李佳明，裴紅運(yùn)，趙文婧，高玉花，張向陽(yáng)*

1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，272067；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，272067

茶葉是我國(guó)的國(guó)飲，含有咖啡堿、多酚類(lèi)化合物、維生素類(lèi)、氨基酸類(lèi)等，因具有降血脂、減肥、預(yù)防心血管疾病、抗輻射、抗氧化、延緩衰老、助消化等作用，而被譽(yù)為健康的自然護(hù)衛(wèi)者[1]。古小玲[2]、邱賀媛等[3]曾開(kāi)展過(guò)茶葉中亞硝酸鹽檢測(cè)研究，但目前我國(guó)尚未制訂茶葉中亞硝酸鹽含量的限量標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于茶葉中亞硝酸鹽含量的測(cè)定研究鮮有報(bào)道，因此筆者對(duì)不同種類(lèi)發(fā)酵茶中亞硝酸鹽含量進(jìn)行了測(cè)定，并建立了一套快速的測(cè)定方法，以供行業(yè)相關(guān)人員參考。

一、材料與方法

1.試劑與儀器

（1）實(shí)驗(yàn)材料

市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)的半發(fā)酵茶（鐵觀(guān)音、大紅袍），全發(fā)酵茶（正山小種、金駿眉），后發(fā)酵茶（湖南安化黑茶、云南普洱茶）。

（2）實(shí)驗(yàn)儀器

754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、電子天平FA2104N（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、高速粉碎機(jī)、硅膠干燥器、KQ5200DV 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、雙列八孔電熱恒溫水浴鍋、UPD-IV-10T（純水型）優(yōu)普系列超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）、常用實(shí)驗(yàn)玻璃儀器。

（3）實(shí)驗(yàn)試劑

所用試劑均為分析純（亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、硼酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸、二鹽酸-1-萘乙二胺、亞硝酸鈉、濃鹽酸、冰醋酸、濃硫酸、堿式乙酸鉛），所用水為超純水（自制）。

2.超聲萃取-重氮偶合光度法

（1）樣品預(yù)處理

取上述市購(gòu)的6 種茶葉烘干至恒重，分別用高速粉碎機(jī)粉碎混勻后裝于密封袋中備用，依次編號(hào)為樣品1～6。

（2）樣品中亞硝酸鹽的提取

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取3.0 g（精度為0.0001 g）經(jīng)高速粉碎機(jī)粉碎混勻的茶葉樣品，分置于6 個(gè)250 mL 錐形瓶中，再分別加入70℃熱水[2]約150 mL，量取5 mL飽和硼酸鈉溶液（后發(fā)酵茶量取7.5 mL）加入錐形瓶中，攪拌混勻。將上述6個(gè)錐形瓶放入數(shù)控超聲波清洗器中超聲萃取10 min[4]（40 kHz，40 W）。

（3）超聲萃取液的凈化

在6 種萃取液中分別加入2.5 mL 亞鐵氰化鉀溶液（后發(fā)酵茶量取3.75 mL），搖勻；再分別加入2.5 mL 乙酸鋅溶液（后發(fā)酵茶量取3.75 mL），搖勻。冷卻至室溫的6 種萃取液分別轉(zhuǎn)移到6 個(gè)250 mL 容量瓶中，加水至刻度，搖勻，放置30 min。分別用濾紙干過(guò)濾，棄去初濾液15 mL，濾液備用。

（4）濾液的脫色

取50 mL 經(jīng)凈化處理后的濾液于100 mL 容量瓶中，加1 mL 飽和堿式乙酸鉛溶液，加水定容，搖勻，過(guò)濾，棄去初濾液數(shù)滴，在上述濾液中取50 mL 于100 mL 容量瓶中，加0.05 mL 硫酸溶液（4.5 mol/L），加水定容，搖勻，過(guò)濾，棄去初濾液數(shù)滴，濾液為提取液備用。

（5）亞硝酸鹽含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：準(zhǔn)確吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液（1 μg/mL），分別置于6 支具塞比色管中，并編號(hào)為標(biāo)1～標(biāo)6。在每支比色管中分別加入0.4 mL 對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g/L），混勻，靜置5 min，然后加入0.2 mL二鹽酸-1-萘乙二胺溶液（2 g/L），定容至10 mL，搖勻，靜置15 min，用分光光度計(jì)于540 nm 處測(cè)定各溶液的吸光度[5]。以亞硝酸鹽濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

不同發(fā)酵茶提取液中亞硝酸鹽含量測(cè)定：準(zhǔn)確吸取上述6 種脫色液8.0 mL 于6 支具塞比色管中，分別標(biāo)記為樣1～樣6。于6 支具塞比色管中分別加入0.4 mL 對(duì)氨基苯磺酸溶液（4 g/L），混勻，靜置5 min；然后分別加入0.2 mL 二鹽酸-1-萘乙二胺溶液（2 g/L），6支具塞比色管均加水定容至10 mL，混勻，靜置15 min。用1 cm 比色皿，以“標(biāo)1”為調(diào)零管，將樣品管1～6 于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，讀取數(shù)據(jù)記錄。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出樣品管中亞硝酸鹽的濃度，并按下式計(jì)算樣品中亞硝酸鹽的含量。

式中： X 為樣品中亞硝酸鹽的含量（mg/kg）；A1為樣液中亞硝酸鹽的質(zhì)量（μg）；m為樣品的質(zhì)量（g）；V1為測(cè)定用樣液體積（mL）；V0為樣品處理液總體積（mL）。

3.水浴提取-重氮偶合光度法

在上述實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的同時(shí)，按照國(guó)標(biāo)方法——水浴提取-重氮偶合光度法，測(cè)定不同發(fā)酵茶中亞硝酸鹽含量[6]。

二、結(jié)果與分析

1.亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)亞硝酸鹽溶液各管的吸光度依次為0、0.022、0.042、0.062、0.082、0.099，以亞硝酸鹽濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1）。

圖1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，在0～0.1 μg/mL 范圍內(nèi)亞硝酸鹽質(zhì)量濃度與吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程為Y=0.99286X+0.00152（Y 為吸光度，X為亞硝酸鹽濃度），相關(guān)系數(shù)為0.99877。

2.超聲萃取-重氮偶合光度法準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

采用超聲萃取-重氮偶合光度法對(duì)已知質(zhì)量濃度為0.10 μg/mL 的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行20 次測(cè)定，其平均值為0.0971 μg/mL，偏倚為-0.0029 μg/mL，說(shuō)明本方法具有良好的準(zhǔn)確度，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

同時(shí)，隨機(jī)選取同一樣品6，分別采用超聲萃取-重氮偶合光度法進(jìn)行20 次亞硝酸鹽的提取檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)計(jì)算，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1320%，說(shuō)明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

3.樣品亞硝酸鹽含量的測(cè)定

采用超聲萃取-重氮偶合光度法和水浴提取-重氮偶合光度法進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)得出樣品中亞硝酸鹽的濃度，并根據(jù)前文公式計(jì)算出不同茶葉樣品中亞硝酸鹽的含量。提取檢測(cè)過(guò)程重復(fù)20 次，取平均值。兩種方法的測(cè)定結(jié)果（表3），無(wú)差異性。

三、討論

采用超聲萃取-重氮偶合光度法對(duì)已知質(zhì)量濃度為0.10 μg/mL 的亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行20 次測(cè)定的偏倚為-0.0029 μg/mL，說(shuō)明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。同時(shí)采用該方法對(duì)云南普洱茶樣本進(jìn)行20 次亞硝酸鹽提取檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.1320%，說(shuō)明該方法具有良好的重現(xiàn)性。通過(guò)超聲萃取-重氮偶合光度法20 次提取測(cè)定的鐵觀(guān)音、大紅袍、金駿眉、正山小種、安化黑茶、云南普洱茶樣品中的亞硝酸鹽含量平均值分別為0.17、0.50、1.17、1.50、3.87、4.53 mg/kg，水浴提取-重氮偶合光度法20次提取測(cè)定的亞硝酸鹽含量平均值分別為0.17、0.47、1.17、1.53、3.90、4.53 mg/kg。對(duì)比兩種方法所得數(shù)據(jù)，并無(wú)差異性。說(shuō)明超聲萃取-重氮偶合光度法與常規(guī)國(guó)標(biāo)方法——水浴提取-重氮偶合光度法的測(cè)定結(jié)果無(wú)差別，但超聲萃取-重氮偶合光度法測(cè)定發(fā)酵茶中亞硝酸鹽含量簡(jiǎn)便省時(shí)，速度快，且不需要加熱，適應(yīng)于批量測(cè)定[7]。該方法在蔬菜[4-5]、醬腌菜[8]等食品的亞硝酸鹽檢測(cè)中有過(guò)使用報(bào)道，且都達(dá)到了良好的檢測(cè)效果，但用于發(fā)酵茶中亞硝酸鹽的檢測(cè)未見(jiàn)報(bào)道，因此，超聲萃取-重氮偶合光度法測(cè)定茶葉樣品中的亞硝酸鹽含量可行。

表1 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)液準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

表2 準(zhǔn)確度測(cè)定結(jié)果

表3 樣品亞硝酸鹽濃度和含量比較

本實(shí)驗(yàn)采用亞鐵氰化鉀與乙酸鋅反應(yīng)生成的氰亞鐵酸鋅吸附茶中蛋白質(zhì)共沉淀，再經(jīng)定容、靜置、干過(guò)濾去除蛋白質(zhì)。

采取重氮偶合反應(yīng)法測(cè)定提取液中亞硝酸鹽含量，其原理是在弱酸條件下，亞硝酸鹽與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，生成的重氮鹽再與二鹽酸-1-萘乙二胺偶合生成紫紅色偶氮化合物[2,9]。

亞硝酸鹽傳統(tǒng)的提取和檢測(cè)方法大多用于蔬菜、肉制品、腌菜等樣本的檢測(cè)，其提取液的顏色較清澈，檢測(cè)過(guò)程中并沒(méi)有考慮色素的干擾問(wèn)題，即使脫色，大多是使用活性炭[4,10]。由于茶葉中含有多酚類(lèi)化合物和茶色素等特殊的成分[2]，所以不同提取液的顏色也深淺不一，這些色素的存在對(duì)吸光度有較大影響而干擾檢測(cè)結(jié)果。因此，用比色法測(cè)定茶葉中的亞硝酸鹽含量時(shí)，去除樣品濾液中色素的干擾十分重要。依據(jù)高海榮等[11]的報(bào)道，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在超聲萃取并凈化后的濾液中加入堿式乙酸鉛可以達(dá)到良好的脫色效果，優(yōu)于活性炭，并摸索出堿式乙酸鉛的加入量。凈化后的濾液經(jīng)堿式乙酸鉛脫色后，再采用重氮偶合光度法測(cè)定提取液中的亞硝酸鹽含量，提高了亞硝酸鹽測(cè)定的準(zhǔn)確度。該脫色處理方法原理在于堿式乙酸鉛在水溶液中能與黃酮類(lèi)化合物等水溶性色素生成難溶的鉛鹽或絡(luò)鹽沉淀，并通過(guò)在濾液中加入硫酸溶液除去過(guò)量堿式乙酸鉛，同時(shí)保證溶液在酸性的條件下完成重氮偶合顯色[2]。

本實(shí)驗(yàn)探索并建立了超聲萃取-重氮偶合光度法快速檢測(cè)茶葉中亞硝酸鹽含量的檢測(cè)方法，可為廠(chǎng)家改進(jìn)生產(chǎn)方法和行業(yè)人員快速檢測(cè)提供參考。