郭 軍，李家前，2，李豪圣，王燦國(guó)，劉愛(ài)峰，程敦公，曹新有，劉建軍，趙振東，宋健民

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/小麥玉米國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室&農(nóng)業(yè)部黃淮北部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100；2.魯東大學(xué)，山東煙臺(tái) 264025)

小麥?zhǔn)俏覈?guó)的重要糧食作物之一。隨著我國(guó)人口數(shù)量不斷增加，小麥需求將持續(xù)增長(zhǎng)。據(jù)預(yù)測(cè)，2020年我國(guó)小麥需求量將達(dá)到1.4億～1.5億噸，小麥產(chǎn)量須在現(xiàn)有基礎(chǔ)上每年遞增1.4%，才能保障國(guó)家糧食安全[1]。此外，白粉病是小麥最重要的葉部病害之一，可造成小麥產(chǎn)量損失5%～40%[2-3]，位列植物真菌十大病害第六位[4]。因此，培育抗白粉病小麥品種對(duì)于保障糧食安全具有重要意義。

高大山羊草(Aegilopslongissima，2n = 14，SlSl)是小麥的近緣植物，含有抗旱、優(yōu)質(zhì)、抗白粉病等優(yōu)異基因，是小麥遺傳改良的重要基因源[5]。研究人員從高大山羊草中鑒定出一個(gè)新的小麥抗白粉基因，位于高大山羊草3Sl染色體短臂上，并命名為抗白粉病基因Pm13[6]，它是一個(gè)廣譜抗性基因，能夠有效抵抗小麥白粉病菌侵害[7-8]?；诟叽笊窖虿?Sl染色體與小麥3A、3B和3D染色體同源，利用ph1b介導(dǎo)的部分同源重組，創(chuàng)制了小麥-高大山羊草Pm13短片段易位系R1A、R1B、R4A、R5A、R6A、R2A、R2B和R1D。RFLP分析結(jié)果表明，易位系R1A、R1B、R4A、R5A、R6A為3B-3Sl易位，其他易位系為3D-3Sl易位[9-10]。根據(jù)高大山羊草特異RFLP標(biāo)記，開發(fā)了與Pm13緊密連鎖的SCAR分子標(biāo)記，并利用這些分子標(biāo)記對(duì)3B-3Sl和3D-3Sl易位系分析發(fā)現(xiàn)，在5個(gè)3B-3Sl易位系中，R1B中外源染色體片段最小，R6A中外源染色體片段最大；在3個(gè)3D-3Sl易位系中，R2B中外源染色體片段最小，R2A中外源染色體片段最大。根據(jù)分子標(biāo)記在染色體的遺傳位置，探明R1B中外源染色體片段最小[11]。

外源優(yōu)異基因?qū)胄←満?，往往伴隨不利的影響，如長(zhǎng)穗偃麥草抗葉銹病基因Lr19與高黃色素含量基因連鎖[35]。Pm13導(dǎo)入小麥?zhǔn)欠駥?duì)小麥農(nóng)藝、產(chǎn)量等性狀有不利影響，目前并未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究擬利用創(chuàng)制的RIL群體，分析高大山羊草染色體片段對(duì)小麥農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 植物材料

高抗白粉病小麥材料R1B及高感白粉病小麥品種濟(jì)麥22均系本實(shí)驗(yàn)室保存。以抗白粉病小麥R1B為父本，以高感白粉病小麥品種濟(jì)麥22為母本，配制雜交組合。其雜種F1自交得到F2，F(xiàn)2單株連續(xù)自交3次，構(gòu)建RIL群體，其包括69個(gè)F2∶5家系，對(duì)F2∶5家系進(jìn)行抗病性鑒定，高感普通小麥品系山農(nóng)7064作為感病對(duì)照材料。R1B為Pm13的載體品種[11]。

1.2 成株期白粉病抗性鑒定

將R1B、濟(jì)麥22以及RIL群體于2017年10月種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所試驗(yàn)基地，每個(gè)材料種植2行，每行30粒，行長(zhǎng)1.5 m，行距33 cm，每20行種植感病親本濟(jì)麥22和感病對(duì)照山農(nóng)7064，田間自然誘發(fā)發(fā)病。發(fā)病前20 d(4月上旬)灌溉1次，以確保田間濕度。待感病親本濟(jì)麥22和感病對(duì)照山農(nóng)7064完全發(fā)病后，于小麥灌漿期，每行隨機(jī)選擇10株調(diào)查白粉病抗性?？共⌒哉{(diào)查參照文獻(xiàn)[12]，記載反應(yīng)型：0級(jí)為免疫，1級(jí)為高抗，2級(jí)為中抗，3為中感，4級(jí)為高感。根據(jù)反應(yīng)型，對(duì)RIL群體各株系進(jìn)行分類，分為抗病株系(反應(yīng)型0～2)和感病株系(反應(yīng)型3～4)。

1.3 分子標(biāo)記檢測(cè)

于小麥三葉期，取幼嫩葉片,利用CTAB法提取基因組DNA,具體方法參考文獻(xiàn)[13]。利用與抗白粉病基因Pm13緊密連鎖的分子標(biāo)記Xutv14(F:CGCCAGCCAATTATCTCCATGA;R:AGCCATGCGCGGTGTCATGTGAA)對(duì)上述RIL群體及其親本進(jìn)行基因型分析,PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系體積為15.0 μL,包括10 × Buffer 緩沖液1.5 μL、2.5 mM dNTP 溶液1.2 μL、Taq 酶0.15 μL、滅菌雙蒸水8.15 μL、50 ng DNA 模板2.0 μL及前引物和后引物 各1.0 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min;35 個(gè)循環(huán)(94 ℃變性50 s,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min);72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,EB染色,Bio-Rad凝膠成像儀成像。

1.4 農(nóng)藝性狀調(diào)查

于小麥開花期和灌漿期，參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《農(nóng)作物品種區(qū)域試驗(yàn)技術(shù)規(guī)程-小麥》對(duì)抽穗期、開花期、株高、穗長(zhǎng)、穗粒數(shù)等性狀進(jìn)行調(diào)查分析，每個(gè)材料調(diào)查30穗。收獲后，利用萬(wàn)深SC-G自動(dòng)種子考種及千粒重分析儀對(duì)RIL群體進(jìn)行分析，獲取千粒重、粒長(zhǎng)、粒寬、粒周長(zhǎng)等參數(shù)，每個(gè)材料至少分析500粒。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)基因型和表型鑒定結(jié)果，將RIL群體分為2類：抗白粉病組(R組)和感白粉病組(S組)。利用Microsoft Excel 2003 對(duì)兩類材料間抽穗期、開花期、千粒重等12個(gè)農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀進(jìn)行T檢驗(yàn)分析；利用ImageGP軟件(http://www.ehbio.com/ImageGP/)繪制小提琴圖、抖動(dòng)圖和箱型圖，利用Photoshop CS 4.0對(duì)圖片進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗白粉病鑒定與分子標(biāo)記分析

2.2 高大山羊草染色體片段對(duì)小麥農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀的影響

T檢驗(yàn)結(jié)果(表1和圖3)表明，RIL群體中，抗白粉病株系和感白粉病株系間株高、抽穗期、開花期、穗粒數(shù)、粒長(zhǎng)、粒寬、粒周長(zhǎng)、穗長(zhǎng)、每穗可育小穗數(shù)、每穗不育小穗數(shù)、千粒重和粒長(zhǎng)寬比差異均不顯著(P>0.05)。這說(shuō)明高大山羊草染色體片段對(duì)小麥農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀無(wú)明顯不利影響。

A：R1B；B：濟(jì)麥22；C～F：4個(gè)抗病RIL株系，分別為JMP001、JMP003、JMP005和JMP007；G～J：4個(gè)感病RIL株系，分別為JMP002、JMP009、JMP022、JMP027。

1：R1B；2：濟(jì)麥22；3～6：4個(gè)抗病RIL株系；7～10：4個(gè)感病RIL株系。

3 討 論

表1 調(diào)查的12個(gè)農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀Table 1 Agronomic and yield-related traits investigated in this study

圖3 調(diào)查的12個(gè)性狀在R組和S組中的波動(dòng)范圍

外源染色體導(dǎo)入普通小麥后，一方面引入了抗病、抗逆、優(yōu)質(zhì)等優(yōu)異基因，另一方面也將一些不利性狀帶入。長(zhǎng)穗偃麥草抗葉銹病基因Lr19抗性強(qiáng)，在小麥抗病育種顯示出巨大的應(yīng)用潛力，但是其與高黃色素基因連鎖，限制了其在小麥遺傳改良中的應(yīng)用[25-26]。黑麥1RS染色體導(dǎo)入普通小麥品種后，提高了抗病性、穗粒數(shù)、穗重，同時(shí)將降低小麥品質(zhì)的黑麥堿引入[27-31]。因此，在小麥遠(yuǎn)緣種基因的利用過(guò)程中，在創(chuàng)制小麥-近緣植物染色體短片段易位系的同時(shí)，也要開展外源染色體片段對(duì)小麥農(nóng)藝、產(chǎn)量和品質(zhì)性狀的影響研究[32-34]。本研究利用RIL群體分析了高大山羊草Pm13染色體片段對(duì)小麥抽穗期、千粒重等農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀的影響，結(jié)果表明，抗白粉病組(R組)和感白粉病組(S組)間，所有調(diào)查的12個(gè)性狀均無(wú)顯著差異(T檢驗(yàn))，說(shuō)明Pm13對(duì)抽穗期、開花期、千粒重等農(nóng)藝和產(chǎn)量性狀沒(méi)有明顯不利影響。因此，在今后小麥抗病遺傳改良中，應(yīng)配制更多含有該基因的雜交組合，培育抗白粉病品種，發(fā)揮其在小麥生產(chǎn)上的利用價(jià)值。