表達陽性的程度和腫瘤組織分化程度呈正相關,但未發(fā)現(xiàn)和肺癌的TNM 分期和淋巴結轉移有關。查閱文獻,C1QBP 在乳腺癌[14]、卵巢癌[15]、子宮內膜癌[16]、胃癌[17]、肝癌[18]、結腸癌[19]和宮頸癌[20]等多種腫瘤組織中表達增多。在乳腺癌中,C1QBP的m RNA 和蛋白水平在乳腺癌組織中的表達與正常組織相比明顯升高[21],并和乳腺癌患者的TNM 分期、淋巴結轉移及腫瘤的復發(fā)相關,C1QBP 高表達是乳腺癌的不利預后因素[22-23],C1QBP可能是診斷乳腺癌的分子標志物。在卵巢癌組織中,C1QBP 蛋白水平與淋巴結轉移相關[15]。在子宮內膜癌組織中,C1QBP 的表達與子宮內膜癌的惡性程度、腫瘤的復發(fā)、轉移以及不良預后相關[16],C1QBP可能是子宮內膜癌的獨立預后因素。雖然本研究未發(fā)現(xiàn)C1QBP表達的強弱和肺癌的淋巴結轉移及TNM 分期有關,但是實驗結果C1QBP在肺腺癌和鱗癌中表達升高是肯定的,因此,C1QBP和肺癌的發(fā)生很可能有關,有望成為NSCLC新的診斷標志物和治療靶點。

STRING 數(shù)據庫預測的C1QBP相關蛋白中得分最高的是KNG1,KNG1是高相對分子質量激肽原、低相對分子質量激肽原和緩激肽的前體,C1QBP可以招募C1Q 和高相對分子質量激肽原形成強大的血管生成因素,促進腫瘤新生血管的形成,促進腫瘤生長和轉移[24]。腫瘤細胞在增殖中C1QBP增多,C1QBP會通過中和補體來防止宿主介導的細胞損傷,使腫瘤細胞逃脫機體的免疫系統(tǒng),增加存活的機會。C1QBP 還能夠激活補體和激肽釋放酶系統(tǒng)來形成有效的血管活性肽,包括緩激肽,從而增加血管的滲漏,促進腫瘤細胞的逃逸,促進腫瘤的轉移和血管生成[25]。由此可見,C1QBP在腫瘤細胞的免疫逃逸、血管生成和轉移中均有重要作用,以C1QBP為治療靶點,可以起到廣泛的抗腫瘤作用[13]。

STRING 數(shù)據庫 預 測 的C1QBP 相 關 的10 個蛋白中有7 個蛋白(KNG1、血漿激肽釋放酶、F12、F11、絲氨酸蛋白酶抑制劑家族G1、糖蛋白9、血小板膜糖蛋白)均和凝血有關。現(xiàn)有研究表明,凝血酶與其凝血酶受體1 結合經p44/42 MAPK 信號通路途徑可提高血管內皮生長因子m RNA 的穩(wěn)定性,增強VEGF 合成及釋放,為腫瘤的生長、轉移提供血供;同時通過降低內皮細胞與膜基底蛋白的連接能力,促進細胞外基質降解,利于腫瘤細胞遷移[26]。F12和F11這2個凝血因子均在凝血過程中和凝血酶有重要聯(lián)系,F12 和F11也是和C1QBP有重要聯(lián)系的蛋白,由此推測,C1QBP也可能通過p44/42 MAPK 這一信號通路引起肺腺癌的發(fā)生及轉移,這是我們下一步研究的重要方向。

綜上所述,本實驗通過免疫組織化學檢測發(fā)現(xiàn)了C1QBP在NSCLC 中的表達明顯升高,生物信息學方法進一步驗證了C1QBP 和腫瘤的相關性,并推測了可能的作用機制。因此,C1QBP 很可能成為NSCLC新的診斷標志物和治療靶點,但其確切的診斷及治療價值和作用機制,仍需進一步的深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突